徐玉涵，傅彩琦，盧蕾，翟衡，杜遠(yuǎn)鵬*

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018）

我國屬于大陸季風(fēng)性氣候，雨熱同季，因此淹澇是我國夏季主要的自然災(zāi)害。陰雨澇害后經(jīng)常突然放晴又造成強(qiáng)光脅迫。研究表明，淹澇主要影響植物的PSII[1-2]，進(jìn)而加速葉片衰老并減少生物量的積累[3]。強(qiáng)光會造成植物葉片光系統(tǒng)功能的抑制[4]。孫永江等[5]的研究表明，植物在遭受逆境后產(chǎn)生光抑制，此時(shí)疊加強(qiáng)光交互作用后會產(chǎn)生附加效應(yīng)，加劇對植物光系統(tǒng)的傷害。適應(yīng)了弱光環(huán)境的葉片在突然遇到強(qiáng)光環(huán)境后光合受到顯著抑制甚至死亡[6-8]。Eiia等[9]認(rèn)為，植株由淹澇-弱光環(huán)境到強(qiáng)光環(huán)境時(shí)，葉片的光合機(jī)構(gòu)在強(qiáng)光下產(chǎn)生較高水平的活性氧，使植物受到較大的氧化傷害，導(dǎo)致光合機(jī)構(gòu)的光抑制。

田間調(diào)研發(fā)現(xiàn)，淹澇1周內(nèi)葡萄便出現(xiàn)淹澇癥狀。但很多研究者通過模擬淹澇脅迫發(fā)現(xiàn)，植物出現(xiàn)淹澇癥狀的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過田間。李艷等[10]對葡萄進(jìn)行淹水脅迫發(fā)現(xiàn)，在脅迫達(dá)到12 d時(shí)葡萄葉片的葉綠素含量、PSII活性等指標(biāo)才會出現(xiàn)顯著性變化，在淹水前期葡萄葉片的表觀癥狀并沒有發(fā)生顯著性變化。探究原因發(fā)現(xiàn)，田間淹澇一般伴隨雨后連陰天突然放晴的情況，發(fā)生淹澇癥狀的時(shí)間多在放晴后。而試驗(yàn)?zāi)M淹澇一般都在正常光照條件下，由此說明強(qiáng)光能夠加劇陰天淹澇發(fā)生程度，為探討葡萄淹澇后強(qiáng)光對兩個(gè)光系統(tǒng)的影響。本試驗(yàn)以葡萄栽培品種‘極高’為試材，前期弱光下淹澇模擬連續(xù)陰雨天發(fā)生，后期淹澇疊加強(qiáng)光脅迫模擬雨后的強(qiáng)光，研究淹澇后強(qiáng)光對葡萄葉片光合特性響應(yīng)，以期為葡萄淹澇恢復(fù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

試驗(yàn)于2018年8月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站葡萄園基地進(jìn)行，選取葡萄品種‘極高’為試驗(yàn)材料，種植于直徑23.5 cm、高14 cm的塑料花盆中，栽培基質(zhì)為沙：土=1：2。待生長到7～8片葉時(shí)，選取長勢一致的植株16盆，放置于長50 cm、寬40 cm、高50 cm的白箱子中，進(jìn)行淹水至塑料盆上沿，對照8株正常管理。淹澇時(shí)模擬連續(xù)陰雨天氣，放置于室外遮陽網(wǎng)下（采用光強(qiáng)儀測定遮陽網(wǎng)下一天中光照強(qiáng)度為300～400 μmol/(m2·s)），處理第14天開始將淹水處理植株分為等量兩部分，其中8株連同白箱子撤除遮陽網(wǎng)，于第14、15、16天進(jìn)行連續(xù)強(qiáng)光脅迫淹水處理（自然光照，采用光強(qiáng)儀測定遮陽網(wǎng)下一天中光照強(qiáng)度，達(dá)到強(qiáng)光脅迫1400～1600 μmol/(m2·s)的時(shí)間為每天12時(shí)至16時(shí)，總共6 h），其余8株繼續(xù)弱光條件下（遮陰網(wǎng)下）淹水處理。于開始淹澇后的0、3 d、6 d、9 d、14 d、15 d、16 d測定植株中部節(jié)位長勢一致的葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。

