王 婧，李 瑞，王吉祥，宮澤恩，孫子龍，王曉聞

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

腹瀉是臨床上經(jīng)常出現(xiàn)的一種病癥，而且在各種動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中也會(huì)頻繁發(fā)生，若不及時(shí)對其采取措施進(jìn)行診治，將會(huì)造成動(dòng)物的大批死亡，從而對各大養(yǎng)殖場造成無法估量的經(jīng)濟(jì)損失[1]。當(dāng)機(jī)體處于健康狀態(tài)時(shí)，腸黏膜能夠阻擋細(xì)菌和病毒等穿過；但是當(dāng)腸道黏膜的防御作用下降時(shí)，這些有害的物質(zhì)就會(huì)透過黏膜誘發(fā)各種疾病。因此，腹瀉與腸黏膜防御之間有著十分密切的關(guān)系?？股叵嚓P(guān)性腹瀉是由于濫用或過量使用抗生素，從而導(dǎo)致機(jī)體的抗生素耐藥性增加[2]，是臨床上使用抗菌類藥物過程中所發(fā)生的最為多見的副作用，尤其是氨基青霉素類、頭孢菌素類等相對廣譜的抗生素[3-4]。

益生菌的使用是調(diào)節(jié)腸道菌群的一種治療措施，可以幫助恢復(fù)腸道微生物群并重建腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)[5-6]。URDACI 等[7]研究表明，用枯草芽孢桿菌或植物乳桿菌處理可以減少由脂多糖（Lipopolysaccharides，PS）誘導(dǎo)的腹瀉。益生菌是有利于宿主健康的活的微生物，其存在于健康人類的腸道中，能夠促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高機(jī)體免疫力，維持腸道菌群結(jié)構(gòu)平衡，已被用于調(diào)節(jié)胃腸道微生物群和治療各種腸道疾病，并且具有極好的安全效益比。OZDAL 等[8]研究表明，蘋果是世界上最受歡迎的水果之一，其含有豐富的多酚和纖維，能夠通過增加有益細(xì)菌來調(diào)節(jié)微生物。有研究表明，干酪乳桿菌對于保護(hù)斷奶仔豬的腸道具有很好的效果，同時(shí)提高了淋巴細(xì)胞的數(shù)目，增強(qiáng)了機(jī)體的免疫機(jī)能[9-10]。

本研究利用1%的植物乳桿菌在pH 值為7.0的條件下發(fā)酵新鮮蘋果汁24 h 得到的發(fā)酵蘋果汁處理腹瀉小鼠，通過統(tǒng)計(jì)各組小鼠的稀便率以及對于小腸各段進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，探討發(fā)酵蘋果汁對腹瀉小鼠腸黏膜的作用和對小腸結(jié)構(gòu)的完整性的影響，旨在為進(jìn)一步深入研究發(fā)酵蘋果汁的功能提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料 供試蘋果為紅富士，購自山西省晉中市山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場；植物乳桿菌CICC21809，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；供試動(dòng)物為健康的SPF 級ICR 小鼠45 只，3 周齡、雄性，由山西醫(yī)科大學(xué)提供。

1.1.2 試劑 頭孢曲松鈉，購自北京索萊寶有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵蘋果汁的制備 將低溫保藏的菌種活化后，在37 ℃培養(yǎng)箱中放置24 h，使菌液濃度達(dá)約1.0×107cfu/mL。新鮮蘋果汁的pH 值在4.0 左右，通過食用堿（Na2CO3）調(diào)節(jié)蘋果汁pH 值到6.5，121 ℃高壓滅菌10 min；待果汁冷卻后，在超凈工作臺上進(jìn)行分裝，根據(jù)不同發(fā)酵條件將其接種到50 mL 果汁中，接種后的蘋果汁放置在37 ℃恒溫箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 乳酸菌發(fā)酵液的制備 將乳酸菌菌種活化后，接種于乳酸細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基（MRS）中，37 ℃培養(yǎng)24 h，使菌液濃度達(dá)約1.0×107cfu/mL。

1.2.3 動(dòng)物分組及給藥 將45 只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)分為5 個(gè)組（對照組、模型組、未發(fā)酵蘋果汁組、發(fā)酵蘋果汁組和乳酸菌組），每天對各組小鼠進(jìn)行2 次灌胃，第1 次是在9：00，其中，對照組每只小鼠灌胃0.3 mL 的無菌生理鹽水，模型組、未發(fā)酵蘋果汁組、發(fā)酵蘋果汁組和乳酸菌組每只小鼠各灌胃等量的頭孢曲松鈉溶液。第2 次是在4 h后，將各組每只小鼠單獨(dú)放在一個(gè)鼠籠里，對照組和模型組每只小鼠灌胃0.3 mL 的無菌生理鹽水，未發(fā)酵蘋果汁組給予等量的新鮮蘋果汁，發(fā)酵蘋果汁組給予等量的發(fā)酵蘋果汁，乳酸菌組灌胃等量的MRS 菌液；之后觀察2 h，期間記錄各組小鼠的稀便情況和正常的小鼠數(shù)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。第8 天將全部小鼠脫頸處死，并無菌收集各個(gè)小鼠的十二指腸、空腸和回腸，置于4%多聚甲醛中固定48 h，期間換一次固定液，保存于75%的乙醇中。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 稀便率測定 將各組的每只小鼠分別放置在一個(gè)鼠籠里，2 h 內(nèi)統(tǒng)計(jì)每只小鼠的總排便數(shù)和所排稀便數(shù)，計(jì)算稀便率。

