薛 艷 龐曉林 何 軍 楊永濤 關 圓 張東亞

（1清華大學臨床醫(yī)學院麻醉疼痛學，北京100083；2清華大學第一附屬醫(yī)院麻醉疼痛科，北京100016）

膝關節(jié)骨關節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA)是以關節(jié)的疼痛、僵硬腫脹，甚至功能喪失為臨床表現(xiàn)的一種慢性退行性疾病，其危險因素包括老年、肥胖、創(chuàng)傷、過度使用及遺傳易感性等[1～3]。我國目前骨關節(jié)炎總患病率已達到27.18%[4]，其中KOA的患病率約為 18%，并且女性 KOA 患病率顯著高于男性[5]。該疾病為患者帶來了極大的痛苦和不便，嚴重降低其生活質量[6]，因此，防治KOA是社會必要的需求，具有重要的社會價值。大多數(shù)研究認為醫(yī)用臭氧關節(jié)腔內注射治療KOA療效顯著，且治療時間為4周[7]，但未有研究表明是否治療時間越長，其治療效果越好。目前，國內外文獻中未見通過對臭氧治療不同時間進行分組治療KOA的研究。本實驗通過擬用不同治療療程的醫(yī)用臭氧關節(jié)腔內注射對KOA家兔進行干預，觀察不同治療時間醫(yī)用臭氧關節(jié)腔內注射治療KOA，對關節(jié)液中SOD及關節(jié)軟骨的影響，探討臭氧治療時間與KOA療效的關系。

方 法

1.實驗動物及分組

30只健康新西蘭實驗家兔（普通級），體重2.0～2.5 kg，購自芳元緣實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（京）2014-0012]。進入實驗室后適應性喂養(yǎng)3天，單籠單兔喂養(yǎng)，保持室溫23～25℃，相對濕度40%～60%，通風。利用抽簽法將家兔隨機分為正常組對照組(N)、模型組對照組(M)、2周臭氧治療組(O3-2)、4周臭氧治療組(O3-4)、6周臭氧治療組(O3-6)，每組6只。

2.實驗儀器

臭氧生成儀（CHY-31T，山東淄博悅華醫(yī)療器械有限公司）；兔子雙足平衡支撐力測量儀（YLS-11A，北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司）；超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）試劑盒（北京方程生物科技有限公司）。

3.實驗方法

N組正常飼養(yǎng)，不做模型手術；M組、O3-2組、O3-4組及O3-6組采用經(jīng)典Hulth改良法[8]制作KOA模型：麻醉后，于兔左側膝關節(jié)中內側做長約1 cm的縱行皮膚切口，摘除內側半月板、切斷內側副韌帶及前交叉韌帶。術中避免損傷關節(jié)軟骨面，術后連續(xù)三天抗生素抗感染治療，術后一周開始驅趕動物活動30 min，連續(xù)12周。3個月后O3-2組、O3-4組及O3-6組兔左膝關節(jié)腔內注射20 μg/ml臭氧，每次2 ml，每周1 次，分別注射2周、4周及6周。

4.取材

N組與M組3個月后麻醉藥物過量處死家兔，O3-2組、O3-4組及O3-6組分別于末次治療后3天處死。處死后，抽取1ml生理鹽水注入家兔左膝關節(jié)腔，充分活動膝關節(jié)后抽取關節(jié)灌洗液，測定SOD OD值。再解剖左膝關節(jié)，首先觀察軟骨形態(tài)學變化，然后切開取股骨內側髁軟骨及軟骨下骨，標本進行固定、脫鈣、石蠟包埋及切片后，行HE及甲苯胺藍(Toluidine blue, TB)染色，并且行Mankin's評分[9]。

5.檢測和評價兔膝關節(jié)功能變化

每次取材前觀察并記錄局部疼痛刺激反應、步態(tài)改變、關節(jié)活動度、關節(jié)腫脹程度。用“測定雙足平衡設備”檢測臭氧治療前（即第一次注射臭氧前）與治療后（即處死前）兔雙側后足分別承重情況[10]。

6.病理觀察及Mankin's評分

肉眼觀察關節(jié)軟骨表面是否光滑，有無糜爛、潰瘍及骨贅形成；HE染色觀察軟骨表面是否光滑，軟骨細胞排列是否規(guī)則、軟骨細胞數(shù)量變化、軟骨表層纖維成分變化、潮線是否完整等；TB染色觀察ECM的著色深淺。使用Mankin's評分評估軟骨損傷情況，分數(shù)越高說明軟骨損傷越重。

