謝開會，王 偉，楊姣姣，閆尊強，楊巧麗，滾雙寶,

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，蘭州 730070；2. 甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬工程技術研究中心，蘭州 730070)

干擾素(Interferon，IFN)是由宿主細胞對病原體如腫瘤細胞、病毒、細菌等作出反應而產(chǎn)生的一組信號蛋白[1]。根據(jù)其結構和來源不同可分為3種：I 型、Ⅱ 型和 Ⅲ 型[2]，I型(病毒干擾素)包括IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-ω、IFN-κ、IFN-ε、IFN-ζ和IFN-τ；Ⅱ型(免疫干擾素)為IFN-γ；Ⅲ 型為IFN-λ，豬干擾素(Porcine interferon, PoIFN)包括 IFN- α、IFN-β、IFN-ω、IFN-ε、IFN-δ和 IFN- γ。

β型干擾素(Interferon-beta, IFN-β)主要由上皮細胞和成纖維細胞在病毒或其他類型外來核酸的作用下產(chǎn)生[3]。IFN-β具有多種生物學功能：①免疫調(diào)節(jié)，IFN-β能夠增強MHC Ⅰ類分子表達，但抑制MHC Ⅱ類分子表達，而IFN-γ可促進 MHC Ⅱ類分子表達，兩種干擾素相互協(xié)同，使機體的免疫應答狀態(tài)達到最佳[4]；②抗腫瘤，有研究發(fā)現(xiàn)，IFN-β對多發(fā)性骨髓瘤[5]、肝細胞癌[6]、人腎上腺皮質(zhì)癌[7]等多種惡性腫瘤具有明顯的抑制和殺傷作用； ③抗病毒，PoIFN-β對豬偽狂犬病病毒(PRV)[8]、水泡性口炎病毒(VSV)、口蹄疫病毒(FMDV)[9]和豬傳染性胃腸炎病毒[10]有一定的抑制作用。目前，IFN-β基因已在虎[11]、犬[12]、雞[13]和水貂[14]等動物上成功克隆，并且在一些豬品種(從江香豬[15]、新興豬[16]、巴馬豬[17]、梅山豬[18]和長白豬[19])上也成功克隆，這些研究表明不同物種的IFN-β性質(zhì)和結構有所不同，且在不豬種中IFN-β的性質(zhì)、結構及氨基酸序列有微小差異，這些差異可能與豬的抗病性強弱有關。

合作豬又稱蕨麻豬，其特有的基因型是其他豬種所不具備的，是中國重要的遺傳多樣性基因資源庫。目前，關于合作豬的研究主要集中在肉質(zhì)方面，李富強等[20]成功克隆了合作豬IFN-γ基因，但IFN-β基因在合作豬上鮮有研究。因此，本研究以合作豬耳組織cDNA為模板，克隆IFN-β基因的編碼區(qū)，通過生物信息學方法，分析IFN-β蛋白的理化性質(zhì)、二級結構、三級結構及物種間的同源性和進化關系，為深入研究豬IFN-β基因的生物學活性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品 采集合作豬耳組織樣本，液氮速凍，-80 ℃超低溫冰柜保存。

1.1.2 主要試劑 反轉錄試劑盒(6210A)和pMD19-T Vector購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209-02)和2×TaqMaster Mix、DH5α感受態(tài)細胞購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計與合成 在 NCBI/ GenBank中獲得豬IFN-β基因(登錄號：NM_001003923.1)序列，并用DNAMAN對基因編碼區(qū)設計引物，F(xiàn)：5′-ATGGCTAACAAGTGCATCCTC-3′；R：5′-CAGTTCCGGAGGTAATCTGTA-3′，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 RNA提取及反轉錄 利用Trizol/氯仿法提取樣本的總RNA，并測定其OD值和質(zhì)量濃度。參照反轉錄試劑盒(6210A)說明書將RNA 反轉錄為cDNA，-20 ℃保存，備用。

1.2.3 PCR擴增 PCR反應體系20 μL：cDNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，2×TaqMaster Mix 10 μL，無菌水6 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s， 72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃終延伸 10 min，4 ℃保存。

