李明明，屈 彬，方向明，

（1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038；2. 中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230038）

支氣管哮喘（bronchial asthma），簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘，是一種由多種炎性細(xì)胞介導(dǎo)的呼吸道慢性炎癥性疾病[1]。目前我國(guó)哮喘患者約有3 000 多萬(wàn)人[2-3]，患病率為1%～4%，并且我國(guó)哮喘患病率呈上升態(tài)勢(shì)。PI3KAkt/PKB 信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖和凋亡中占有重要地位，不僅參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、凋亡、生長(zhǎng)和細(xì)胞存活的廣泛細(xì)胞反應(yīng)，而且對(duì)細(xì)胞內(nèi)高度復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)態(tài)有著重要作用[4-5]。平喘寧是我導(dǎo)師的經(jīng)驗(yàn)方，近年來(lái)一直使用此方在臨床上治療寒哮，療效明顯，主要是由炙麻黃、細(xì)辛等11 味中藥組成，其具有溫陽(yáng)化痰，散寒平喘之功。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察平喘寧干預(yù)寒哮大鼠肺組織PI3K-Akt/PKB 信號(hào)通路上的蛋白，檢測(cè)其肺組織中ASK1、TSC1 的表達(dá)量，進(jìn)一步探討平喘寧在氣道重塑方面的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 選用105 只周齡在6～8 周，體質(zhì)量180～230 g，平均體質(zhì)量（220.79±4.37）g 的SPF 級(jí)健康的雄性SD 大鼠。大鼠采購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證編號(hào)：scxk（皖）2017-001）。模擬晝夜，動(dòng)物房溫度控制在（21±1）℃，濕度控制在40%～70%，保持通風(fēng)。大鼠飼料按照每只每日10 g，水瓶每日保持清潔并放置充足干凈飲用水，每隔1 日更換墊料，清理鼠籠，同時(shí)打掃動(dòng)物房并消毒。

1.2 藥物 平喘寧：藥物來(lái)源于安徽省中醫(yī)院中草藥房，由麻黃、細(xì)辛、杏仁、黃芪、蘇子、陳皮等11 味中藥組成。桂龍咳喘寧膠囊：桂龍醫(yī)藥（安徽）有限公司（批號(hào)：180112）。地塞米松片：上海信誼藥業(yè)有限公司（批號(hào)：015170401）

1.3 試劑 卵蛋白（OVA）；Trizol（Life technogies 公司，批號(hào)90803）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)00519963）：Thermo Scientific ；ASK1 抗體（abcam 公司，批號(hào)：ab39402）；TSC1 抗體（abcam 公司，批號(hào)：ab217328）二甲苯（批號(hào)20180310）、氯仿（批號(hào)20161013）。

1.4 儀器 超聲霧化機(jī)，江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司；生物組織自動(dòng)脫水機(jī)，湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司；徠卡切片機(jī)，Leica；熒光定量PCR 儀，Thermo Scientific；微孔板迷你離心機(jī)，杭州奧盛儀器有限公司。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 根據(jù)中醫(yī)寒哮動(dòng)物模型建立的方法[6-7]，在1 周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，第1 天及第8 天對(duì)除正常組之外的6 組大鼠腹腔注射1 mL 的懸液（由10%的卵蛋白與生理鹽水配制而成），使其致敏；正常組由生理鹽水代替此懸液進(jìn)行腹腔注射。從第15 至21 天開(kāi)始對(duì)除正常組之外的模型組、治療組大鼠使用1%的卵蛋白懸液進(jìn)行超聲霧化，每次30 min，并且每天將大鼠置于寒冷箱中給予相同時(shí)間的寒冷刺激，以造出寒哮模型。正常組大鼠用生理鹽水代替卵蛋白懸液進(jìn)行霧化。

觀察大鼠出現(xiàn)呼吸急促、腹部收縮明顯、咳嗽、流清涕、精神頹廢、呆板、活動(dòng)度下降、畏寒、鼠毛散亂無(wú)華、大便溏、食量減少明顯等現(xiàn)象時(shí)，提示寒哮模型造模成功。

