劉 韜，魏文燕，劉家星，汪開毓

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚病研究中心，四川成都611130；2.成都市農(nóng)林科學(xué)院，四川成都610000)

魯氏耶爾森菌(Yersinia ruckeri)主要引起魚類的腸炎紅嘴病(ERM)，該病是一種重要的水生動物疾病，最早在1966年美國愛德荷州的養(yǎng)殖虹鱒魚(Rainbow trout/Oncorhynchus mykiss)中暴發(fā)[1]， 隨 后傳至歐洲。目前該病主要在英國和歐洲大陸之間傳播，宿主一般為在淡、海水中的野生鮭魚和養(yǎng)殖鮭魚[2]。然而自ERM 首次報道以來，其宿主范圍和地理分布均在逐漸擴大。此外，ERM 存在水平傳播的威脅，無明顯癥狀的帶菌魚體和部分鳥類均可攜帶Y.ruckeri[3-4]。

本實驗室前期通過全基因組測序和比較基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)Y.ruckeri具有特異性的四型分泌系統(tǒng)(Type IV secretion system，T4SS)[1]。T4SS 是一種大分子傳遞裝置，進化自細菌的接合系統(tǒng)[5-6]。多數(shù)致病性胞內(nèi)菌利用其傳遞DNA 或毒性蛋白到宿主細胞內(nèi)，幫助其增殖和逃避宿主的免疫攻擊[6]。根據(jù)T4SS 結(jié)構(gòu)的不同將Y.ruckeri分為 IVA 型(T4ASS)和IVB 型(T4BSS)[7]。本研究分離的Y.ruckeriSC09 株的染色體中帶有virB2-virB11基因簇，屬于T4ASS。綜合上下游基因分析發(fā)現(xiàn)，該基因簇位于一個基因水平轉(zhuǎn)移的ICE (Integrative and conjugative element)元件內(nèi)部[8]。同時，本實驗室預(yù)測到位于ICE 中的mobBC基因是負責(zé)ICE 元件接合轉(zhuǎn)移的重要因子，可能對菌株T4SS 功能的發(fā)揮和菌株的毒性有重要影響。目前，關(guān)于Y.ruckeri致病機制的研究比較有限，而關(guān)于mobBC基因和ICE 的研究還未開展。因此，本研究通過建立Y.ruckeriSC09 無痕mobBC缺失株并初步研究其致病機制，旨在為進一步研究mobBC基因和ICE 元件在Y.ruckeri致病過程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料質(zhì)粒pLP12[9]和大腸桿菌β2163[10]購自廣州邁博生物科技有限公司；DH5α λpir 感受態(tài)細胞購自天根生化科技(北京)有限公司；魯氏耶爾森菌(Yersinia ruckeri)SC09 株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院魚病研究中心提供[1]。SPF 級雌性小鼠(25 g～30 g)購自成都達碩實驗動物有限公司；虹鱒魚(80 g～100 g)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚病研究中心提供；魯氏耶爾森菌(Yersinia ruckeri)SC09 株全菌多克隆抗體(兔)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚病研究中心提供。

1.2 主要試劑2×TSINGKE Master Mix 購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；DNA Marker 和DNA純化回收試劑盒均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；氯霉素、質(zhì)粒DNA 小量提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；酵母提取物(Yeast extract)、胰酪蛋白胨(Casein Tryptone)購自英國OXOID 公司；2,6 - 二氨基庚二酸(Diaminopimelic acid，DAP)、L- 阿拉伯糖購自北京索萊寶科技有限公司；細菌全基因組提取試劑盒、Goldview、瓊脂糖均購自天根生化科技(北京)有限公司；重組酶Exnase II購自Vazyme 公司；TTC 購自Sigma 公司。

1.3 引物設(shè)計參考GenBank 中Y.ruckeriSC09 株(NZ_CP025800)mobBC基因序列 (NJ56_12460)， 設(shè)計擴增mobBC基因左、右同源臂引物：mobBCMF1/MR1(上游，A)和mobBC-MF2/MR2(下游，B)，同時，參考mobBC上、下游基因序列設(shè)計引物mobBC-TF/TR 用于陽性缺失株Y.ruckeriΔmobBC檢測。引物pLP-UF/UR 用于重組載體pLP12-mobBC檢測(表 1)。

