梁君妮，尹偉力，謝 爽，劉 寧，段效輝，林 森

(煙臺海關(guān)技術(shù)中心，山東 煙臺 264000)

鯉春病毒血癥病毒(Spring viremia of carp virus，SVCV)屬水泡病毒屬(Vesiculovirus)，是一種彈狀病毒[1]，主要流行于歐洲、中東和俄羅斯，近幾年蔓延至美洲和亞洲[2-4]。SVCV 宿主范圍非常廣泛，四大淡水魚類均能被感染，其中最易感的為鯉科魚類，尤其仔魚，一旦感染死亡率可達(dá)70 %[5]。它可以引起魚類大規(guī)模暴發(fā)鯉春病毒血癥(SVC)，是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)必須通報(bào)的動物疾病。

SVCV 傳統(tǒng)的檢測方法是細(xì)胞培養(yǎng)分離法，但該方法費(fèi)時費(fèi)力。近年來檢測SVCV 的分子生物學(xué)方法被廣泛研究并應(yīng)用。其中重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase polymerase amplification，RPA)方法可以在25 ℃～42 ℃恒溫條件下20 min 內(nèi)快速完成核酸擴(kuò)增，無需昂貴的變溫儀器，反應(yīng)迅速，靈敏度高，擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過探針法熒光定量進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，也可以與側(cè)流層析試紙條、生物芯片、凝膠電泳等多種方法相結(jié)合進(jìn)行檢測[6-8]，適合現(xiàn)場快速檢測。本研究依據(jù)SVCV G 基因保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用RPA 技術(shù)建立一種簡便高效、特異性強(qiáng)、靈敏度高的SVCV 檢測方法，適用于設(shè)備簡單的基層實(shí)驗(yàn)室及現(xiàn)場檢測，是SVCV日常監(jiān)控及檢測的有效手段。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 SVCV 由本實(shí)驗(yàn)室保存。傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)、病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)、流行性造血器官壞死病毒(EHNV)和傳染性胰臟壞死病病毒(IPNV)均由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局提供。80 份臨床樣品，包括鯉魚、草魚、青魚、鳙魚、鰱魚的腎、脾、肝、肺、腦等組織及各品種魚苗，均采集自山東地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖場。RNA 提取試劑盒購自西安天隆科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒 DNA 抽提試劑盒、pMD18-T 載體、DL2000 Marker 均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 已登錄的SVCVG 蛋白基因(AY527273.1)保守序列，按照RPA 引物設(shè)計(jì)要求[9-10]設(shè)計(jì)引物：5'-GTATTTTGGGACGACTGG GAGTTAGATGGC-3'/5'-CATAATGAGGATGAGGGA TAATATCGGCTTG-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段為172 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 G 基因重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定 利用RNA 提取試劑盒提取SVCV RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，核酸蛋白分析儀測定cDNA 濃度。以該cDNA 為模板，參照紀(jì)鋒等設(shè)計(jì)的擴(kuò)增SVCV完整G 基因的引物[11]進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將PCR 產(chǎn)物回收并連接 pMD18-T 載體， 構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-G，陽性重組質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定。鑒定陽性后提取質(zhì)粒，測定重組質(zhì)粒濃度，計(jì)算拷貝數(shù)。

1.4 RPA 方法的優(yōu)化 建立50 μL RPA 反應(yīng)體系：向裝有重組酶及聚合酶的反應(yīng)管中加入25 μL 反應(yīng)緩沖液(2×)、上下游引物(5 μmol/L)各 4 μL 以及 2.0 μL模板DNA，雙蒸水補(bǔ)至總體積為47.5 μL 后充分混勻，加入2.5 μL 280 mmol/L 醋酸鎂溶液并混合均勻。本研究共設(shè)計(jì)5 個溫度梯度(25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、42 ℃)，確定最優(yōu)反應(yīng)溫度。同時設(shè)空白反應(yīng)管，放置于37 ℃金屬浴內(nèi)反應(yīng)20 min。反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物經(jīng)電泳分析確定最優(yōu)反應(yīng)溫度。

1.5 RPA 方法特異性試驗(yàn) 利用RNA 提取試劑盒提取SVCV、IHNV、EHNV、VHSV、IPNV 的RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 作為模板，利用建立的RPA 方法分別進(jìn)行檢測，對該方法的特異性進(jìn)行評價。

1.6 RPA 方法靈敏度試驗(yàn) 以倍比稀釋的重組質(zhì)粒 pMD18-G (105拷貝 /μL～100拷貝 /μL)作為模板，按照優(yōu)化后的條件進(jìn)行RPA 反應(yīng)，確定該方法的敏感性。同時參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《SN/T 1152-2002 鯉春病毒血癥病毒(SVCV)逆轉(zhuǎn)錄- 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RTPCR)檢測方法》[12]對上述重組質(zhì)粒進(jìn)行RT-PCR 檢測，比較兩種方法的檢測結(jié)果。

1.7 臨床樣品的檢測 對采集自養(yǎng)殖場的臨床成魚組織樣品及魚苗按常規(guī)方法處理后提取基因組，參照1.3 方法獲得cDNA，分別以其為模板利用建立的RPA 方法進(jìn)行檢測，同時利用RT-PCR 方法[12]檢測，比較二者結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 G 基因重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定 對構(gòu)建的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果顯示得到一條約1 500 bp 的目的片段，與預(yù)期相符(圖1)，表明正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD18-G。用核酸蛋白分析儀測定質(zhì)粒濃度并經(jīng)公式計(jì)算得出重組質(zhì)?？截悢?shù)為8.92×1010拷貝 /μL。