7.Elisa法檢測關節(jié)液SOD的表達

每份關節(jié)灌洗液稀釋后，分別采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD OD值，根據(jù)試劑盒提供的說明書進行操作。

8.統(tǒng)計學分析

應用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理并做統(tǒng)計分析，統(tǒng)計描述以均數(shù)±標準差()表示，SOD OD值測量及Mankin's評分采用單因素方差分析(ANOVA)檢驗，雙足平衡支撐力測量組間比較采用ANOVA檢驗，組內采用配對樣本t檢驗。P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.外部觀察評價兔膝關節(jié)功能

N組正?；顒?，無明顯跛行及關節(jié)腫脹；M組與O3-2組均出現(xiàn)明顯跛行、關節(jié)活動度明顯受限、關節(jié)腫脹及局部疼痛刺激較為強烈；O3-4組與O3-6組患肢局部對疼痛刺激反應弱，輕微腫脹，活動時輕度跛行。

2.雙足平衡支撐力評價兔膝關節(jié)功能

治療前O3-6、O3-4、O3-2、M與N組相比，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜ 0.01)；O3-6組治療前后相比差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P＜ 0.01)，O3-4組治療前后比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜ 0.05)，O3-2組治療前后比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞ 0.05)；治療后O3-6、O3-4與O3-2組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜ 0.01)，但治療后O3-6、與O3-4組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞ 0.05)。醫(yī)用臭氧治療KOA至少4周以上，但不能表明治療時間越長，效果越好（見表1）。

3.病理觀察及Mankin's評分

肉眼觀：N組，關節(jié)軟骨表 面光滑，無裂紋、糜爛及潰瘍形成，軟骨邊緣無骨贅形成；M組，關節(jié)軟骨表面粗糙，可見糜爛及潰瘍形成，內側髁邊緣可見骨贅形成；O3-2組，關節(jié)軟骨表面可見糜爛及潰瘍形成，軟骨邊緣可見骨贅形成；O3-4組與O3-6組大體觀察：軟骨表面尚光滑，少見糜爛、潰瘍，骨贅形成。

表1 各組兔治療前后左膝關節(jié)支撐力占雙下肢的比例(n = 6,)

表1 各組兔治療前后左膝關節(jié)支撐力占雙下肢的比例(n = 6,)

**P ＜ 0.01，與 N 組相比較；#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01，與同組治療前相比較；&&P ＜ 0.01，與治療后O3-2組相比較

組別 左下肢支撐力比例（%）治療前 治療后O3-6 33.59±3.63## 47.70±1.03##&&O3-4 35.09±2.21** 45.31±2.61**#&&O3-2 37.10±3.47** 39.91±2.83 M 37.10±3.47**N 50.36±0.90

光鏡下HE染色：N組（見圖1A），軟骨表面光滑，細胞排列整齊，軟骨四層結構清晰，無裂隙；M組（見圖1B）軟骨表面粗糙不規(guī)則，四層結構紊亂，軟骨層變薄，軟骨細胞顯著減少、排列不規(guī)則，可見大量纖維軟骨細胞及成簇樣細胞形成，細胞外基質分解，潮線不完整，大量血管翳形成；O3-2組（見圖1C），軟骨表面粗糙不規(guī)則，軟骨四層結構嚴重紊亂，大量纖維軟骨細胞形成，細胞外基質分解，未見明顯潮線，可見血管翳形成；O3-4組（見圖1D），軟骨表面較規(guī)則，四層結構尚清晰，軟骨細胞數(shù)量減少，細胞排列較整齊，可見細胞輕度增生，軟骨纖維成分均較模型組及O3-2組少，少量軟骨細胞增生，潮線基本完整；O3-6組（見圖1E），軟骨表面較光滑，四層結構較清楚，軟骨細胞數(shù)量輕微減少，少量軟骨纖維細胞形成，潮線較完整。

光鏡下TB染色：N組（見圖2A），ECM著色正常，且均勻著色；M組（見圖2B），ECM著色中至重度降低，著色不均勻或部分不著色；O3-2組（見圖2C），ECM著色明顯降低，且著色不均勻，部分不著色；O3-4組（見圖2D），ECM著色輕度降低，著色較不均；O3-6組（見圖2E），ECM著色較正常，著色較均勻。