表1 本研究用到的引物Table 1 All the primers involved in this study

1.4 自殺載體pLP12-mobBC 的構(gòu)建與鑒定構(gòu)建mobBC基因的左右同源臂AB，將AB 克隆入pLP12構(gòu)建重組質(zhì)粒pLP12-mobBC(圖1)。具體操作如下：分別采用引物mobBC-MF1/mobBC-MR1 和mobBCMF2/mobBC-MR2，以提取的Y.ruckeri全基因組DNA 為模板進行PCR 擴增。擴增程序：98 ℃3 min；98 ℃ 10 s，56/58 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 7 min。DNA 回收試劑盒純化PCR 產(chǎn)物，獲得mobBC基因左、右同源臂的A、B 序列片段。以體積比1∶1 混合 A、B 片段作為模板進行自延伸：98 ℃ 1 min； 98 ℃ 10 s，68 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，7個循環(huán)；隨后采用引物mobBC-MF1/mobBC-MR2 進行左、右同源臂的融合 PCR 擴增：98 ℃ 10 s，56/58 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)，72 ℃ 7 min。擴增產(chǎn)物利用DNA 回收試劑盒純化，得到融合AB片段，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

利用重組酶Exnase II (ClonExpress II，Vazyme)，37 ℃ 孵育 30 min 后，將質(zhì)粒載體 pLP12 與 AB 融合片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α λpir，將轉(zhuǎn)化菌體涂布于20 μg/mL CM-LB 抗性固體培養(yǎng)基(氯霉素，Chloramphenicol)。挑取單個菌落，采用引物pLP-UF/pLP-UR 進行菌落PCR 驗證，篩選的陽性克隆菌擴大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒pLP12-mob-BC，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 pLP12-mobBC/β2163 供體菌構(gòu)建將 pLP12-mobBC電轉(zhuǎn)化常規(guī)方法制備的大腸桿菌β2163 感受態(tài)細胞。轉(zhuǎn)化條件：1.8 kV/cm，200 Ω，25 μF，電轉(zhuǎn)完成后加入1 mL 的DAP-LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃復(fù)蘇l h；取復(fù)蘇菌液 100 μL 涂布LB 平板(CM=20 μg/mL，DAP=0.3 mmol/L，0.3%D-葡萄糖)，37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取氯霉素抗性的陽性菌株并命名為pLP12-mobBC/β2163。

1.6 插入突變株、缺失突變株和回補株的構(gòu)建及鑒定將 pLP12-mobBC/β2163 與魯氏耶爾森菌 SC09株共培養(yǎng)并產(chǎn)生接合效應(yīng)，隨后在LB 平板(20 μg/mL CM+0.3 % D-葡萄糖)篩選發(fā)生第一次同源重組的插入突變的SC09 菌株。具體操作如下：將pLP12-mobBC/β2163 與Y.ruckeriSC09，分別過夜培養(yǎng)后，各取100 μL 菌液混合，離心棄上清，再加入10 μL新鮮LB 重懸并涂布DAP-LB 平板，30 ℃培養(yǎng)12 h。用1 mL LB 洗下所有菌體并取100 μL 涂布CM-LB平板。取平板上單菌落，以引物mobBC-MF1/mob-BC-MR2 進行菌落PCR 鑒定。將正確的插入突變株命名為pLP12-mobBC/SC09。

將 pLP12-mobBC/SC09 在 LB 平 板 (0.4 % L- 阿拉伯糖)進行篩選，得到發(fā)生第二次同源重組的mobBC基因缺失株。具體操作如下：將pLP12-mob-BC/SC09 接種LB 液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)2 h，取100 μL 菌液涂布 0.02 % L- 阿拉伯糖的 LB 平板，37 ℃培養(yǎng)12 h；取平板上單菌落，擴大培養(yǎng)后提取其全基因組DNA，以引物mobBC-TF/mobBC-TR 進行PCR 擴增，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定。將鑒定正確的無痕突變株命名為Y.ruckeriΔmobBC，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本研究針對mobBC基因的敲除策略如圖1 所示。

