田超，瑪娜璐璐，袁夢(mèng)晨，王麗琴，安娜，張涵萊，邢雁偉，孫逸坤，高永紅

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部和北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市 100700；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京市100053

全世界每年腦卒中發(fā)病人數(shù)約1500萬，是導(dǎo)致殘疾和死亡的主要原因，其中缺血性腦卒中超過85%[1-2]。缺血性腦卒中是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞毒性、炎癥、活性氮和活性氧引起的氧化損傷有密切關(guān)聯(lián)，這些病理變化會(huì)引起血腦屏障破壞，損害神經(jīng)功能[3-5]。

小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)特有的免疫細(xì)胞，與神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病相關(guān)，在缺血性腦卒中的病變過程中也發(fā)揮重要作用[6]。腦缺血后，小膠質(zhì)細(xì)胞活化，既分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子保護(hù)神經(jīng)元，也分泌促炎因子包括活性氧，導(dǎo)致氧化應(yīng)激性損傷[7-9]?；钚匝醯却傺准?xì)胞因子引發(fā)一系列炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和緊密連接破壞，導(dǎo)致血腦屏障功能和結(jié)構(gòu)受損[10-11]。

清開靈注射液具有清熱解毒、化痰通絡(luò)和醒神開竅的作用，是以安宮牛黃丸為基礎(chǔ)研發(fā)而來。清開靈注射液臨床對(duì)缺血性腦卒中有明確療效，能促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，改善患者預(yù)后[12-14]。本研究觀察清開靈注射液能否通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，提高腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活和功能。

1 材料與方法

1.1 材料

清開靈注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字Z11020269，10 ml/支)：亞寶北中大(北京)制藥有限公司。小鼠Balb/c 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞：中日友好醫(yī)院婁晉寧教授惠贈(zèng)。小鼠BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞(No.3111C0001CCC000063)：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。DMEM高糖培養(yǎng)基：GIBCO 公司。ECM 培養(yǎng)基：SCIENCELL 公司。優(yōu)質(zhì)胎牛血清：PAA 公司。青鏈霉素混合液：北京索萊寶科技有限公司。米諾環(huán)素：SIGMA公司。一氧化氮檢測(cè)試劑盒：北京普利萊基因技術(shù)有限公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8)細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒：上海東仁化學(xué)科技有限公司。Toll 樣受體4 (Toll-like receptor 4,TLR4)、gp91phox一 抗：SANTA公司。閉鎖小帶蛋白-1 (zonula occludens-1,ZO-1)：INVITROGEN公司。鼠抗β-actin、過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG：武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠BV2細(xì)胞培養(yǎng)在胎牛血清和青鏈霉素混合液配制的DMEM 培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。生長(zhǎng)至90%以上細(xì)胞匯合時(shí)，加0.05%胰酶消化液消化傳代。

小鼠Balb/c 細(xì)胞培養(yǎng)在配好的ECM 完全培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。生長(zhǎng)至90%以上細(xì)胞匯合時(shí)，加0.25%胰酶消化液消化傳代。

將生長(zhǎng)良好的BV2 細(xì)胞懸液以1×105/ml 接種于24孔培養(yǎng)板中。生長(zhǎng)至80%細(xì)胞匯合時(shí)，PBS溶液洗2 次，更換無血清DMEM 培養(yǎng)基缺氧培養(yǎng)。細(xì)胞分為6 組：正常組單用無血清DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型組用無血清DMEM 培養(yǎng)基，置1.0%O2、37 ℃三氣培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)24 h，再置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)24 h；清開靈0.0625%組在無血清DMEM 培養(yǎng)基中加入0.0625%清開靈注射液，缺氧培養(yǎng)24 h 后復(fù)氧；清開靈0.125%組在無血清DMEM 培養(yǎng)基中加入0.125%清開靈注射液，缺氧培養(yǎng)24 h 后復(fù)氧；清開靈0.25%組在無血清DMEM 培養(yǎng)基中加入0.25%清開靈注射液，缺氧培養(yǎng)24 h 后復(fù)氧；米諾環(huán)素組在無血清DMEM 培養(yǎng)基中加入200 nmol/L 米諾環(huán)素，缺氧培養(yǎng)24 h 后復(fù)氧，復(fù)氧時(shí)更換無血清DMEM 培養(yǎng)基。復(fù)氧24 h后，小心吸出上清備用。

