趙九洲，胡 瀟，李 丹，李財(cái)源，文翼平

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130)

大熊貓(Ailuropoda melanoleuca)是我國(guó)特有的瀕危物種，截至2013年底，全國(guó)野生大熊貓種群數(shù)量達(dá)1 864 只，圈養(yǎng)大熊貓種群數(shù)量達(dá)到375 只，與之前的調(diào)查相比，野生及圈養(yǎng)大熊貓種群數(shù)量均穩(wěn)定增長(zhǎng)[1]。盡管這表明中國(guó)政府和其它相關(guān)單位一直在努力保護(hù)和增加大熊貓的數(shù)量，但傳染病和寄生蟲(chóng)病仍然威脅著大熊貓的生存。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)有大熊貓感染病毒及寄生蟲(chóng)后發(fā)病乃至死亡的報(bào)道。胡貴學(xué)等首次報(bào)道大熊貓感染犬瘟熱病毒(CDV)致死性感染[2]。鄔捷等對(duì)成都、重慶兩地動(dòng)物園的大熊貓進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，首次證實(shí)大熊貓能夠自然感染犬細(xì)小病毒(CPV)[3]。王成東等首次從成都大熊貓繁育研究基地多只大熊貓幼仔的腹瀉糞便中分離獲得病毒粒子，并鑒定該病毒為輪狀病毒[4]。一些在犬科動(dòng)物中發(fā)生與流行的蠕蟲(chóng)病也對(duì)大熊貓種群構(gòu)成潛在威脅[5-8]。然而，由于野生大熊貓的相關(guān)樣品采集存在很多障礙，想要做到實(shí)時(shí)監(jiān)控大熊貓群體內(nèi)感染疫病的流行情況十分困難。因此，做好傳染源的控制工作對(duì)預(yù)防大熊貓相關(guān)疾病的發(fā)生具有重要的意義。在栗子坪大熊貓自然保護(hù)區(qū)，人類的居住地與保護(hù)區(qū)交錯(cuò)，家犬在保護(hù)區(qū)周邊隨處可見(jiàn)，增加了這些疾病傳播的可能性。本實(shí)驗(yàn)分別利用間接ELISA 檢測(cè)法及飽和氯化鈉浮選法對(duì)4 種犬常見(jiàn)病毒和蠕蟲(chóng)感染情況進(jìn)行調(diào)查，為更全面、更完善地做好野生大熊貓以及放歸大熊貓的疾病防控工作提供流行病學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源 采自 2016年12月～2017年12月栗子坪自然保護(hù)區(qū)周邊6 個(gè)行政村(大興、公益、聯(lián)合、孟獲、竹馬和紫馬)172 份犬血樣以及3 個(gè)行政村(公益、竹馬和紫馬)66 份犬糞樣。

1.2 主要試劑 CDV、CPV、狂犬病毒(RV)、犬輪狀病毒(CRV)ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自CUSABIO 公司。

1.3 犬的飼養(yǎng)狀態(tài)及體型統(tǒng)計(jì) 2016年12月～2017年12月選取栗子坪大熊貓自然保護(hù)區(qū)周邊距離保護(hù)區(qū)較近的6 個(gè)行政村，通過(guò)詢問(wèn)、實(shí)地走訪調(diào)查等方式對(duì)養(yǎng)狗村戶了解家犬飼養(yǎng)狀態(tài)，利用卷尺、體重秤測(cè)量犬的身長(zhǎng)體重并記錄。

1.4 犬血樣的間接ELISA 抗體檢測(cè) 按照各病原ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)采集的172份犬血樣的CPV、CDV、CRV、RV 抗體。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)各病原的陽(yáng)性率、混合感染、感染日齡、感染季節(jié)。