1.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

參考邢浩等[11]方法，用連續(xù)激發(fā)式熒光儀（Handy PEA，Hansatech，英國）測定OJIP曲線，包括初始熒光（Fo）、在300 μs時(shí)的熒光（Fk）、在2 ms時(shí)的熒光（Fj）、在30 ms時(shí)的熒光（Fi）、最大熒光（Fm）、PSII最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（Fv/Fm）和PSII潛在活性（Fv/Fo）。測定前葉片預(yù)先暗適應(yīng)15 min，通過對OJIP曲線的分析得出反映PSII供體側(cè)、受體側(cè)及PSII反應(yīng)中心功能的參數(shù)。用Wk=(Fk-Fo)/(Fj-Fo)表示受體側(cè)放氧復(fù)合體受傷害程度；用捕獲的激子將電子傳遞到電子傳遞鏈中QA-下游其他電子受體的概率φEo=(Fm-Fj)/(Fm-Fo)來表示PSII受體側(cè)電子傳遞的功能；用單位面積有活性反應(yīng)中心數(shù)量RC/CSm=Fm×φPo×(Vj/Mo)，表示PSII反應(yīng)中心變化。

參考Klughammer等[12-13]的方法進(jìn)行葉綠素?zé)晒夤忭憫?yīng)曲線的測定。采用Dual-PAM100熒光儀（Walz，德國）進(jìn)行飽和脈沖分析，在人工光源（800 μmol/(m2·s)）下適應(yīng)1 h，測定葉片在穩(wěn)定光源下的熒光參數(shù)，之后測定葉片暗適應(yīng)15 min后的初始熒光產(chǎn)量（Fo）和最大熒光產(chǎn)量（Fm），其中Fv=Fm-Fo。處理結(jié)束后，進(jìn)行熒光光響應(yīng)曲線的測定，照射樣品30 s后打開飽和脈沖光進(jìn)行最大熒光產(chǎn)量（F'm）及光下最大量子產(chǎn)量（P'm）的測量，Pm為最大光氧化P700+。按照如下公式進(jìn)行熒光參數(shù)的計(jì)算。

PSII實(shí)際光化學(xué)效率Y(II)=(F'm-Fs)/F'm。

非調(diào)節(jié)能量耗散的量子產(chǎn)率Y(NO)=1/[NPQ+1+qL(Fm/Fo-1)]。

可調(diào)節(jié)能量耗散的量子產(chǎn)率Y(NPQ)=1-Y(II)-1/[NPQ+1+qL(Fm/Fo-1)]。

PSI的有效量子產(chǎn)率Y(I)=1-Y(ND)-Y(NA)。

PSI供體側(cè)限制引起的非光化學(xué)能量耗散的量子產(chǎn)量Y(ND)=1-P700red。

PSI受體側(cè)限制引起的非光化學(xué)能量耗散的量子產(chǎn)量Y(NA)=(Pm-P'm)/Pm。

PSI激發(fā)能分配系數(shù)α=f/(1+f)，PSII激發(fā)能分配系數(shù)β=1/(1+f)，f=(F'm-Fs)/(F'm-F'o)，用β/α-1表示PSI和PSII間激發(fā)能分配的不平衡性[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 淹澇和強(qiáng)光交互作用下葉片表觀癥狀

淹澇脅迫16 d及淹澇和強(qiáng)光交互作用3 d后葡萄葉片外觀出現(xiàn)明顯的癥狀。在淹澇脅迫前期未表現(xiàn)出明顯的癥狀，至淹澇脅迫處理16 d時(shí)，葉片出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，表現(xiàn)出葉尖、葉緣或葉脈黃化且有輕微的焦枯現(xiàn)象。進(jìn)行淹澇-強(qiáng)光交互作用后，葉片淹澇癥狀顯著加劇，在交互脅迫處理3 d時(shí)，葉緣、葉尖焦枯現(xiàn)象嚴(yán)重，部分葉片出現(xiàn)脫落現(xiàn)象。

