崔凌志，王子超，唐存亮，黃冠華*

高血壓發(fā)病率高，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，危害性大，是心血管疾病和全因死亡的重要危險(xiǎn)因素［1］。食用鹽過(guò)多是引起高血壓的重要因素之一，高鹽飲食會(huì)使鹽敏感性高血壓患者血壓明顯增高，而嚴(yán)格限制其鹽攝入量后，血壓會(huì)隨之下降［2］。芹菜葉既是一種食物，也是一種傳統(tǒng)藥物，具有降血壓作用［3］。然而，其具體降壓機(jī)制尚不清楚。有學(xué)者報(bào)道，芹菜葉的降壓作用與體內(nèi)鈉的降解及長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）-sONE 有關(guān)［4］。LncRNA-sONE 是來(lái)源于人內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）相反的DNA 鏈的一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位（nos3as），干擾抑制eNOS 的增加，而eNOS 基因T-786C 多態(tài)性與鈉的攝入量也有關(guān)［5-6］。eNOS 可催化內(nèi)皮細(xì)胞NO 生成，NO 有擴(kuò)張血管，增加血流量的作用，從而降低血壓［7-9］。因此，本課題組通過(guò)購(gòu)買自發(fā)性高血壓大鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，旨在探究芹菜葉降血壓的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究材料 2015 年9 月，購(gòu)買10 周齡、SPF 級(jí)、自發(fā)性高血壓大鼠48 只（雌雄各24 只，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），于溫度21～24 ℃，相對(duì)濕度45%～55%，12 h∶12 h 光暗周期下，正常飲食（0.25%的NaCl 飼料）飼養(yǎng)2 周。

1.2 主要試劑及儀器 兔抗鼠eNOS 多克隆抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體，大鼠抗小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體，NO 試劑盒，均購(gòu)于南京建成科技有限公司。qPCR 法檢測(cè)試劑盒購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司。尾動(dòng)脈無(wú)創(chuàng)血壓監(jiān)測(cè)儀購(gòu)于成都泰盟科技有限公司。

1.3 分組 飼養(yǎng)2 周后將大鼠隨機(jī)分為高鹽組、正常鹽組和高鹽芹菜葉組，每組16 只（雌雄各半）。高鹽組給予5.00%的NaCl 飼料飼養(yǎng)12 周；正常鹽組給予0.25%的NaCl 飼料飼養(yǎng)12 周；高鹽芹菜葉組先予5.00%的NaCl 飼料飼養(yǎng)8 周后，再予5.00%的NaCl 飼料+10.00%芹菜葉飼養(yǎng)4 周；此外，各組予以足量其他飲食。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 血壓和體質(zhì)量 采用尾袖法和體質(zhì)量刻度測(cè)量法，分別測(cè)量各組大鼠血壓和體質(zhì)量，2 周/次。

1.4.2 Western blotting 法檢測(cè)eNOS 蛋白表達(dá)水平 所有大鼠飼養(yǎng)14 周后，腹腔注射氯胺酮麻醉合劑（100 mg/ml；0.1 ml/100 g）后摘除腎臟。分離腎動(dòng)脈，剔除血管外組織、結(jié)締組織，于-70 ℃冰箱保存。取出凍存腎動(dòng)脈，在液氮中研磨，置入預(yù)冷組織勻漿，冰上裂解。制備蛋白樣品后，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)印，封閉。加入一抗兔抗鼠eNOS 多克隆抗體和二抗羊抗兔抗體孵育。Bio-Rad 凝聚圖像分析軟件分析，將各條帶積分光密度值分別與相應(yīng)的B-tubulin 條帶積分光密度值比對(duì)，以每次電泳的正常鹽組第1 個(gè)樣品蛋白條帶的積分光密度值為100%，其余樣品蛋白條帶與之比對(duì)，計(jì)算積分光密度值的百分比作為eNOS 蛋白表達(dá)水平。