1.5 犬糞樣中蠕蟲(chóng)的檢測(cè) 采用飽和氯化鈉浮選法結(jié)合鏡檢檢測(cè)犬糞樣中蠕蟲(chóng)種類。

1.6 犬糞樣中蠕蟲(chóng)感染強(qiáng)度的檢測(cè) 取采集到的新鮮糞樣少許，編號(hào)，將糞便加入適量飽和食鹽水充分混勻，用兩層紗布過(guò)濾，3 000 r/min 離心3 min，用接種環(huán)沾取表面液膜，涂布于載玻片上，加蓋玻片，鏡檢。判定標(biāo)準(zhǔn)：每張涂片中，同一種蟲(chóng)卵1 ～3 個(gè) 為 “ +”， 4 ～7 個(gè) 為 “ ++”， 8 ～11 個(gè) 為“+++”，12 個(gè)以上為“++++”。根據(jù)寄生蟲(chóng)圖譜和有關(guān)資料對(duì)蟲(chóng)卵和卵囊進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 犬的飼養(yǎng)狀態(tài)及體型統(tǒng)計(jì)結(jié)果 對(duì)保護(hù)區(qū)周邊6 個(gè)行政村的368 只家養(yǎng)犬進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)，調(diào)查結(jié)果顯示，63.9 % (235/368)的犬是自由散養(yǎng)狀態(tài)，36.1 % (133/368)的犬活動(dòng)受限，24.5 % (90/368)的犬為超小型犬(＜4 kg，＜25 cm)，29.6 % (109/368)的犬為小型犬(5 kg～10 kg，26 cm～40 cm)，42.2 %(155/368)的犬為中型犬(11 kg～30 kg，41 cm～60 cm)，3.7 % (14/368)的犬為大型犬(31 kg～40 kg，61 cm～70 cm)。結(jié)果表明，保護(hù)區(qū)周邊村戶多數(shù)家養(yǎng)犬呈自由散養(yǎng)狀態(tài)，且以具有一定移行能力的中小型犬類為主(71.8 %) (表1)。栗子坪大熊貓自然保護(hù)區(qū)處于本實(shí)驗(yàn)調(diào)查的6 個(gè)行政村犬的活動(dòng)范圍內(nèi)，通過(guò)問(wèn)詢，了解到該區(qū)域家養(yǎng)犬大多未做常規(guī)免疫，而據(jù)保護(hù)區(qū)工作人員介紹，保護(hù)區(qū)內(nèi)?？梢?jiàn)犬的排泄物及腳印。以上調(diào)查結(jié)果可證明有相當(dāng)數(shù)量的家養(yǎng)散放犬進(jìn)入保護(hù)區(qū)內(nèi)，且存在傳播病原的可能性。

2.2 犬血樣中幾種病毒抗體的間接ELISA 檢測(cè)結(jié)果 采用間接ELISA 方法，對(duì)研究區(qū)域內(nèi)采集到的172 份犬血樣進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，21 %的犬至少有一種病毒抗體呈陽(yáng)性，其中CDV、CPV、RV 和CRV 抗體陽(yáng)性率分別為4.7 % (8/172)、3.5 %(6/172)、12.8 % (24/172)、3.5 % (6/172)。由于本次流行病學(xué)調(diào)查位于大熊貓自然保護(hù)區(qū)周邊區(qū)域，具有特殊的地域性，因此保護(hù)區(qū)所在的相關(guān)疫病的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)具有重要的參考意義。RV 抗體陽(yáng)性率低于侯巍等報(bào)道[9]，CDV、CPV 抗體陽(yáng)性率明顯低于張昕[10]、陳珍容[11]所報(bào)道，以上報(bào)道主要是城市地區(qū)家養(yǎng)犬的相關(guān)流行病學(xué)數(shù)據(jù)，而本次檢測(cè)對(duì)象為鄉(xiāng)村家養(yǎng)犬，推測(cè)由于檢測(cè)區(qū)域疫苗接種免疫普及程度不同導(dǎo)致結(jié)果差異。

2.3 犬血樣中病毒混合感染情況統(tǒng)計(jì) 對(duì)檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的44 份血樣進(jìn)行CDV、CPV、CRV、RV 混合感染情況的統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，RV 與CDV 混合感染率為9.1 % (4/44)，其與CPV 混合感染率為9.1 %(4/44)，其與CRV 混合感染率為4.5 % (2/44)，CDV與CRV 混合感染率為6.8 % (3/44)，未檢測(cè)出CPV與CDV、CPV 與CRV 混合感染情況。未檢測(cè)有趙戰(zhàn)勤[12]、諸明濤[13]等報(bào)道的CDV 與CPV 的混合感染，可能與樣本數(shù)量及地域差別有關(guān)。因此，該地區(qū)疾病防控重心在于控制RV 的感染與流行。

2.4 抗體陽(yáng)性犬年齡分布統(tǒng)計(jì) 對(duì)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的犬進(jìn)行年齡統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，CDV、CPV、CRV主要感染1 歲以下的犬，比例均占50 %以上。各個(gè)年齡段的犬均存在不同程度RV 感染，且2 歲以上的犬居多(表1)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果與張昕等人的報(bào)道基本一致[10-11,14-15]。降低相關(guān)傳染病流行風(fēng)險(xiǎn)的有效方式在于做好犬的常規(guī)免疫工作，尤其需要重視1 歲以下犬的免疫情況。

表1 犬血樣中抗體陽(yáng)性犬年齡分布統(tǒng)計(jì)病毒種類Virus types 1～12月齡陽(yáng)性數(shù)Positive No.at the age of 1-12 months Positive No.at the age of 1-2 years Positive No.above 2 years old(%)Positive rates above 2 years old CDV CPV CRV RV 6545 Positive rates at the age of 1-12 months 75.0 83.3 66.7 20.8 2117 Positive rates at the age of 1-2 years 25.0 16.7 16.7 29.2 0011 2 00 16.7 50.0

2.5 感染犬各病原的季節(jié)分布統(tǒng)計(jì) 各個(gè)季節(jié)的抗體陽(yáng)性率顯示，CDV 春、秋、冬季感染率較高，占總比例的87.5 %；CPV 在春、秋季感染率較高，分別為50 %和33.3 %；CRV 在冬季感染率較高，為66.7 %；以上3 種病毒夏季感染率較低，分別為12.5 %、0、0；而RV 無(wú)明顯的季節(jié)性(表2)。表明在氣候寒冷、溫差較大的季節(jié)相關(guān)傳染病發(fā)生的幾率較高。