圖1 魯氏耶爾森菌SC09 mobBC 基因的缺失策略Fig.1 The strategy of mobBC gene knockout in Y.ruckeri SC09

同時，參考Luo P 等[9]的方法，利用pBAD33cmmobBC載體以接合轉(zhuǎn)移的形式回補SC09ΔmobBC菌株，并以阿拉伯糖誘導(dǎo)mobBC基因表達，同上經(jīng)PCR 鑒定并測序后得到回補株，命名為Y.ruckeriΔmobBC+pMobBC。

1.7 菌體電鏡學(xué)形態(tài)觀察和生長曲線測定將培養(yǎng)后的野生型Y.ruckeri和Y.ruckeriΔmobBCPBS 洗滌8 次，0.5 %戊二醛固定，送成都里來生物科技有限公司進行掃描電鏡和透射電鏡觀察。

取對數(shù)生長期的野生型Y.ruckeri和Y.ruckeriΔmobBC、回補株Y.ruckeriΔmobBC+pMobBC 分別培養(yǎng)至OD600nm值為0.1，隨后于37 ℃振蕩培養(yǎng)，每隔2 h 定時取樣于分光光度計上測定OD600nm值，并繪制菌株生長曲線，比較三者生長特性。

1.8 缺失株感染實驗將對數(shù)生長期的Y.ruckeri和Y.ruckeriΔmobBC分別以 3×107cfu 的劑量經(jīng)肌肉接種SPF 小鼠，每組30 只；將大腸桿菌DH5α 以同樣的方法感染30 只小鼠作為陰性對照。記錄小鼠死亡情況，并利用GraphPad Prism version 8.0 軟件進行小鼠生存曲線分析和繪制。

在小鼠感染實驗基礎(chǔ)上，進一步驗證菌株在虹鱒魚體內(nèi)的毒性。取對數(shù)生長期野生型Y.ruckeri和Y.ruckeriΔmobBC及Y.ruckeriΔmobBC+pMobBC 回補株分別以腹腔注射的方式(劑量：5×107cfu)接種隨機分組的30 條虹鱒魚，記錄魚死亡情況，并利用GraphPad Prism version 8.0 軟件進行虹鱒魚生存曲線分析。同時無菌采集各組死亡虹鱒魚的肝臟、脾臟和腎臟各50 mg 分別勻漿后，10 倍稀釋5 次，利用平板技術(shù)法在含有TTC 的營養(yǎng)瓊脂的平板上進行細菌計數(shù)，統(tǒng)計各臟器細菌感染數(shù)量。同樣方法采集感染中期(感染后48 h)虹鱒魚腎臟(細菌感染魚類的主要靶器官)制備常規(guī)石蠟切片和HE 染色，觀察，拍照，利用純化的兔抗Y.ruckeri多克隆抗體，利用免疫組織化學(xué)方法對虹鱒魚的腎臟石蠟切片進行細菌感染分布的研究，進一步確認不同菌株的感染強度。

2 結(jié) 果

2.1 mobBC 基因同源臂構(gòu)建采用引物mobBCMF1/mobBC-MR1 擴增得mobBC基因A 片段，得到545 bp 目的片段；采用引物mobBC-MF2/mobBCMR2 擴增得mobBC基因 B 片段，得到504 bp 目的片段。以上述A、B 片段為模板，進行融合PCR 擴增，AB 片段采用膠回收DNA 純化試劑盒純化，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示融合AB 片段長1 004 bp，與預(yù)期相符(圖2)。結(jié)果表明，同源臂正確構(gòu)建。