自第22 天起參照人與動(dòng)物之間的給藥劑量換算得出平喘寧高、中、低劑量組每千克大鼠每日給藥量分別為14.578 g·kg-1，7.289 g·kg-1，3.645 g·kg-1。桂龍咳喘寧劑量組每千克大鼠每日給藥量則為0.405 g·kg-1。地塞米松劑量組每千克大鼠每日給藥量為0.405 mg·kg-1，正常組、模型組灌胃等容積的0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)灌胃28 d。

2.2 取材 大鼠4 周灌胃完成后禁食24 h 然后進(jìn)行末次激發(fā)，并在2 h 內(nèi)快速地對(duì)所有大鼠進(jìn)行稱(chēng)重，對(duì)每100 g 大鼠給予20 mg 藥物（濃度為2%的巴比妥鈉）進(jìn)行腹腔注射麻醉取出大鼠肺組織，將左肺置于中性福爾馬林中固定，右肺置于-80 ℃的冰箱中凍存。

2.3 病理檢測(cè) 取出放置于中性福爾馬林固定完成的大鼠左肺，進(jìn)行脫水、包埋、切片、貼片、烘片及HE染色等步驟，最后在400 倍光鏡下觀察大鼠肺組織的形態(tài)學(xué)改變。

2.4 RT-qPCR 檢測(cè) 1）RNA 提取。取60～70 mg 的大鼠肺組織放入EP 管中剪碎，然后在液氮中研磨，再加入1 mL TRIzol 勻漿；將EP 管在冰上放置2 min后，使用離心機(jī)在4 ℃及1 2000 rpm 地條件下將EP管中混合液離心10 min；向離心后的液體中加入0.2 mL 的氯仿，劇烈搖晃15 s，然后在室溫下安靜放置3 min；將上述步驟結(jié)束的液體接著放入4 ℃、12 000 rpm 的離心機(jī)中離心15 min，然后取500 μL 上清液加入另一EP 管中以備用；然后在EP 管滴加異丙醇0.5 mL，輕輕地?fù)u晃是液體混勻，然后在室溫下靜置10 min，再次放入4℃、12 000 rpm 的離心機(jī)中離心10 min，將管內(nèi)上清液吸取丟棄；在EP 管中加入1 mL 的75℅乙醇（DEPC 水配制）進(jìn)行洗滌。然后在4℃、12 000 rpm 的離心機(jī)中離心5 min，然后將管內(nèi)上清液吸取丟棄。然后將其敞口在室溫條件下放置30 min，使沉淀的RNA 自然干燥；再次在EP 管中加入50 μL 的DEPC 水，放入55 ℃環(huán)境中10 min 加快RNA 的溶解，然后將RNA 溶液放置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?）RT 反應(yīng)：1 μg RNA、10 μmol/L Oligo（dT）1 μL、DEPC 水補(bǔ)足至12 μL，點(diǎn)動(dòng)離心；在PCR儀上65 ℃加熱5 min，冰浴3 min；加5×反應(yīng)緩沖液4.0 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、Revert AidTM M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶1 μL、RibolockTM RNA 酶抑制劑1μL，PCR 儀上42 ℃加熱60 min，70 ℃5 min；上述反應(yīng)液即為cDNA，－80 ℃保存。3）PCR 反應(yīng)：cDNA作為熒光定量模板，反應(yīng)體系2×SYBR Green mixture 5 μL、10 μmol/L 正向引物（見(jiàn)表1）1μL、10μmol/L 反向引物（見(jiàn)表1）1 μL、cDNA 1 μL、去RNA 酶水2 μL，反應(yīng)條件為95 ℃2 min，95 ℃5 s、60 ℃10 s，共40 個(gè)循環(huán)。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)（見(jiàn)表1），計(jì)算方法為2－ΔΔCt。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物