Balb/c 細(xì)胞正常培養(yǎng)48 h，生長(zhǎng)至80%細(xì)胞匯合時(shí)，吸除96 孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，PBS 溶液清洗2次，每孔加入各組小膠質(zhì)細(xì)胞上清100 μl，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置24 h，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)

Balb/c 細(xì) 胞 每 孔加 入CCK-8 檢測(cè) 液10 μl，孵育40 min。波長(zhǎng)450 nm 下檢測(cè)各孔上清液吸光度值(A值)。

1.2.3 一氧化氮濃度

Balb/c 細(xì)胞每孔吸取培養(yǎng)上清液50 μl，波長(zhǎng)540 nm 下檢測(cè)各孔上清液吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。

1.2.4 Western blotting

BV2 細(xì)胞接種在6-well Insert 膜上層，正常培養(yǎng)48 h 至80%細(xì)胞匯合。PBS 溶液洗2 次，分組同前，膜內(nèi)外加入相應(yīng)藥物，正常組置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其他各組置1.0% O2、37 ℃三氣培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)。

6 孔板中接種Balb/c 細(xì)胞，正常培養(yǎng)48 h 至80%細(xì)胞匯合。小心吸除培養(yǎng)基，分別將缺氧培養(yǎng)24 h 的BV2 細(xì)胞移入六孔板中，Insert 內(nèi)外加DMEM，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)24 h。

提取Balb/c 細(xì)胞總蛋白，BCA 定量后，等體積加入5×buffer，100 ℃煮沸20 min 備用。蛋白樣本電泳，電轉(zhuǎn)，5%脫脂奶粉搖床上室溫封閉1 h，加入配好TLR4 (1∶1000)、gp91phox(1∶1000)、ZO-1 (1∶1000)和β-actin(1∶3000)一抗，4 ℃過夜。TBST 溶液洗膜3次，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗3 次。暗室內(nèi)膜上滴加發(fā)光液，避光壓片、顯影、定影、晾干待用。掃描膠片，使用Image J 計(jì)算灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)皮細(xì)胞活性

倒置相差顯微鏡下觀察，正常組內(nèi)皮細(xì)胞約60%～80%貼壁良好，緊密連接成片，細(xì)胞體為鋪路石樣。缺氧后，細(xì)胞由貼壁變?yōu)閼腋?，胞體逐漸變圓，與正常組有明顯區(qū)別(圖1)。

CCK-8 檢測(cè)模型組A 值低于正常組(P＜0.05)；清開靈0.0625%、0.125%和0.25%組及米諾環(huán)素組A 值均較模型組升高(P＜0.05)。見表1。

2.2 一氧化氮濃度

模型組一氧化氮濃度較正常組增加(P＜0.05)。清開靈0.0625%和0.125%組一氧化氮濃度較模型組下降(P＜0.05)。見表1。

表1 各組腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞活性和一氧化氮濃度比較

2.3 Western blotting

模型組TLR4 蛋白表達(dá)較正常組增加(P＜0.05)。清開靈0.25% 組TLR4 蛋白表達(dá)較模型組下降(P＜0.05)。

模型組gp91phox蛋白表達(dá)較正常組增加(P＜0.05)。清開靈0.0625%、0.125%和0.25%組及米諾環(huán)素組gp91phox蛋白表達(dá)較模型組降低(P＜0.05)。

模型組ZO-1 蛋白表達(dá)較正常組降低(P＜0.05)。清開靈0.0625%、0.125%和0.25%組及米諾環(huán)素組ZO-1蛋白表達(dá)提高(P＜0.05)。見圖2、表2。

圖1 各組腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)(倒置相差顯微鏡，×100)