1.4.3 qPCR 法 檢 測(cè)LncRNA-sONE 和eNOS mRNA 表達(dá)水平 將大鼠腎皮質(zhì)制成＜1 mm3切片，切碎的腎組織收集到50 ml 含Ⅱ型膠原酶和中性蛋白酶的離心管中， 37 ℃水浴攪拌30 min，加入DNaseI 后繼續(xù)攪拌30 min。 之后將該管置于冰上，加入預(yù)冷細(xì)胞勻漿遞質(zhì)5 ml，使懸液完全混合后，采用75 μmol 細(xì)胞過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾、離心，F(xiàn)icoll 密度梯度離心法分離遞質(zhì)并收集細(xì)胞。之后按照大鼠腎血管內(nèi)皮細(xì)胞分離說(shuō)明書進(jìn)行操作，直到分離出腎血管內(nèi)皮細(xì)胞，Trizol 冷凍保存。按照qPCR試劑盒說(shuō)明書采用Trizol 試劑從腎血管內(nèi)皮細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA，引物序列用于LncRNA-sONE 和eNOS mRNA 定量測(cè)量。采用2-ΔΔCt法確定特定靶基因RNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩組間比較采用成組t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組大鼠不同干預(yù)時(shí)間體質(zhì)量比較 3 組大鼠干預(yù)前、干預(yù)4 周體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；3 組大鼠干預(yù)8 周、12 周體質(zhì)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中高鹽組、高鹽芹菜葉組大鼠干預(yù)8周、12 周體質(zhì)量均低于正常鹽組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高鹽芹菜葉組和高鹽組干預(yù)8 周、12 周體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表1）。

2.2 3 組大鼠不同干預(yù)時(shí)間收縮壓比較 3 組大鼠干預(yù)前收縮壓比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；3 組大鼠干預(yù)4 周、8 周、12 周收縮壓比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中高鹽組、高鹽芹菜葉組大鼠干預(yù)4周、8 周、12 周收縮壓高于正常鹽組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高鹽芹菜葉組大鼠干預(yù)12 周收縮壓低于高鹽組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高鹽芹菜葉組和高鹽組干預(yù)4 周、8 周收縮壓比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表2）。

2.3 3 組不同性別大鼠干預(yù)12 周體質(zhì)量、收縮壓、eNOS 蛋白表達(dá)水平、LncRNA-sONE 表達(dá)水平、eNOS mRNA 表達(dá)水平比較 3 組不同性別大鼠干預(yù)12 周體質(zhì)量、收縮壓、eNOS 蛋白表達(dá)水平、LncRNA-sONE 表達(dá)水平、eNOS mRNA 表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，見表3～5）。

表1 3 組大鼠干預(yù)不同時(shí)間體質(zhì)量比較Table 1 Comparison of body weight of three groups of rats at different intervention weeks

表1 3 組大鼠干預(yù)不同時(shí)間體質(zhì)量比較Table 1 Comparison of body weight of three groups of rats at different intervention weeks

注：與正常鹽組比較，aP＜0.05

組別 只數(shù) 干預(yù)前 干預(yù)4 周 干預(yù)8 周 干預(yù)12 周正常鹽組 16 213.1±4.1 248.9±6.1 304.1±6.0 319.8±6.4高鹽組 16 214.1±4.7 249.3±5.8 302.3±6.4a 314.6±6.5a高鹽芹菜葉組 16 216.6±3.7 245.8±4.1 288.9±24.4a 311.2±13.5a F 值 2.962 2.094 4.894 3.361 P 值 0.062 0.135 0.012 0.044

表2 3 組大鼠干預(yù)不同時(shí)間收縮壓比較mm Hg）Table 2 Comparison of systolic blood pressure of three groups of rats at different intervention weeks

表2 3 組大鼠干預(yù)不同時(shí)間收縮壓比較mm Hg）Table 2 Comparison of systolic blood pressure of three groups of rats at different intervention weeks