2．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組均有大鼠死亡的情況發(fā)生，但存活數(shù)均在10 只以上，為方便統(tǒng)計(jì)每組均取10 只大鼠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）”描述連續(xù)型變量，多組均數(shù)比較使用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 表示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 寒哮大鼠治療后癥狀的變化 灌胃給藥后，藥物組大鼠癥狀較模型組有明顯好轉(zhuǎn)，其中平喘寧高劑量組大鼠癥狀改善最為明顯，其呼吸急促狀況緩解，腹部節(jié)律收縮不明顯，咳嗽、流清涕較前改善，精神好轉(zhuǎn)，活動(dòng)度提高，畏寒、大便溏癥狀消失，食欲正常。

3.2 各組大鼠肺組織病理變化比較 病理結(jié)果見(jiàn)圖1，正常組大鼠支氣管周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)不顯，支氣管管壁及肺泡保持完整，未見(jiàn)平滑肌增生，未見(jiàn)支氣管增厚，管腔內(nèi)未見(jiàn)粘液栓及脫落的肺泡上皮，而光鏡下觀察到模型組大鼠支氣管結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，周?chē)つそM織發(fā)生水腫，多種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，可見(jiàn)粘液栓及脫落的支氣管上皮細(xì)胞，支氣管周?chē)交≡錾黠@，黏膜褶皺增多，管腔出現(xiàn)狹窄。除正常組外的其余5 個(gè)藥物組大鼠通過(guò)灌胃給藥后，對(duì)比模型組大鼠可以觀察到，藥物組大鼠病理改變都有不同程度的好轉(zhuǎn)，并且平喘寧高劑量組對(duì)氣道改善程度優(yōu)于其余個(gè)藥物組。

圖1 各組大鼠肺組織HE 染色（10×40 倍）

3.3 各組大鼠肺組織ASK1、TSC1 表達(dá)水平比較相較于正常組，其余6 組ASK1 的表達(dá)量均上升，并且P 值均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義見(jiàn)表2，并且模型組中的ASK1 表達(dá)量上升最為顯著（P＜0.01）。除正常組外，其余五個(gè)藥物組相對(duì)比于模型組，ASK1 的表達(dá)量均有所下調(diào)（P＜0.01）；平喘寧高、中劑量組中ASK1 的表達(dá)量較地塞米松組與桂龍咳喘寧組下降明顯（P＜0.01），其中以平喘寧高劑量組最為顯著（P＜0.01）；而在平喘寧高中低三個(gè)劑量組內(nèi)相比較而言，平喘寧高劑量組對(duì)ASK1 表達(dá)量的下調(diào)優(yōu)于中劑量組（P＜0.01），中劑量組又優(yōu)于低劑量組（P＜0.01）。

并且通過(guò)表2 可以看出，TSC1 的表達(dá)量，相較于正常組，其余6 組TSC1 的表達(dá)量均有所下降，并且P值均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尤其是模型組中的TSC1 表達(dá)量下調(diào)最為明顯（P＜0.01）。除正常組外，其余五個(gè)藥 物治療組相與模型組相比，TSC1 的表達(dá)量均有所上升（P＜0.01）；平喘寧高劑量組對(duì)TSC1 的表達(dá)量的上調(diào)優(yōu)于地塞米松組與桂龍咳喘寧組（P＜0.01），而此二組對(duì)TSC1 表達(dá)量上調(diào)又高于平喘寧中、低劑量組（P＜0.01）；而在平喘寧高中低3 個(gè)劑量組內(nèi)相比較而言，平喘寧高劑量組對(duì)TSC1 表達(dá)量的上調(diào)明顯大于中、低劑量組（P＜0.01），而中劑量組對(duì)TSC1 的影響又高于低劑量組（P＜0.01）。

表2 7 組大鼠肺組織中ASK1、TSC1 表達(dá)豐度（s，n=10）

表2 7 組大鼠肺組織中ASK1、TSC1 表達(dá)豐度（s，n=10）

注：同正常組比較，##P＜0.01；同模型組比較，△△P＜0.01

4 討論

哮喘是最常見(jiàn)的慢性病之一，是由細(xì)胞組分和多種細(xì)胞（如嗜酸粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞）參與的氣道慢性炎癥性疾病，其以氣道高反應(yīng)性（airway hyperresponsive-ness，AHR）、氣道重塑（airway remod-eling）、支氣管炎癥、氣道阻塞以及不穩(wěn)定的支氣管舒縮狀態(tài)為主要特征[8-9]。中醫(yī)認(rèn)為哮病的病理因素以“痰”伏藏于肺中為基礎(chǔ)，其中的伏痰是發(fā)為哮病的“夙根”。