圖2 mobBC 同源臂構(gòu)建Fig.2 mobBC homologous arms

2.2 pLP12-mobBC/β2163 供菌體的構(gòu)建利用引物pLP-UF/pLP-UR PCR 鑒定，結(jié)果顯示正確克隆得到 1 213 bp 的 PCR 產(chǎn)物(圖3)，空載體為 260 bp 產(chǎn)物，表明 pLP12-mobBC已轉(zhuǎn)化 DH5α λpir。擴大培養(yǎng)陽性克隆，提取質(zhì)粒pLP12-mobBC，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌β2163，涂布LB 平板，挑陽性克隆，利用上述PCR 鑒定，結(jié)果顯示得到含質(zhì)粒pLP12-mobBC的pLP12-mobBC/β2163。以上結(jié)果表明 pLP12-mobBC載體和供體菌pLP12-mobBC/β2163正確構(gòu)建。

2.3 插入突變株的構(gòu)建挑取篩選平板上單克隆并純化，進行菌落PCR 鑒定，結(jié)果顯示，野生株擴增的到3 483 bp 片段，插入突變產(chǎn)生965 bp 片段(圖4)。一次同源重組未刪除野生株染色體序列，所以插入突變株仍能檢測到3 483 bp 的片段，但野生株卻無965 bp 的片段(圖4)。表明插入突變株pLP12-mobBC/SC09 正確構(gòu)建。

圖3 pLP12-mobBC 質(zhì)粒構(gòu)建鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of recombination plasmid pLP12-mobBC

圖4 插入突變株P(guān)CR 檢測結(jié)果Fig.4 Identification of insertional mutants

2.4 缺失突變株構(gòu)建取插入突變克隆進行二次同源重組，挑取平板上的克隆，以引物mobBC-TF/mobBC-TR 進行檢測，并測序驗證比對，結(jié)果顯示正確的缺失突變克隆擴增得到1 230 bp 片段，而野生型菌株及回補株(圖略)擴增片段長3 748 bp (圖5)。表明mobBC無痕缺失突變株Y.ruckeriΔmobBC正確構(gòu)建。

圖5 缺失株P(guān)CR 檢測結(jié)果Fig.5 Identification of deletion mutants by PCR

2.5 菌體電鏡觀察利用透射電鏡進行觀察，可見缺失株和野生型菌株在菌體形態(tài)上未表現(xiàn)出明顯差異(圖6)，表明mobBC基因與Y.ruckeri菌體結(jié)構(gòu)無明顯相關(guān)性。

圖6 魯氏耶爾森菌野生株與缺失突變株的電子顯微鏡照片F(xiàn)ig.6 Electron microscope of wild type Y.ruckeri and Y.ruckeri ΔmobBC

2.6 細菌生長曲線測定取對數(shù)生長期的野生型Y.ruckeri和Y.ruckeriΔmobBC及回補株Y.ruckeriΔmobBC+pMobBC 分別培養(yǎng)，測定各時間點OD600nm值，繪制生長曲線，結(jié)果顯示，在18 h 的培養(yǎng)過程中，Y.ruckeriΔmobBC生長性能始終低于野生型菌株，而Y.ruckeriΔmobBC+pMobBC 回補株的生存曲線與野生菌株接近，且分光光度值也始終高于缺失株(圖7)。表明mobBC基因缺失對菌株的增殖生長有較大影響。

圖7 Y.ruckeri 野生型、缺失株Y.ruckeriΔmobBC及回補株的生長曲線Fig.7 Growth curve of wild type Y.ruckeri, deletion mutants and complemented strains

2.7 小鼠感染試驗結(jié)果為了初步了解缺失株Y.ruckeriΔmobBC在生物體內(nèi)毒性的變化，本研究進行了小鼠的急性感染實驗。結(jié)果顯示，感染野生型Y.ruckeri后所有小鼠在第7 d 全部死亡，而感染Y.ruckeriΔmobBC的小鼠約在第 14 d 全部死亡。大腸桿菌的感染基本不會在14 d 內(nèi)造成小鼠死亡。同時，生存曲線分析顯示感染Y.ruckeriΔmobBC和感染野生型Y.ruckeri菌株之間存在顯著差異(p＜0.01；**)(圖8)。以上結(jié)果表明，Y.ruckeriΔmobBC對模式小鼠仍然存在毒性，但是其毒性明顯弱于野生型菌株。這表明mobBC基因可能是Y.ruckeri潛在的毒力因子。