根據(jù)關節(jié)軟骨病理切片HE及TB染色行Mankin's評分，M組與O3-2組軟骨細胞明顯分裂增生，細胞排列紊亂，潮線模糊，甚至可見血管通過，Mankin's評分差異無統(tǒng)計學意義；O3-4與O3-6組軟骨細胞排列稍紊亂，輕度分裂增生，潮線不完整，無明顯血管通過及血管翳形成，Mankin's評分差異無統(tǒng)計學意義，且較接近正常（N組）；O3-6和O3-4組與O3-2組相比差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01，見表2）。

4.醫(yī)用臭氧治療后關節(jié)灌洗液SOD OD值

O3-6與N組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜ 0.01)；O3-4與N組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜ 0.05)；O3-2與N組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜ 0.01)，但O3-2較N組明顯降低；M與N組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞ 0.05)。O3-6與M組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜ 0.01)；O3-4與M組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞ 0.05)；O3-2與M組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜ 0.01)，但O3-2較N組明顯降低。O3-6和O3-4與O3-2組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜ 0.01)，O3-6與O3-4組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜ 0.05)。醫(yī)用臭氧治療KOA至少4周以上且治療時間越長，該結果表明治療時間越長，SOD生成越多（見表3）。

討 論

KOA是最常見的慢性退行性疾病，已嚴重威脅老年人的健康，其致殘率高，導致患者日?；顒用黠@受限。傳統(tǒng)的治療方法如康復鍛煉、止痛、消炎、理療、針灸等，都只能暫時緩解疼痛癥狀，不能控制疾病的進展[11,12]； Skou和柯雪茹等[13,14]研究表明，人工全膝關節(jié)置換術后大約20%～30%的患者在疼痛、殘疾及生活質量方面幾乎或根本沒有改善，相當一部分患者甚至會患上慢性疼痛。而注射治療因其全身副作用小較多應用于臨床。常見的注射治療法包括玻璃酸鈉和醫(yī)用臭氧注射治療，玻璃酸鈉注射治療效果顯著，但其價格昂貴，治療周期較長。近幾年來醫(yī)用臭氧作為一種非藥理性的治療方法已廣泛應用于KOA的臨床治療[7,15～17]，且療效確切。

KOA患者的正常力學軸位發(fā)生改變，使關節(jié)的最大壓力承受部位由外側脛骨平臺轉移至內側脛骨平臺，導致內側關節(jié)軟骨所承受壓力劇增，再加上去除內側半月板，使關節(jié)軟骨面之間失去緩沖，直接接觸相互摩擦，從而使軟骨發(fā)生變形損傷。本實驗應用經(jīng)典Hulth改良法，通過改變膝關節(jié)的正常力學軸位而制模，該法制模穩(wěn)定性好[8]。本實驗結果顯示臭氧關節(jié)腔內注射治療KOA可緩解疼痛、改善膝關節(jié)功能。醫(yī)用臭氧關節(jié)腔內注射治療4周及6周后，關節(jié)的雙足平衡支撐力、關節(jié)軟骨病理變化及Mankin's評分均無顯著性差異，提示臭氧治療4周及6周療效相當。但與臭氧治療2周及模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義，且臭氧治療2周與模型組相比無顯著差異，提示臭氧治療2周療效差，至少治療4周以上才有顯著療效。

KOA的發(fā)病因素很多，而細胞外基質(Extracellular Matrix, ECM)的合成與分解代謝的失平衡是OA產(chǎn)生的主要原因之一[12,18]。膝關節(jié)是由軟骨、軟骨下骨、韌帶、滑膜、肌肉等許多不同的組織組成的生物力學器官，這些組織的ECM提供了他它們的結構和形式，并定義了他們的生物力學特性[19]。KOA患者關節(jié)軟骨及滑液中含有大量的細胞因子[20]，當中性粒細胞受到免疫復合物、補體等攻擊時，釋放出活性氧(ROS)、NO及超氧化物陰離子(O2-)等氧自由基，這些氧自由基含有未配對的電子，形成活潑的羥自由基[21]，打破機體氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)平衡。羥自由基可激活金屬蛋白酶(Metal Matrix Proteinase, MMP)，同時 IL-1、TNF-α 等炎性細胞因子也可通過刺激軟骨細胞和滑膜成纖維細胞產(chǎn)生MMP，MMP通過降解ECM的重要成分蛋白多糖、骨黏連蛋白、膠原蛋白及軟骨基底膜聚糖，加速軟骨細胞的衰老與凋亡，導致細胞不能有效地對正常的負荷機制作出反應[22]。但有研究表明，KOA可通過刺激機體產(chǎn)生抗氧化酶，如SOD、過氧化氫酶和谷胱甘肽等[11]，對抗大量氧自由基，以減輕氧自由基對軟骨的損傷。醫(yī)用臭氧不僅可以對抗白細胞產(chǎn)生的細胞因子引發(fā)的炎癥反應，也可通過誘導合成SOD、過氧化氫酶等抗氧化酶抑制氧化應激反應[16]，從而改善膝關節(jié)功能，延緩病情的進展。這一機制符合關節(jié)自我修復過程，并能促進修復。