2.6 犬糞樣中蠕蟲(chóng)感染檢測(cè)結(jié)果 本研究檢測(cè)了66 份犬糞樣，共檢出7 種蠕蟲(chóng)，其中犬鉤蟲(chóng)的感染率為21%(14/66)，浣熊拜林蛔線蟲(chóng)的感染率為6.1%(4/660)，圓線蟲(chóng)的感染率為9.1 % (6/66)，犬復(fù)孔絳蟲(chóng)的感染率為12 % (8/66)，獅弓首蛔蟲(chóng)的感染率為3 % (2/66)，犬弓首蛔蟲(chóng)的感染率為46 % (30/66)，犬鞭蟲(chóng)的感染率為12 % (8/66)。犬鉤蟲(chóng)21 % (n=14)和犬弓首蛔蟲(chóng)46 % (n=300)，均存在較高感染率。檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)大熊貓可能產(chǎn)生影響的犬鉤蟲(chóng)需要引起重視，保護(hù)區(qū)周邊區(qū)域家養(yǎng)犬的驅(qū)蟲(chóng)措施應(yīng)更加完善。而胡霖等采集了對(duì)雅安市146 只犬糞便，結(jié)果顯示以球蟲(chóng)和賈第蟲(chóng)感染為主，與本實(shí)驗(yàn)相關(guān)的蠕蟲(chóng)感染率基本一致[16]，存在的部分差異推測(cè)是調(diào)查地域不同以及實(shí)驗(yàn)方法的差別導(dǎo)致。

2.7 犬糞樣中蠕蟲(chóng)感染強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果 本研究在對(duì)66 份犬的糞便樣本進(jìn)行蠕蟲(chóng)感染情況檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同類群的蠕蟲(chóng)感染強(qiáng)度差異很大，但感染的平均強(qiáng)度均在每10 克糞便50 個(gè)蟲(chóng)卵以下。犬鉤蟲(chóng)、犬復(fù)孔絳蟲(chóng)以及犬弓首蛔蟲(chóng)感染強(qiáng)度較高(表3)。盡管蠕蟲(chóng)的感染種類較多樣，但感染強(qiáng)度均不大，提前做好犬預(yù)防性驅(qū)蟲(chóng)工作可以有效地降低其體內(nèi)蠕蟲(chóng)病對(duì)大熊貓的潛在威脅。

表2 犬血樣中抗體陽(yáng)性犬季節(jié)分布統(tǒng)計(jì)病毒種類Virus types春季陽(yáng)性數(shù)(Positive NO in spring in summer in autumn in winter CDV CPV CRV RV 2315 in spring 25.0 50.0 16.7 41.7 1007 in summer 12.5 00 58.3 2216 in autumn 25.0 33.3 16.7 50.0 3146冬季陽(yáng)性率(%)Positive rate in winter 37.5 16.7 66.7 50.0

感染強(qiáng)度Infection intensity++++++++++Ancylostoma canium 29%43%14%14%Baylisascaris transfuga 50%0 50%0 Strongyloides 67%0 33%0 Dipylidium caninum 0 25%50%25%Toxascaris leonine 0 100%犬鞭蟲(chóng)Trichuris vulpis 100%00 Toxocara canis 20%40%20%20%000注：同一種蟲(chóng)卵1-3 個(gè)為“+”，4-7 個(gè)為“++”，8-11 個(gè)為“+++”，12 個(gè)以上為“++++”。Note: The same eggs for "+" 1-3 eggs,4-7 for "++",8-11 is "+++",more than 12 to "++++".

綜上所述，大熊貓?jiān)谝盎艢w后難以應(yīng)對(duì)自然環(huán)境的變化且不具備較強(qiáng)的抵抗疾病能力[17]。與此同時(shí)，多數(shù)保護(hù)區(qū)仍存在管理混亂，工作隨意性大的問(wèn)題，使得保護(hù)區(qū)內(nèi)的人口分布不合理，沒(méi)有為大熊貓的繁衍生息提供廣闊的生存空間[18]。面對(duì)復(fù)雜的動(dòng)物疫病流行病學(xué)背景，以上因素均增加了大熊貓對(duì)敏感病原甚至跨物種疾病感染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，適時(shí)的進(jìn)行相應(yīng)區(qū)域流行病學(xué)調(diào)查，有助于全面掌握疫病流行情況，為相關(guān)疫病的綜合防控提供數(shù)據(jù)。與此同時(shí)，建議讓公眾知曉，未接種疫苗的犬可能會(huì)對(duì)當(dāng)?shù)匾吧鷦?dòng)物造成嚴(yán)重的危脅，繼而造成持續(xù)性不良影響。同時(shí)鼓勵(lì)基層政府及管理部門與村民合作，對(duì)區(qū)域內(nèi)家養(yǎng)犬進(jìn)行必需的驅(qū)蟲(chóng)和重要傳染病免疫工作，并鼓勵(lì)對(duì)犬的自愿絕育計(jì)劃，總體抑制犬?dāng)?shù)量，從根源上降低病毒病與蠕蟲(chóng)病對(duì)大熊貓生存健康的威脅。