1.2.4 基因克隆及測序 PCR 產(chǎn)物經(jīng) 10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(180 V，35 min)。按照 DP209-02 凝膠回收試劑盒操作說明書，對目的片段進行回收純化。將純化產(chǎn)物與 pMD19-T載體相連接，連接產(chǎn)物轉入DH5α感受態(tài)細胞上，反應完成后，將菌液均勻涂抹于含有氨芐青霉素(AMP+)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)和異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取白色單菌落，加入到含有AMP+的100 mL LB液體培養(yǎng)基中，搖菌10 h，吸取 2 μL 用于菌液PCR，將菌液PCR產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1.2.5IFN-β基因生物信息學分析 利用多種在線軟件和數(shù)據(jù)庫對克隆測序得到的IFN-β基因編碼區(qū)序列進行分析(表1)；在NCBI/ GenBank中下載一些物種IFN-β的核酸序列：人(NM_002176)、家鼠(NM_010510)、牛(NM_174350)、獼猴(NM_001135795)、黑猩猩(XM_528553)、狗(NM_001135787)馬(M14546)、疣豬(JN391529)、梅山豬(AY687281)和巴馬豬(KJ147517.1)，用MEGA 7.0軟件構建系統(tǒng)進 化樹。

表1 預測蛋白質(zhì)結構和功能應用的網(wǎng)站及軟件Table 1 Websites and softwares for predicting protein structure and function

2 結果與分析

2.1 合作豬 IFN-β基因PCR擴增

以合作豬耳組織cDNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得特異性條帶約 561 bp (圖1)，與預期目的片段相符合。

M.DNA分子質(zhì)量標準(DL2000) DNA molecular mass standard(DL2000); 1.IFN-β基因PCR產(chǎn)物 PCR products ofIFN-βgene

圖1 合作豬IFN-β基因PCR擴增結果電泳圖
Fig.1 Electrophoretogram ofIFN-β
gene in Hezuo pig by PCR

2.2 測序結果分析

經(jīng)克隆測序后獲得合作豬IFN-β基因完整的CDS 區(qū)序列，長度為561 bp，編碼186個氨基酸。該序列與參考序列的同源性為99.82%，且CDS區(qū)第177位點處的C突變?yōu)門(圖2)，但其編碼氨基酸沒有發(fā)生改變，為同義突變。

2.3 合作豬 IFN-β基因生物信息學分析

2.3.1 合作豬IFN-β基因同源性分析 使用Blast軟件分析合作豬IFN-β基因的同源性，結果如表2所示。使用MEGA 7.0軟件以合作豬、梅山豬、疣豬、牛和馬等的IFN-β核酸序列構建分子進化樹。結果顯示，合作豬與梅山豬的親緣關系最近，其次為巴馬豬和疣豬(圖3)。

圖2 合作豬IFN-β核苷酸序列與參考序列比對Fig.2 Comparison of IFN-β nucleotide sequence in Hezuo pig and reference sequence

物 種Species 核酸序列相似性Nucleic acid sequence similarity氨基酸序列相似性Amino acid sequence similarity人 Homo sapiens(NM_002176)77.8864.71家鼠 Mus musculus(NM_010510)-46.24牛 Bos taurus(NM_174350)77.9859.68獼猴 Macaca mulatta(NM_001135795)77.8665.24黑猩猩 Pan troglodytes(XM_528553)77.7064.71狗 Canis lupus(NM_001135787)78.6462.37馬 Equus caballus(M14546)80.7166.13疣豬 Phacochoerus africanus(JN391529)98.7599.46梅山豬 Meishan pig(AY687281)99.82100巴馬豬 Bama pig(KJ147517.1)99.4798.39