2.2 淹澇和強(qiáng)光交互作用對葡萄葉片PSII及PSI的影響

2.2.1 淹澇和強(qiáng)光交互作用對葡萄葉片PSII和PSI活性的影響

PSII最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（Fv/Fm）可以反映PSII受脅迫程度。從圖1A可以看出，淹澇處理3 d就已經(jīng)出現(xiàn)顯著性降低，比對照降低了11%；淹澇脅迫至14 d、16 d時(shí)Fv/Fm分別顯著降低了23.2%、36.5%；淹澇脅迫至14 d后疊加強(qiáng)光脅迫處理進(jìn)一步加劇了Fv/Fm下降幅度，處理至14 d、16 d與對照相比，顯著下降了29.6%、51.1%。

最大光氧化P700+(Pm)可以反映PSI活性。由圖1B可知，淹澇處理3 d，Pm開始降低，但是降低程度不顯著，處理至9 d與對照相比降低了0.7%，未達(dá)到顯著性差異。直至淹澇14 d、16 d時(shí)才與對照出現(xiàn)顯著下降（8.8%、36.7%）；淹澇脅迫至14 d后疊加強(qiáng)光脅迫處理后進(jìn)一步加劇了Pm下降幅度，脅迫至14 d、16 d與對照相比，顯著下降了16.6%、48.8%。說明淹澇至第14天導(dǎo)致‘極高’葉片PSI發(fā)生明顯光抑制，且疊加強(qiáng)光脅迫后加劇了光抑制程度。

圖1 淹澇和強(qiáng)光交互作用對葡萄品種Fv/Fm、Pm的影響Figure 1 Interaction effect of water-logging and high lightstress on Fv/Fm and Pm in grapevine leaves

2.2.2 淹澇和強(qiáng)光交互作用對葡萄葉片PSII供體側(cè)、活性反應(yīng)中心數(shù)量、受體側(cè)的影響

K點(diǎn)相對可變熒光（Wk）表示PSII供體側(cè)放氧復(fù)合體受傷害程度[15]。隨著淹澇處理時(shí)間的增加，Wk值逐漸升高。與對照相比淹澇至14 d、16 d，顯著增加了19.8%、38.6%；淹澇脅迫至14 d后疊加強(qiáng)光脅迫處理進(jìn)一步加劇了其上升幅度，與對照相比，處理至14 d、16 d顯著增加了23.3%、67.5%（圖2A）。表明‘極高’葉片PSII供體側(cè)受到了傷害，疊加強(qiáng)光脅迫后，‘極高’葉片PSII供體側(cè)受到傷害加劇。

淹澇處理第3天時(shí)單位面積有活性反應(yīng)中心數(shù)量（RC/CSo）就比對照出現(xiàn)顯著性降低，淹澇14 d、16 d時(shí)單位面積有活性反應(yīng)中心數(shù)量（RC/CSo）與對照相比降低了24.2%、26.1%；淹澇脅迫至14 d后疊加強(qiáng)光脅迫處理進(jìn)一步加劇RC/CSo下降幅度，與對照相比，處理至14 d、16 d顯著降低了32.7%、45.3%（圖2B）。

由圖3C可知，隨著淹澇脅迫處理時(shí)間的延長，PSII受體側(cè)電子傳遞的效率（φEo）逐漸降低。淹澇至第3天顯著降低，至14 d、16 d，φEo與對照相比，顯著降低了20.3%、30.3%；淹澇脅迫至14 d后疊加強(qiáng)光脅迫處理后下降幅度加劇，處理至14 d、16 d與對照相比顯著降低了25.5%、46.1%。由此說明，淹澇脅迫3 d后就顯著地抑制了PSII光合電子傳遞鏈，淹澇疊加強(qiáng)光脅迫進(jìn)一步抑制了‘極高’葉片PSII光合電子傳遞鏈。