注：與正常鹽組比較，aP＜0.05；與高鹽組比較，bP＜0.05；1 mm Hg =0.133 kPa

組別 只數(shù) 干預(yù)前 干預(yù)4 周 干預(yù)8 周 干預(yù)12 周正常鹽組 16 123±5 134±4 141±5 145±7高鹽組 16 122±5 139±6a 158±9a 168±9a高鹽芹菜葉組 16 120±7 141±6a 157±5a 153±6ab F 值 1.340 6.268 31.147 43.054 P 值 0.272 0.004 ＜0.001 ＜0.001

表3 正常鹽組不同性別大鼠干預(yù)12 周體質(zhì)量、收縮壓、eNOS 蛋白、LncRNA-sONE、eNOS mRNA 表達(dá)水平比較Table 3 Sex-specific comparison of body weight，systolic blood pressure，and expression levels of eNOS protein，LncRNA-sONE and eNOS mRNA in rats in control group at the 12th week of intervention

表3 正常鹽組不同性別大鼠干預(yù)12 周體質(zhì)量、收縮壓、eNOS 蛋白、LncRNA-sONE、eNOS mRNA 表達(dá)水平比較Table 3 Sex-specific comparison of body weight，systolic blood pressure，and expression levels of eNOS protein，LncRNA-sONE and eNOS mRNA in rats in control group at the 12th week of intervention

注：eNOS=內(nèi)皮型一氧化氮合酶，LncRNA=長(zhǎng)鏈非編碼RNA

性別 只數(shù) 體質(zhì)量（g）收縮壓（mm Hg） eNOS LncRNAsONE eNOS mRNA雄性 8 319.6±6.7 145±7 1.14±0.06 1.03±0.16 1.04±0.17雌性 8 320.0±6.5 146±8 1.15±0.08 1.05±0.04 1.07±0.13 t 值 -0.113 -0.211 -0.260 -0.357 -0.352 P 值 0.911 0.836 0.798 0.727 0.730

表4 高鹽組不同性別大鼠干預(yù)12 周體質(zhì)量、收縮壓、eNOS 蛋白、LncRNA-sONE、eNOS mRNA 表達(dá)水平比較Table 4 Sex-specific comparison of body weight，systolic blood pressure，and expression levels of eNOS protein，LncRNA-sONE and eNOS mRNA in rats in high salt group at the 12th week of intervention

表4 高鹽組不同性別大鼠干預(yù)12 周體質(zhì)量、收縮壓、eNOS 蛋白、LncRNA-sONE、eNOS mRNA 表達(dá)水平比較Table 4 Sex-specific comparison of body weight，systolic blood pressure，and expression levels of eNOS protein，LncRNA-sONE and eNOS mRNA in rats in high salt group at the 12th week of intervention

性別 只數(shù) 體質(zhì)量（g）收縮壓（mm Hg） eNOS LncRNAsONE eNOS mRNA雄性 8 314.4±7.6 168±10 0.66±0.08 1.43±0.15 1.62±0.23雌性 8 314.8±5.8 169±9 0.65±0.07 1.46±0.12 1.65±0.16 t 值 -0.111 -0.055 0.066 -0.444 -0.352 P 值 0.913 0.957 0.948 0.664 0.730

2.4 3 組大鼠干預(yù)12 周eNOS 蛋白表達(dá)水平、LncRNAsONE 表達(dá)水平、eNOS mRNA 表達(dá)水平比較 3 組大鼠干預(yù)12 周eNOS 蛋白表達(dá)水平、LncRNA-sONE 表達(dá)水平、eNOS mRNA 表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中高鹽組大鼠干預(yù)12 周eNOS 蛋白表達(dá)水平低于正常鹽組，LncRNA-sONE、eNOS mRNA 表達(dá)水平高于正常鹽組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高鹽芹菜葉組大鼠干預(yù)12 周eNOS 蛋白、eNOS mRNA表達(dá)水平高于正常鹽組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高鹽芹菜葉組與正常鹽組大鼠干預(yù)12 周LncRNA-sONE表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高鹽芹菜葉組大鼠干預(yù)12 周eNOS 蛋白、eNOS mRNA 表達(dá)水平高于高鹽組，LncRNA-sONE 表達(dá)水平低于高鹽組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表6）。