圖3 IFN-β系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of IFN-β

2.3.2 合作豬IFN-β基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析 用ProtParam軟件預測合作豬IFN-β蛋白的理化性質(zhì)，結果顯示合作豬IFN-β蛋白由186個氨基酸組成，分子式為C980H1551N253O289S14，分子質(zhì)量為21.95 ku ，理論等電點(PI)為4.93，消光系數(shù)(γ=280 nm)為 23 170，不穩(wěn)定系數(shù)為62.91，在哺乳動物網(wǎng)織紅細胞中的半衰期為 30 h，平均疏水性為 -0.172，說明該蛋白是不穩(wěn)定的酸性親水蛋白。氨基酸殘基中亮氨酸 (14.00%)和谷氨酸(9.10%)含量較高(圖4)，帶負電荷的天冬氨酸殘基(Asp) 和谷氨酸殘基(Glu)為25個，帶正電荷的精氨酸殘基(Arg)和賴氨酸殘基(Lys)為18個。

圖4 合作豬IFN-β蛋白中各氨基酸的組成Fig.4 Composition of various amino acids in IFN-β protein of Hezuo pig

2.3.3 合作豬IFN-β基因編碼蛋白親水性/疏水性分析 利用ProtScale軟件對合作豬IFN-β的親/疏水性進行分析，結果顯示大部分氨基酸為負值，親水性氨基酸為62.90%，疏水性氨基酸為37.10%，第9和10位氨基酸分值最高為2.567，第71位氨基酸分值最低為 -2.422(圖5)。

2.3.4 合作豬IFN-β基因編碼蛋白跨膜結構域分析 使用TMHMM Server v.2.0分析合作豬IFN-β蛋白跨膜區(qū)域，結果顯示，該蛋白有1個跨膜區(qū)域，屬于跨膜蛋白(圖6)。

2.3.5 合作豬IFN-β基因編碼蛋白信號肽分析 利用SignalP 4.1進行信號肽預測，結果顯示，信號肽酶切位點分值(C)為0.796，剪切位點分值(Y)為0.838，信號肽(S)分值為0.947，S>0.5，說明該蛋白含有信號肽，前21個氨基酸為信號肽序列(圖7)。

圖5 合作豬IFN-β蛋白的疏水性Fig.5 Hydrophobicity of IFN-β protein in Hezuo pig

圖6 合作豬IFN-β蛋白的跨膜區(qū)域Fig.6 Transmembrane domain of IFN-β protein in Hezuo pig

圖7 合作豬IFN-β蛋白的信號肽Fig.7 Signal peptide of IFN-β protein in Hezuo pig

2.3.6 合作豬IFN-β基因編碼蛋白結構域分析 采用SMART軟件對合作豬IFN-β蛋白進行分析。結果表明，該蛋白在58～174位氨基酸處存在一個IFabd結構域(圖8)。

圖8 IFN-β 的 SMART 結構預測Fig.8 Structural prediction of IFN-β in SM ART

2.3.7 合作豬IFN-β基因編碼蛋白亞細胞定位 采用PSORT II軟件對合作豬IFN-β蛋白進行亞細胞定位。結果表明，合作豬IFN-β蛋白分布在細胞外、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和囊泡的可能性分別為66.70%、11.10%、11.10%和11.10%。

2.3.8 合作豬IFN-β基因編碼蛋白二級結構分析 采用SOPMA在線軟件對合作豬IFN-β蛋白的二級結構進行預測，結果表明，合作豬IFN-β蛋白的二級結構由75.81%的α-螺旋、1.61%的伸展鏈、2.69%的β-轉角和19.89%的無規(guī)則卷曲構成(圖9)。

h.α- 螺旋 Alpha helix;e.伸展鏈V Extend strand;t.β- 轉角 Beta bridge;c.無規(guī)則卷 Random coil

2.3.9 合作豬IFN-β基因編碼蛋白三級結構預測分析 采用在線軟件 SWISS-MODEL 對合作豬IFN-β蛋白進行同源建模，預測其三級結構。結果顯示，該蛋白的三級結構主要由 α-螺旋、無規(guī)則卷曲構成(圖10)，與二級結構預測基本 一致。