2.8 虹鱒魚感染試驗結(jié)果為進一步驗證Y.ruckeriΔmobBC在易感魚類的毒性變化，將野生型菌株和Y.ruckeriΔmobBC， 以及回補株Y.ruckeriΔmob-BC+pMobBC 分別腹腔感染虹鱒魚。結(jié)果顯示。感染野生型Y.ruckeri后所有虹鱒魚在第64 h 全部死亡，而感染Y.ruckeriΔmobBC的虹鱒魚在整個實驗周期(96 h)的后期(87 h～96 h)才開始出現(xiàn)明顯死亡。同時，生存曲線分析顯示感染Y.ruckeriΔmobBC和感染野生型Y.ruckeri菌株的虹鱒魚之間存在顯著差異(p＜0.01；**)，而Y.ruckeriΔmobBC+pMobBC 回補株與野生型菌株感染虹鱒魚后其生存曲線相似，無顯著性差異，但與缺失株Y.ruckeriΔmobBC感染虹鱒魚的生存曲線存在顯著差異(p＜0.01；**)。以上結(jié)果表明，急性感染實驗中Y.ruckeriΔmobBC對易感魚類仍然存在較弱的毒性，但其毒性強度明顯低于野生型菌株(圖9)。這進一步表明mobBC基因可能是Y.ruckeri潛在的毒力因子。

圖8 野生株與Y.ruckeriΔmobBC 感染模式小鼠生存曲線分析Fig.8 Survival curve analysis of Y.ruckeri acute infection in mice

圖9 野生株與Y.ruckeriΔmobBC 感染虹鱒魚生存曲線分析Fig.9 Survival curve analysis of Y.ruckeri acute infection in rainbow trout

為進一步充分驗證Y.ruckeriΔmobBC在易感魚類上的毒性強度減弱的趨勢，將上述急性感染魚體(分別取15 條魚)的重要組織器官(肝臟、脾臟和腎臟)分離勻漿后進行組織內(nèi)感染細菌平板計數(shù)，結(jié)果顯示，各組織中Y.ruckeriSC09ΔmobBC感染的細菌數(shù)量均低于野生型菌株，但是肝臟和脾臟總體細菌感染量(103cfu～104cfu)均低于腎臟組織的細菌感染數(shù)量(105cfu)(圖10)。且ΔmobBC感染與野生型菌株感染和Y.ruckeriΔmobBC+pMobBC 回補株感染多器官之間細菌計數(shù)結(jié)果均存在顯著差異(p＜0.01；**)。表明腎臟組織可能是菌株感染的重要靶器官。

圖10 虹鱒魚各組織感染細菌的平板計數(shù)Fig.10 The bacterial load in the tissues of rainbow trout

進一步對急性感染虹鱒魚(感染后48 h)的腎臟組織進行常規(guī)組織病理學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)實驗，結(jié)果顯示，感染野生型菌株虹鱒魚的腎臟組織出現(xiàn)明顯的腎小管透明滴狀變，滴狀物大小不等、圓形、半透明、紅染(圖11A)；同時，免疫組化分析中感染野生型菌株虹鱒魚的腎臟組織中存在大量陽性信號(圖11C 箭頭所示)。感染Y.ruckeriΔmobBC的虹鱒魚腎臟組織結(jié)構(gòu)未見明顯病理變化(圖11B)，且免疫組化分析中未見有明顯陽性信號(圖11D)。表明Y.ruckeriΔmobBC感染虹鱒魚48 h 內(nèi)，其感染靶器官(腎臟)的感染強度明顯低于野生型菌株。進一步表明mobBC基因的缺失會導(dǎo)致菌株毒性降低。

圖11 野生株與Y.ruckeriΔmobBC 感染虹鱒魚的腎臟組織病理和免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果Fig.11 Histopathology and immunohistochemistry of infected rainbow trout kidney during Y.ruckeri acute infection