稀便率＝2 h 內(nèi)所排稀便數(shù)/ 每只小鼠總排便數(shù)×100% （1）

1.3.2 腸道組織形態(tài)學(xué)觀察 根據(jù)方磊涵等[11]的方法，無菌采集十二指腸、空腸和回腸，沿橫截面橫切成適當(dāng)大小，生理鹽水沖洗后固定，進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋流程，使用切片機(jī)切成5 μm厚的連續(xù)切片，挑選出完整的組織烘干后用于HE染色。染色時(shí)，先對切片進(jìn)行二甲苯脫蠟，用梯度乙醇浸泡，再用蘇木精染色5 min，自來水沖洗1 min后，利用1%的鹽酸- 乙醇溶液來分色，再用自來水沖洗5 min；用梯度乙醇逐步脫水；在伊紅染液中浸入30 s 后快速倒掉染液；再用高濃度的乙醇進(jìn)行脫水，在二甲苯中透明20 min 后，中性樹膠封片，放置過夜后在顯微鏡下觀察并對完整的組織進(jìn)行拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Graph Pad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，稀便率采用One- way ANOVA 進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理小鼠稀便率的變化

從圖1 可以看出，在第3 天，對照組及各試驗(yàn)組的小鼠與模型組相比均無顯著性變化（P＞0.05）；第4 天時(shí)，對照組、乳酸菌組和發(fā)酵蘋果汁組的小鼠與模型組相比，稀便率均顯著下降（P＜0.05）；與發(fā)酵蘋果汁組相比，未發(fā)酵蘋果汁組稀便率顯著上升（P＜0.05）；第5～7 天，各組小鼠的稀便率均無顯著性變化（P＞0.05）。

2.2 不同處理小鼠十二指腸的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

從圖2 可以看出，各試驗(yàn)組小鼠腸道具有明顯的變化，在低倍鏡下，對照組、未發(fā)酵蘋果汁和發(fā)酵蘋果汁組的十二指腸絨毛呈長指狀和彎曲狀，結(jié)構(gòu)完整，絨毛與隱窩界限分明，無明顯病理變化；而模型組出現(xiàn)腸絨毛的斷裂、漂浮，隱窩和腸絨毛雜亂無序。

2.3 不同處理小鼠空腸的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

圖3 結(jié)果顯示，對照組、未發(fā)酵蘋果汁組、益生菌組和發(fā)酵蘋果汁組的腸絨毛排列整齊，與隱窩界限分明，無明顯病理變化，且發(fā)酵蘋果汁組的絨毛較長；模型組觀察到腸絨毛的斷裂縮短。

2.4 不同處理小鼠回腸的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

圖4 結(jié)果顯示，對照組、益生菌組、發(fā)酵蘋果汁組的腸絨毛和隱窩排列緊密整齊，結(jié)構(gòu)相對完整；模型組和未發(fā)酵果汁組能夠看到明顯的絨毛斷裂和縮短。

3 結(jié)論與討論

抗生素誘導(dǎo)的小鼠腹瀉是構(gòu)建動(dòng)物腹瀉模型最為常用的方法，通常都是小鼠灌胃7 d 左右即可形成。

仔豬腹瀉是目前養(yǎng)殖場中常見的問題，吳蘇君等[12]研究表明，仔豬腹瀉與腸道菌群變化相關(guān)。絨毛是小腸最重要的黏膜組成部分，機(jī)體的各種消化吸收也是利用腸絨毛進(jìn)行的[13]。因此，腸絨毛對于小腸的吸收功能具有最直接的作用。絨毛越長，說明消化吸收越強(qiáng)。隱窩是絨毛基部的上皮內(nèi)陷形成的管狀結(jié)構(gòu)[14]，隱窩深度則反映了細(xì)胞的生成率和小腸的更新速度，更新過程減慢，就會(huì)導(dǎo)致隱窩變淺，表明成熟細(xì)胞較多，吸收消化能力增強(qiáng)[15]。

有研究證明，枯草芽孢桿菌能夠增加成年的雄性雞中的回腸絨毛長度，從而提高飼料轉(zhuǎn)化率[16]。CHICHLOWSKI 等[17]用屎腸球菌處理肉雞，結(jié)果顯示，空腸和回腸的絨毛變長。當(dāng)給動(dòng)物喂乳桿菌后，黏膜出現(xiàn)了更多的褶皺，絨毛變長，增加了飼料的利用率[18]。郭元晟等[19]試驗(yàn)結(jié)果表明，乳酸桿菌對于肉雞腸絨毛的增長具有促進(jìn)作用。魏俊淑[20]研究表明，植物乳桿菌能夠減緩葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)形成的結(jié)腸炎小鼠的腸道組織學(xué)損壞。本試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵蘋果汁能增加腸絨毛高度，促進(jìn)小鼠腸黏膜的發(fā)育。小鼠腹瀉后，腸道中的水分會(huì)變多，會(huì)促進(jìn)糞便的軟化，對腸黏膜也會(huì)產(chǎn)生一定的刺激，從而造成黏膜損害。小鼠灌服發(fā)酵蘋果汁后，其腸絨毛損傷較輕，說明發(fā)酵蘋果汁能夠減輕腹瀉對腸黏膜的刺激，對腸絨毛的完整性起到一定的保護(hù)作用。

本研究表明，與其他試驗(yàn)組相比，發(fā)酵蘋果汁能夠顯著降低腹瀉小鼠的稀便率，并且能夠使腹瀉模型小鼠的腸絨毛提高，說明發(fā)酵蘋果汁在一定程度上能夠保護(hù)腸黏膜，促進(jìn)其生長，增加腸道黏液屏障的防御功能，減輕腸黏膜損傷，從而保護(hù)腸道。