表5 高鹽芹菜葉組不同性別大鼠干預(yù)12 周體質(zhì)量、收縮壓、eNOS蛋白、LncRNA-sONE、eNOS mRNA 表達(dá)水平比較Table 5 Sex-specific comparison of body weight，systolic blood pressure，and expression levels of eNOS protein，LncRNA-sONE and eNOS mRNA in rats in high salt celery leaf group at the 12th week of intervention

表5 高鹽芹菜葉組不同性別大鼠干預(yù)12 周體質(zhì)量、收縮壓、eNOS蛋白、LncRNA-sONE、eNOS mRNA 表達(dá)水平比較Table 5 Sex-specific comparison of body weight，systolic blood pressure，and expression levels of eNOS protein，LncRNA-sONE and eNOS mRNA in rats in high salt celery leaf group at the 12th week of intervention

性別 只數(shù) 體質(zhì)量（g）收縮壓（mm Hg） eNOS LncRNAsONE eNOS mRNA雄性 8 315.2±12.9 152±4 1.41±0.12 1.01±0.15 2.56±0.21雌性 8 307.2±13.3 154±7 1.34±0.07 1.02±0.36 2.55±0.17 t 值 1.200 0.798 1.237 -0.243 0.174 P 值 0.250 0.438 0.237 0.812 0.864

表6 3 組大鼠干預(yù)12 周eNOS 蛋白、LncRNA-sONE、eNOS mRNA表達(dá)水平比較Table 6 Comparison of the expression levels of eNOS protein，LncRNAsONE and eNOS mRNA in three groups at the 12th week of intervention

表6 3 組大鼠干預(yù)12 周eNOS 蛋白、LncRNA-sONE、eNOS mRNA表達(dá)水平比較Table 6 Comparison of the expression levels of eNOS protein，LncRNAsONE and eNOS mRNA in three groups at the 12th week of intervention

注：與正常鹽組比較，aP＜0.05；與高鹽組比較，bP＜0.05

組別 只數(shù) eNOS LncRNA-sONE eNOS mRNA正常鹽組 16 1.14±0.07 1.04±0.14 1.05±0.14高鹽組 16 0.65±0.07a 1.45±0.13a 1.63±0.19a高鹽芹菜葉組 16 1.37±0.10ab 1.02±0.14b 2.55±0.18ab F 值 328.713 49.396 301.976 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

高血壓嚴(yán)重危害人類健康，其相關(guān)疾病病死率在全球總死亡率中排名第一［1］。高血壓患者中大部分屬鹽敏感性高血壓。鹽敏感性高血壓對(duì)氯化鈉的攝入量極為敏感，長(zhǎng)期膳食中鈉鹽的攝入量增加，可導(dǎo)致其血壓升高。

本研究中，自發(fā)性高血壓大鼠在第13 周齡被給予高鹽飲食誘導(dǎo)，結(jié)果顯示，高鹽組、高鹽芹菜葉組大鼠干預(yù)4 周、8 周、12 周收縮壓高于正常鹽組，高鹽組大鼠干預(yù)12 周eNOS 蛋白表達(dá)水平低于正常鹽組，LncRNA-sONE、eNOS mRNA 表達(dá)水平高于正常鹽組，說(shuō)明高鹽飲食可誘導(dǎo)大鼠收縮壓增加，LncRNAsONE、eNOS mRNA 表達(dá)水平上調(diào)，提示LncRNAsONE 可能參與鹽敏感性高血壓的發(fā)病機(jī)制；但eNOS蛋白表達(dá)水平下降，也提示eNOS 分泌可能被抑制。而高鹽芹菜葉組大鼠干預(yù)12 周收縮壓低于高鹽組；高鹽芹菜葉組大鼠干預(yù)12 周eNOS 蛋白、eNOS mRNA 表達(dá)水平高于高鹽組，LncRNA-sONE 表達(dá)水平低于高鹽組；說(shuō)明自發(fā)性高血壓大鼠在高鹽飲食的基礎(chǔ)上喂食芹菜葉后，大鼠血壓下降，eNOS 蛋白表達(dá)水平上升，LncRNA-sONE 表達(dá)下調(diào)；表明芹菜葉能降低鹽敏感性高血壓大鼠的血壓，且LncRNA-sONE、RNA-NOS、eNOS 參加了其降壓機(jī)制。