3 討 論

目前對于mobBC基因的研究，尤其是其對菌株毒性的影響的研究還較薄弱。為了解mobBC基因?qū).ruckeri的毒性影響，本研究通過無痕基因缺失的方法獲得了缺失株Y.ruckeriΔmobBC。研究發(fā)現(xiàn)，在外部充足營養(yǎng)條件下，Y.ruckeriΔmobBC與野生型菌株相比，雖然外觀超微結(jié)構(gòu)變化并不顯著，但是表現(xiàn)出較弱的菌株增殖力，且還表現(xiàn)出對模式小鼠和虹鱒魚明顯減弱的毒性。尤其在腎臟等靶器官感染過程中，Y.ruckeriΔmobBC對組織的感染能力和引起的組織損傷程度均明顯低于野生型菌株。由此，推測mobBC基因缺失雖然只是菌株基因組層面的變化，不會導(dǎo)致細菌外形結(jié)構(gòu)改變，但將導(dǎo)致菌株復(fù)制能力下降，從而降低菌株在宿主體內(nèi)的毒性。菌株復(fù)制和增殖力的下降可能是菌株毒性下降的重要標(biāo)志。在后期的菌株毒性研究中，可把與菌株增殖力相關(guān)的基因也納入毒性基因的考量范疇，這將增加對菌株毒性研究的深度。mobBC基因缺失也為后期對該基因和SC09 株的T4SS 的功能性探索奠定了基礎(chǔ)。

過去，基于sacB基因的反向篩選一般是原核生物基因缺失策略首選方案[11]，但sacB基因編碼的SacB 蛋白活性卻對培養(yǎng)基中的NaCl 敏感，而培養(yǎng)基中NaCl 是必要添加物[12]。SacB 活性降低會導(dǎo)致篩選正確突變株的成功率極大降低。因此，缺少合適的反向篩選標(biāo)記是細菌基因編輯面臨的主要障礙。2007年，Roux 等利用基于ccdB基因的自殺載體構(gòu)建了vsm 基因缺失的燦爛弧菌[13]。但源自大腸桿菌F 質(zhì)粒的CcdB 蛋白的性未必對所有細菌有效，因為CcdB 的活性是失活細菌的GyrA (DNA 促旋酶亞基)[14]，而細菌之間的GyrA 蛋白構(gòu)象存在差異，導(dǎo)致CcdB 活性失效。2015年，Peng Luo 等探索了大腸桿菌LP79 中來自擬態(tài)弧菌接合轉(zhuǎn)移的MGIV-mi1 基因島中的vmi480 基因和vmi470 基因的功能[9]。vmi480 和vmi470 組成了有獨立啟動子的操縱子，結(jié)構(gòu)類似于 TA (toxin-antitoxin)系統(tǒng)[15-16]。Peng Luo等試圖單獨缺失vmi470，未果，而缺失vmi480 或者將vmi470 和毗鄰的vmi480 一起缺失卻獲得成功[9]。進一步研究發(fā)現(xiàn)單獨表達vmi480 對細菌細胞致死，而致死效應(yīng)在 vmi470 和vmi480 共表達時消除[9]。Vmi480 對大腸桿菌表現(xiàn)出強致死性，表明雖然毒性蛋白來自于弧菌，但它對各種來源的細菌均產(chǎn)生毒性作用[17-19]。另一方面，vmi470 和vmi480 只存在少數(shù)弧菌中[20]，因此vmi480 可作為一種新反向篩選標(biāo)記應(yīng)用于細菌基因缺失中。本研究中基于vmi480 基因的自殺質(zhì)粒pLP12 和β2163 高效接合系統(tǒng)首次在Y.ruckeri中缺失了T4SS 的核心基因mobBC，獲得了無抗生素標(biāo)記的Y.ruckeri的mobBC基因無痕缺失突變株。因此，本實驗同時表明vmi480 可以應(yīng)用于魯氏耶爾森氏菌基因編輯中的反向篩選。

綜上所述，本文首次研究了Y.ruckeriSC09 的mobBC基因的毒性影響，為該病原菌的毒力研究增加了新的基礎(chǔ)。同時也為vmi480 在魯氏耶爾森氏菌研究中的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。