2.3 淹澇和強(qiáng)光交互作用對光系統(tǒng)能量分配及熱耗散的影響

2.3.1 淹澇和強(qiáng)光交互作用對光系統(tǒng)能量分配的影響

淹澇以及淹澇疊加強(qiáng)光脅迫明顯改變了PSII和PSI的能量分配。隨著淹澇時(shí)間增加，PSII實(shí)際光化學(xué)效率Y(II)及不可調(diào)節(jié)的熱耗散Y(NO)逐漸降低（圖3D和3F），可調(diào)節(jié)的熱耗散Y(NPQ)逐漸升高（圖3E），淹澇至第3天便出現(xiàn)顯著性變化。淹澇脅迫至14 d后疊加強(qiáng)光脅迫處理后使得PSII的Y(II)下降速率加劇，Y(NPQ)變?yōu)橄陆第厔?，Y(NO)變?yōu)樯仙厔?，表明PSII活性受到抑制明顯，且疊加強(qiáng)光脅迫后，依賴光保護(hù)的熱耗散機(jī)制并不能耗散掉所有的光能，隨著強(qiáng)光脅迫時(shí)間的延長，過剩光能的比例越來越高，葉片光抑制加劇。

圖2 淹澇和強(qiáng)光交互作用對葡萄葉片供體側(cè)（Wk）、反應(yīng)中心（RC/CSm）及受體側(cè)（φEo）的影響Figure 2 Interaction effect of water-logging and high light stress on donor side (Wk)，reaction center (RC/CSm) and receptor side (φEo) of PSII in grapevine leaves

隨著淹澇至第6天PSI實(shí)際光化學(xué)效率Y(I)及氧化態(tài)P700+顯著降低（圖3A和3C），PSI受體側(cè)在淹澇至第6天受抑制程度便顯著增加（圖3B），淹澇脅迫至14 d疊加強(qiáng)光脅迫處理后，進(jìn)一步加劇了Y(I)及氧化態(tài)P700+降低速率，PSI受體側(cè)受抑制程度加劇。進(jìn)一步表明淹澇疊加強(qiáng)光脅迫導(dǎo)致了PSI光抑制的發(fā)生。

淹澇脅迫第3天，‘極高’葉片PSII和PSI間激發(fā)能分配不平衡性（β/α-1）顯著性增大，淹澇至14 d、16 d時(shí)處理的β/α-1比對照顯著增加了53%、230.6%；淹澇脅迫至14 d疊加強(qiáng)光脅迫處理后，β/α-1上升速率加劇，淹澇疊加強(qiáng)光處理至14 d、16 d分別比對照升高了73.5%和249%（圖4）。

2.3.2 淹澇和強(qiáng)光交互作用對熱耗散的影響

非光化學(xué)淬滅（NPQ）表示PSII天線色素吸收的光能不能用于光合電子傳遞而是通過光保護(hù)途徑以熱的形式耗散掉的光能所占的比例[5,16-17]。從圖5中可以看出，淹澇脅迫至第6天時(shí)，NPQ出現(xiàn)顯著性上升。淹澇脅迫至14 d疊加強(qiáng)光脅迫后NPQ進(jìn)一步顯著上升，表明光系統(tǒng)通過提高熱耗散來進(jìn)行光保護(hù)。

3 討論與結(jié)論

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的細(xì)胞器，對葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行分析能夠反映脅迫條件下植物光合器官的傷害程度。當(dāng)植物吸收的光能超過所能利用的光能時(shí)，過剩光能便會導(dǎo)致光合機(jī)構(gòu)的光抑制，甚至光破壞[18-19]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)淹澇后PSII最大光化學(xué)效率呈線性下降，但在淹澇脅迫后期下降趨勢漸緩。淹澇強(qiáng)光交互作用下，PSII的最大光化學(xué)效率較同時(shí)期單因素淹澇脅迫低，且隨著淹澇強(qiáng)光脅迫時(shí)間的增加，下降顯著。這說明弱光環(huán)境PSII反應(yīng)中心的壓力較小，因此僅僅在淹澇脅迫下，植株開始逐漸適應(yīng)高濕、弱光的環(huán)境，但是突然將植株移至高光強(qiáng)下，對已經(jīng)受到抑制的PSII光合反應(yīng)中心造成壓力，使得過剩激發(fā)能增加，這些能量以電子的形式存在于電子傳遞鏈中并形成活性氧，過量的ROS既能直接破壞PSII[20]，也可以抑制D1蛋白再循環(huán)[21]，最終導(dǎo)致光破壞。