以NO 為代表的血管舒張因子在鹽敏感性高血壓的病理機(jī)制中扮演重要角色。研究表明，鹽敏感性高血壓患者血管內(nèi)皮NO 的基礎(chǔ)量分泌不足，且隨著鈉攝入量的增加，一氧化氮合酶（NOS）合成受到抑制，NO 含量降低［10-12］。鈉負(fù)荷的增加會(huì)降低內(nèi)皮功能，而NOS是NO 合成的唯一限速酶。NOS 廣泛分布于人體內(nèi)，其有3 個(gè)同工酶，其中NOS Ⅲ是eNOS 在鹽敏感性高血壓中的重要調(diào)節(jié)器，如強(qiáng)烈抑制eNOS 表達(dá)將升高血壓約30 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）［13-14］。但目前eNOS調(diào)控血壓的具體機(jī)制尚不清楚［12］。有研究表明，eNOS mRNA 表達(dá)水平升高，eNOS 蛋白及NO 含量也會(huì)相應(yīng)升高［15］。近年來(lái)，LncRNA 在疾病調(diào)節(jié)中的作用引起關(guān)注，其是一種長(zhǎng)度超過(guò)200 個(gè)核苷酸的RNA 分子，最初其被認(rèn)為不具有生物學(xué)活性；但越來(lái)越多的研究表明，LncRNA 可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的多種生物學(xué)活性物質(zhì)，在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的功能［16-17］。LncRNA 可通過(guò)染色質(zhì)調(diào)質(zhì)、蛋白質(zhì)變構(gòu)、細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)等多種機(jī)制參與血壓的調(diào)節(jié)［3，18］。ZHANG 等［4］研究表明，LncRNA-sONE 參與了鹽敏感性高血壓的發(fā)病機(jī)制。

結(jié)合本研究結(jié)果以及上述文獻(xiàn)分析，本課題組推測(cè)，芹菜葉降血壓的分子機(jī)制可能涉及LncRNA-sONE 表達(dá)水平的變化。干預(yù)12 周，高鹽組和高鹽芹菜葉組大鼠體質(zhì)量低于正常鹽組，但高鹽芹菜葉組大鼠的體質(zhì)量與高鹽組大鼠無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示每日喂食芹菜葉可降低升高的血壓，但對(duì)其體質(zhì)量無(wú)影響。由于實(shí)驗(yàn)時(shí)舒張壓數(shù)據(jù)的丟失，故未能取得自發(fā)性高血壓大鼠在不同時(shí)期的舒張壓結(jié)果，此外由于本研究大鼠只數(shù)較少，結(jié)論尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，芹菜葉能升高自發(fā)性高血壓大鼠eNOS蛋白及其mRNA 表達(dá)水平，降低LncRNA-sONE 表達(dá)水平；同時(shí)eNOS、LncRNA-sONE 可能參與了芹菜葉的降壓機(jī)制。今后還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來(lái)研究其相關(guān)基因及信號(hào)通路情況。

作者貢獻(xiàn)：黃冠華進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)收集，論文修訂，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；崔凌志負(fù)責(zé)研究的實(shí)施與可行性分析，數(shù)據(jù)整理和論文撰寫；王子超負(fù)責(zé)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；唐存亮負(fù)責(zé)結(jié)果分析與解釋。

本文無(wú)利益沖突。