3 討 論

干擾素是一類能誘導動物細胞產(chǎn)生多種廣譜抗病毒蛋白的細胞因子，具有阻止病毒繁殖、調(diào)節(jié)機體免疫反應等生物學功能[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，在干擾素中，IFN-β對重癥急性呼吸綜合征(SARS)病毒抑制效果最強，治療效果更好[22]。IFN-β還可以抑制甲型流感病毒的增殖，感染細胞的初期使用 IFN-β，能誘導細胞產(chǎn)生 IFN-α，間接地增強細胞抵御病毒進一步感染的能力[23]，可以作為一種良好的生物制劑。本研究以合作豬耳組織的cDNA為模板，克隆測序得到其IFN-β基因的CDS區(qū)，序列全長為561 bp，編碼186個氨基酸，與參考序列(登錄號：NM_001003923.1)基本一致，合作豬IFN-β僅在CDS區(qū)的第177位點處發(fā)生突變(C→T)，而其編碼氨基酸沒有發(fā)生改變，屬于同義突變，這表明IFN-β的核酸序列和氨基酸序列在不同品系豬中具有高度的保守性。

本研究中，生物信息學分析結果表明，合作豬IFN-β蛋白包括含有21個氨基酸殘基的信號肽序列和165個氨基酸殘基的成熟多肽序列，這與已經(jīng)證實的豬IFN-β信息一致[24]。分子質(zhì)量為21.95 ku，與已克隆巴馬豬的分子質(zhì)量(22 ku)基本一致，但低于人IFN-β的分子質(zhì)量(23 ku)，理論等電點(PI)為4.93，為酸性蛋白。蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為62.91，大于40，屬于不穩(wěn)定蛋白。疏水性分析發(fā)現(xiàn)，IFN-β蛋白中親水性氨基酸為 62.90%，疏水性氨基酸為37.10%，在維持蛋白質(zhì)三級結構中起重要作用。該蛋白在58～174位氨基酸處存在一個結構域：IFabd (Interferon alpha, beta and delta) 結構域，該結構域是IFN家族的特征結構域，為細胞因子受體結合區(qū)域，其通過與細胞表面的受體相互作用調(diào)節(jié)細胞活性，激活各種信號通路，參與抗病毒和免疫調(diào)節(jié)反應[25]。同源性比對發(fā)現(xiàn)，合作豬IFN-β的核酸序列與巴馬豬、梅山豬和疣豬的同源性為99.47%、99.82%和98.75%，氨基酸序列的同源性為 98.39%、100%和99.46%，合作豬IFN-β的第13、43和68位氨基酸分別為甲硫氨酸(Met)、谷氨酸(Glu)和脯氨酸(Pro)，巴馬豬的第13、43和68位氨基酸分別為纈氨酸(Val)、甘氨酸(Gly)和絲氨酸(Ser)，說明不同豬種的IFN-β有微小差異，這些差異是否決定豬的抗病性強弱，還需深入研究。有研究發(fā)現(xiàn)，人IFN-β第42位或43位谷氨酸發(fā)生突變時，使IFN-β 部分或全部功能喪失[26]，而且Glu 43 被認為是重要功能抗原表位的一部分。本研究分析發(fā)現(xiàn)合作豬IFN-β蛋白序列的第43位為Glu，再次證明IFN-β在免疫反應中發(fā)揮重要作用。分子進化樹也表明，合作豬與梅山豬親緣關系最近，與家鼠親緣最遠，說明IFN-β具有種屬特異性。IFN-β在蛋白結構上屬于螺旋型細胞因子家族成員，這與合作豬IFN-β蛋白三級結構預測結果基本一致，其主要包含5個α-螺旋 (75.81%)。

干擾素是第一個被克隆化，并用與臨床疾病治療的細胞因子[27]。有關研究表明，將細胞因子與保護性抗原基因共表達而研制成的基因工程制劑，是提高機體免疫效果，抑制病毒在機體內(nèi)表達的有效手段之一[28]。本研究對合作豬IFN-β基因的編碼區(qū)進行克隆和序列分析，為進一步研究IFN-β基因的生物活性奠定基礎，同時對研究IFN-β在豬免疫系統(tǒng)和抗病毒方面的影響具有重要價值。

4 結 論

本研究發(fā)現(xiàn)合作豬IFN-β基因CDS區(qū)全長為561 bp，編碼186個氨基酸，編碼蛋白屬于干擾素ab超家族，是不穩(wěn)定的酸性親水性蛋白，含有信號肽和跨膜區(qū)，屬于分泌蛋白。