平喘寧方主要由解表藥聯(lián)合止咳平喘藥，外加補(bǔ)虛等藥構(gòu)成，以達(dá)到溫肺化痰降氣、止咳平喘補(bǔ)虛之功效，主治素體虛弱伏痰內(nèi)蘊(yùn)，加之外感風(fēng)寒，內(nèi)外合邪，痰氣相搏，肺失宣降的寒哮。方中共有11 味中藥：麻黃、細(xì)辛、半夏、蘇子、苦杏仁、陳皮、浙貝母、防風(fēng)、地龍、黃芪、太子參。方中麻黃宣肺散寒平喘，細(xì)辛溫肺化飲，兩者合用為君藥；苦杏仁、蘇子降氣止咳平喘，與麻黃合用可以恢復(fù)肺氣之宣降，半夏化痰與苦杏仁相伍，可以加強(qiáng)化痰止咳之效，地龍的使用可以舒緩支氣管痙攣狀態(tài)，以上4 味共為臣藥；陳皮與半夏配伍，達(dá)到順理肺氣，氣順痰消的目的，浙貝母[9-10]現(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)其可以抗炎、舒張氣道平滑肌以及抑制細(xì)胞增殖，而黃芪、防風(fēng)兩藥合用取自玉屏風(fēng)散的益氣固表之意、太子參補(bǔ)脾土，3 藥合用能培土生金扶助正氣，加快肺功能的恢復(fù)，協(xié)助提升君藥臣藥的效果，以上5 味為佐藥；且地龍性善走竄經(jīng)絡(luò)亦可平喘，能夠協(xié)助諸藥對(duì)寒哮的治療，發(fā)揮使藥的作用。

PI3K/Akt 信號(hào)通道是人體內(nèi)十分重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道，其在調(diào)控細(xì)胞存活、代謝、增殖及凋亡中發(fā)揮著重要作用[11-12]。研究顯示PI3K/Akt 信號(hào)通路與哮喘的關(guān)系十分密切，其通過(guò)影響氣道平滑肌細(xì)胞（ASMC）的增殖、干預(yù)炎癥細(xì)胞及影響氣道黏液的分泌，在支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[13-14]。有報(bào)道表明ASK1（Apoptosis signal regulating kinase 1）是細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAP3Ks）家族成員之一，當(dāng)受到外界刺激時(shí)可以選擇性的激活c-Jun 氨基末端激酶（C-Jun N-terminal kinase，p-JNK），誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[15-16]；同時(shí)它也是Akt 激酶底物，研究顯示，Akt激酶可以磷酸化ASK1 的Ser83，從而抑制ASK1 的活化，進(jìn)而抑制細(xì)胞的凋亡[17]，并且ASK1 的活化，可以刺激炎性細(xì)胞反應(yīng)，分泌炎性介質(zhì)，損傷肺組織[18]。研究顯示，TSC1/2 復(fù)合體位于PI3K-Akt 的下游，但處于mTOR 的上游，Akt 的磷酸化可以通過(guò)抑制TSC1/TSC2 的活性來(lái)激活mTOR，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響，并且單獨(dú)的TSC1 對(duì)細(xì)胞的增殖依然具有調(diào)節(jié)作用[19-20]，并且有報(bào)道稱(chēng)TSC1 表達(dá)量的升高有助于抑制人胚肺成纖維細(xì)胞的增殖與分化，對(duì)肺纖維化起到抑制作用[21]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，平喘寧能夠通過(guò)調(diào)節(jié)PI3KAkt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的ASK1、TSC1 的表達(dá)，進(jìn)而降低氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性，對(duì)平滑肌增殖起到抑制作用，從而實(shí)現(xiàn)改善氣道重塑達(dá)到治療哮喘的目的。