有研究表明，PSII到PSI的電子傳遞速率的降低保護(hù)PSI免受進(jìn)一步的光抑制[22]。但也有研究表明，當(dāng)PSII的活性被抑制至一定程度，PSII到PSI的電子流被嚴(yán)重阻斷，PSI的受體側(cè)無法正常的接受電子，使得PSI的光合作用無法正常完成[23]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，淹澇脅迫對PSI的最大光氧化P700+(Pm)前期影響較小，在處理6 d才出現(xiàn)顯著性影響，淹澇強(qiáng)光交互脅迫處理后，Pm顯著下降。造成這種現(xiàn)象的原因可能有兩方面：一是在淹澇脅迫下，PSII活性受到了抑制，降低了PSII到PSI的電子傳遞速率（圖2C），使得PSI的活性雖然受到了一定程度的抑制，但是影響不顯著。淹澇強(qiáng)光交互作用后，葉片兩個(gè)光系統(tǒng)間激發(fā)能分配不平衡性顯著增加（圖4），PSII活性中心受抑制嚴(yán)重，PSI和PSII的光能分配出現(xiàn)嚴(yán)重失衡，葉片吸收的光能不能有效地從PSII傳遞到PSI，導(dǎo)致由PSII傳遞給PSI的電子大量減少，PSI不能有效的進(jìn)行光合作用；二是在淹澇強(qiáng)光脅迫下，產(chǎn)生大量無法有效利用的光能，這些能量以電子的形式存在于電子傳遞鏈中并形成活性氧，過量的活性氧會攻擊PSI活性中心，抑制PSI的活性。二者協(xié)同作用，造成PSI最大光氧化P700+受到抑制。

圖5 淹澇和強(qiáng)光交互作用對葡萄品種非光化學(xué)淬滅（NPQ）的影響Figure 5 Interaction effect of water-logging and high light stress on non-photochemical quenching (NPQ) in leaves

NPQ表示PSII天線色素吸收的光能不能用于光合電子傳遞，而是通過光保護(hù)途徑以熱的形式耗散掉的光能所占的比例，反映PSII處理過剩光能的能力。因此，NPQ可作為光保護(hù)能量耗散的重要指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果表明，NPQ隨著淹澇及淹澇后強(qiáng)光脅迫時(shí)間的增加不斷上升，說明淹澇強(qiáng)光脅迫下，光系統(tǒng)通過提高熱耗散來進(jìn)行光保護(hù)。且淹澇強(qiáng)光交互脅迫3 d后使得PSII的可調(diào)節(jié)能量耗散的量子產(chǎn)率Y（NPQ）變?yōu)橄陆第厔?，不可調(diào)節(jié)能量耗散的量子產(chǎn)率Y（NO）變?yōu)樯仙厔荩砻餮蜐趁{迫處理的葉片還能通過熱耗散來進(jìn)行自我調(diào)節(jié)，但淹澇強(qiáng)光交互脅迫后，依賴光保護(hù)的熱耗散機(jī)制并不能耗散掉所有的光能，隨著強(qiáng)光脅迫時(shí)間的延長，過剩光能的比例越來越高，葉片光抑制加劇。

綜上所述，淹澇脅迫使葡萄葉片光系統(tǒng)II和光系統(tǒng)I的活性產(chǎn)生了抑制作用；葡萄葉片在淹澇過程中受到強(qiáng)光照射后，強(qiáng)光導(dǎo)致了PSII的光抑制和反應(yīng)中心失活，進(jìn)一步加劇了PSI的抑制。