圖1 關節(jié)軟骨病理切片HE染色

圖2 關節(jié)軟骨病理切片TB染色

表2 各組兔關節(jié)軟骨Mankin's評分(n = 6,)

表2 各組兔關節(jié)軟骨Mankin's評分(n = 6,)

*P ＜ 0.05，與 O3-2組相比較

組別 Mankin's評分O3-6 4.00±0.63*O3-4 4.33±0.52*O3-2 12.67±1.37 M 12.83±0.98

表3 各組兔關節(jié)灌洗液SOD OD值(n = 6,)

表3 各組兔關節(jié)灌洗液SOD OD值(n = 6,)

**P ＜ 0.01，與N組相比較； ##P ＜ 0.01，與M組相比較；&&P ＜ 0.01，與O3-2組相比較；△△P ＜ 0.01，與O3-4組相比較；

images/BZ_32_365_2129_502_2193.png)O3-6 0.303±0.013**##&&△O3-4 0.283±0.012*&&O3-2 0.196±0.026**##M 0.262±0.010 N 0.250±0.016組別 SOD OD值(

本研究結果表明，醫(yī)用臭氧關節(jié)腔內注射治療4周及6周后，關節(jié)液SOD顯著較M組升高，說明醫(yī)用臭氧可激活機體抗氧化系統(tǒng)，誘導SOD抗氧化酶的生成，對抗KOA產(chǎn)生的過多的氧自由基，減少細胞質膠原蛋白裂解，抑制MMP的形成，進而減少對膝關節(jié)軟骨的損傷，同時也可以使間質細胞和關節(jié)軟骨合成增多，刺激軟骨進而纖維原細胞增殖，起到一定的修復作用，與先前研究結果一致[21]。且O3-6組較O3-4組升高(P＜ 0.05)，說明臭氧治療時間越長，療效越顯著。M組關節(jié)液SOD含量較正常組升高，但醫(yī)用臭氧治療2周后關節(jié)液SOD含量較M組顯著降低，導致出現(xiàn)該結果的原因可能是正常膝關節(jié)液含有少量SOD，KOA的形成可短期內誘導SOD抗氧化酶產(chǎn)生以對抗氧自由基，臭氧治療2周可能無法有效激活機體抗氧化系統(tǒng)，并且隨著病程延長SOD逐漸消耗，同時氧自由基不斷增多，激活更多的MMP[11]，因此會出現(xiàn)臭氧治療2周時關節(jié)液SOD反而下降的現(xiàn)象；另外，臭氧本身也屬于一種強氧化劑，也可能因為短時間臭氧治療對軟骨的損傷作用大于治療作用。

從目前研究得出，短療程醫(yī)用臭氧治療KOA未見明顯治療效果，是否具有損傷作用需進一步研究，下一步可通過在正常家兔膝關節(jié)注射臭氧，評估臭氧對關節(jié)軟骨是否有損傷作用。臭氧治療KOA應不少于4周，并且我們認為隨著治療時間越長效果可能會越好，但從O3-6組與O3-4組的Mankin's評分及雙足平衡支撐力占比的結果比較，兩組間差異無統(tǒng)計學意義，分析原因可能因為樣本量較小所致，下一步可通過增加樣本量或延長治療時間探討醫(yī)用臭氧治療時間對KOA的影響。

綜上所述，醫(yī)用臭氧關節(jié)腔內注射治療KOA不少于4周時，對修復關節(jié)損傷、改善膝關節(jié)功能具有顯著療效，在臨床上對醫(yī)用臭氧注射治療KOA的最佳療程具有指導意義。