圖2 各組內(nèi)皮細(xì)胞Western blotting結(jié)果

3 討論

缺血性腦卒中后炎癥反應(yīng)導(dǎo)致血腦屏障破壞，貫穿整個(gè)病程，引起腦水腫、神經(jīng)細(xì)胞死亡，發(fā)病后抑制炎癥反應(yīng)，可保護(hù)和修復(fù)血腦屏障[15-16]。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障重要組成部分，細(xì)胞間以緊密連接方式相連，形成基本骨架結(jié)構(gòu)，保證血腦屏障的結(jié)構(gòu)完整和功能正常[17]。小膠質(zhì)細(xì)胞活化后分泌大量促炎因子，激活TLR4、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶等相關(guān)蛋白和通路，產(chǎn)生大量活性氧，破壞內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)，造成血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能喪失，損害神經(jīng)系統(tǒng)功能[18-20]。細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)鼙苊饣祀s因素干擾，在觀察單因素對(duì)細(xì)胞模型的影響時(shí)尤為適用。我們選用小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2細(xì)胞體外培養(yǎng)，模擬缺血再灌注損傷模型，利用清開靈注射液進(jìn)行干預(yù)；然后將BV2 細(xì)胞和Balb/c 細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察清開靈通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，保護(hù)血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞的作用及其機(jī)制。

表2 各組內(nèi)皮細(xì)胞TLR4、gp91phox和ZO-1蛋白表達(dá)(/β-actin)

本研究顯示，清開靈注射液能夠有效保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞活性，進(jìn)而保護(hù)血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能。一氧化氮是一種重要的氣體效應(yīng)分子和信號(hào)分子，可作為第二信使在諸多疾病的病理生理過程中發(fā)揮作用[21]。缺血時(shí)，一氧化氮能生成毒性更強(qiáng)的OH-和NO2-，引發(fā)酪氨酸硝基化反應(yīng)，加重脂質(zhì)過氧化程度，破壞緊密連接等蛋白，損傷內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞[22-23]。本研究顯示，0.0625%和0.125%濃度清開靈注射液可減少內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮生成，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。

TLR4 作為細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β (interleukin-1β,IL-1β)的上游受體TLRs 家族的重要成員，廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)各細(xì)胞，包括小膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，在缺血性腦卒中后激活，可引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，包括激活NADPH 氧化酶產(chǎn)生活性氧，從而介導(dǎo)血腦屏障破壞[24-28]。本研究顯示，0.25%清開靈注射液能顯著降低內(nèi)皮細(xì)胞TLR4 蛋白表達(dá)，從而減低炎癥反應(yīng)，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。

gp91phox是NADPH 氧化酶的主要功能亞基，gp91phox蛋白表達(dá)可以反映NADPH 氧化酶的激活情況[29-31］。本研究顯示，清開靈注射液可降低內(nèi)皮細(xì)胞gp91phox蛋白表達(dá)，降低NADPH 氧化酶激活，減少活性氧產(chǎn)生，保護(hù)血腦屏障。

ZO-1作為胞質(zhì)輔助蛋白的主要構(gòu)成物質(zhì)，是緊密連接復(fù)合體重要的組成部分，能夠連接內(nèi)皮細(xì)胞，保持血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能[32-33］。TLR4信號(hào)通路及其下游蛋白可導(dǎo)致緊密連接結(jié)構(gòu)功能障礙，破壞血腦屏障[28］。本研究顯示，清開靈注射液可抑制內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1蛋白的破壞，促進(jìn)緊密連接形成，保護(hù)血腦屏障功能。

綜上所述，本研究采用缺氧誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活化，刺激Balb/c 內(nèi)皮細(xì)胞損傷，通過對(duì)細(xì)胞活性、一氧化氮含量及TLR4、gp91phox和ZO-1 等相關(guān)蛋白的表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)清開靈注射液可能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞缺氧活化，降低腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞TLR4 和gp91phox蛋白表達(dá)，提高ZO-1 蛋白表達(dá)，提高腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活和功能，從而減輕小膠質(zhì)細(xì)胞缺氧活化對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。