2.2 SVCV RPA 方法的建立 共設(shè)計(jì)5 個溫度梯度，以確定最優(yōu)反應(yīng)溫度，結(jié)果顯示擴(kuò)增溫度在25 ℃～42 ℃范圍內(nèi)均可擴(kuò)增出約170 bp 的特異性目的條帶，當(dāng)擴(kuò)增溫度為35 ℃、40 ℃、42 ℃時，擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)微弱的非特異性條帶，而擴(kuò)增溫度為30 ℃的特異性條帶比25 ℃更清晰明亮(圖2)，因此最終確定30 ℃為SVCV 的最優(yōu)擴(kuò)增溫度。

2.3 RPA 方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果 利用建立的RPA 方法對SVCV、IHNV、EHNV、VHSV、IPNV病毒的cDNA 進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示僅有SVCV 在約170 bp 處出現(xiàn)明顯的特異性條帶，其它4 種病毒均未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶(圖3)。表明建立的RPA 方法具有較強(qiáng)的特異性。

2.4 RPA 與PCR 方法靈敏度試驗(yàn)結(jié)果 以倍比稀釋的重組質(zhì)粒 pMD18-G (8.92×105拷貝 /μL～8.92×100拷貝 /μL)為模板，進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)，并與RT-PCR 方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示RPA 方法的檢測下限為89.2 拷貝/μL，高于RT-PCR 方法的檢測下限 8.92×102拷貝 /μL (圖4)，表明 RPA 方法比 RTPCR 方法具有更高的靈敏度。

2.5 臨床樣品的檢測 應(yīng)用已建立的RPA 方法和RT-PCR 方法對80 份臨床樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：RPA 方法與RT-PCR 方法檢測結(jié)果一致，共計(jì)13 份陽性樣品，但 RT-PCR 有 2 份弱陽性(表1)，表明RPA 方法可以有效的檢出RT-PCR 方法的弱陽性樣品，因此RPA 方法比RT-PCR 方法具有更高的臨床應(yīng)用價值。

表1 RPA 方法和RT-PCR 方法對臨床樣品檢測結(jié)果Sample types Number positive samples量f negative samples RPA鯉魚Cyprinus carpio草魚Ctenopharyngodon idellus青魚Mylopharyngodon piceus鰱魚Hypophthalmichthys molitrix鳙魚Aristichthys nobilis 25 RPA 19 RT-PCR 19 18 RT-PCR 6 (1 weakly positive)21616 143 (1 weakly positive)1111 131111 10 6 2 3 2 0 2 0 1010

3 討 論

鯉春病毒血癥作為農(nóng)業(yè)部規(guī)定的一類動物疫病，是口岸檢疫的一類檢疫對象。除常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)法，近些年很多專家學(xué)者建立了多種SVCV 的分子生物學(xué)檢測方法，但相比經(jīng)典核酸檢測技術(shù)，RPA 技術(shù)檢測耗時短，20 min 即可完成，在常溫恒溫下即可進(jìn)行，靈敏度高，結(jié)果讀取簡便、多樣化[13]。RPA 技術(shù)作為新興起的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，近幾年被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因、醫(yī)學(xué)病原菌、動物疫病病原等的快速檢測。鄧婷婷等建立了轉(zhuǎn)基因水稻中Cry1Ab/c基因的RPA 檢測方法，直接在37 ℃恒溫條件下快速檢測轉(zhuǎn)基因水稻中Cry1Ab/c 基因[14]；劉立兵等建立的豬細(xì)小病毒的RPA 快速檢測方法在38 ℃恒溫反應(yīng)30 min[15]。RPA 方法的最適溫度在25 ℃～42 ℃，本研究經(jīng)優(yōu)化確定30℃為最優(yōu)反應(yīng)溫度。

RPA 方法的核心是引物設(shè)計(jì)，但目前無專門的軟件可供使用。一是RPA 方法引物長度要在45 bp以內(nèi)，最佳長度為30 bp～35 bp，引物長度太短會降低與重組酶的結(jié)合率，影響擴(kuò)增速度，但是較長的引物設(shè)計(jì)時更易出現(xiàn)回文序列、連續(xù)重復(fù)序列以及發(fā)卡結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)難度增大。二是擴(kuò)增DNA 片段的選取，RPA 通常擴(kuò)增長度為80 bp～400 bp 才有較高的敏感性和特異性，且擴(kuò)增長度為100 bp～200 bp 效果最佳[16]。本研究基于SVCV 的G 基因保守序列設(shè)計(jì)引物，建立了SVCV 的RPA 快速檢測方法。

利用本研究建立的RPA 方法對山東地區(qū)養(yǎng)殖場采集的80 份臨床樣品進(jìn)行檢測，采集樣品涉及最易感染SVCV 的鯉魚、草魚、青魚、鰱魚、鳙魚等國內(nèi)主要養(yǎng)殖淡水魚類，其中鯉魚感染率最高(6/25)。將檢測結(jié)果與常規(guī)的RT-PCR 方法進(jìn)行比較，表明RPA 方法對于RT-PCR 方法的弱陽性樣品有較高的檢出率，且檢測結(jié)果與RT-PCR 方法完全一致，從而證明了RPA 方法的高靈敏度。而RT-PCR 方法檢出的弱陽性樣品濃度過低無法有效測序，因而不能作為病毒陽性結(jié)果確定的依據(jù)。

本研究建立的RPA 方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、反應(yīng)快速、操作簡便、成本低廉，是快速檢測SVCV 的有效手段，適用于基層養(yǎng)殖單位和口岸部門現(xiàn)場檢測，具有廣闊的應(yīng)用前景。