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        亞臨界基質(zhì)萬(wàn)壽菊殘?jiān)卸喾雍忘S酮超聲波輔助提取研究

        2019-11-20 03:53:10郭耀東任嘉瑜胡莎莎
        關(guān)鍵詞:萬(wàn)壽菊殘?jiān)?/a>黃酮

        郭耀東,任嘉瑜,胡莎莎

        (1.商洛學(xué)院 健康管理學(xué)院,陜西商洛 726000;2.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院,陜西商洛 726000)

        萬(wàn)壽菊(Tagetesspp.)為菊科萬(wàn)壽菊屬、1a生草本植物,花色鮮艷并富含葉黃素、多酚、黃酮等多種生物活性物質(zhì)[1-3]。具有較強(qiáng)的觀(guān)賞價(jià)值、藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2,4-6]。近年來(lái),隨著中國(guó)各地大力實(shí)施產(chǎn)業(yè)扶貧和鄉(xiāng)鎮(zhèn)振興戰(zhàn)略,萬(wàn)壽菊種植面積和產(chǎn)量不斷擴(kuò)大。由此形成的萬(wàn)壽菊加工業(yè)也已成為帶動(dòng)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展、實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)脫貧的支柱產(chǎn)業(yè)。目前萬(wàn)壽菊加工主要以發(fā)酵、干燥、制備萬(wàn)壽菊顆粒,提取脂溶性葉黃素為主,提取工藝主要為有機(jī)溶劑浸提[7]、酶法輔助提取[8]以及超臨界CO2輔助提取[9]等。亞臨界提取技術(shù)以提取溫度低、效率高、生物活性成分損失少并易于規(guī)?;a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),已成為萬(wàn)壽菊葉黃素提取制備的主要工藝[10-11]。

        萬(wàn)壽菊提取制備葉黃素后的副產(chǎn)物-萬(wàn)壽菊殘?jiān)腥院休^為豐富的多酚、黃酮等水溶性活性物質(zhì),具有較好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[3,12]。本研究以亞臨界提取葉黃素后的萬(wàn)壽菊殘?jiān)鼮檠芯繉?duì)象,利用超聲波輔助提取技術(shù),通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析,對(duì)超聲波提取萬(wàn)壽菊殘?jiān)卸喾雍忘S酮工藝進(jìn)行優(yōu)化,獲得萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾?、黃酮最優(yōu)提取工藝,為實(shí)現(xiàn)萬(wàn)壽菊資源多元化綜合利用、提升整個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈附加值提供一定技術(shù)參考。

        1 材料與方法

        1.1 主要試驗(yàn)材料和試劑

        亞臨界提取葉黃素后萬(wàn)壽菊殘?jiān)申兾魃ヌ烊恢破酚邢薰咎峁?。蘆丁、沒(méi)食子酸標(biāo)品,購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;無(wú)水乙醇、鹽酸等均為分析純,購(gòu)于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

        1.2 主要儀器設(shè)備

        750T型多功能粉碎機(jī),永康市鉑歐五金制品有限公司;ME204型電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UPR-HW-40L型超純水機(jī),優(yōu)普儀器設(shè)備公司;KQ-500D型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;UV-2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),島津儀器(蘇州)有限公司。

        1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

        1.3.1 單因素試驗(yàn) 以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度、提取功率、提取次數(shù)為單因素,分析超聲波輔助各因素對(duì)萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾?、黃酮提取效果的影響。

        乙醇體積分?jǐn)?shù):稱(chēng)取干燥并粉碎后的萬(wàn)壽菊殘?jiān)?5.0 g,在料液比1∶10(g/mL)、超聲功率200 W、50 ℃條件下,分別用體積分?jǐn)?shù)為0%、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液提取30 min。

        料液比:稱(chēng)取干燥并粉碎后的萬(wàn)壽菊殘?jiān)?5.0 g,調(diào)節(jié)料液比分別為1∶5、1∶15、1∶25、 1∶35、1∶45(g/mL),在超聲功率200 W、50 ℃條件下,用體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇溶液提取 30 min。

        提取時(shí)間:稱(chēng)取干燥并粉碎后的萬(wàn)壽菊殘?jiān)?.0 g,在料液比1∶35(g/mL)、超聲功率200 W、50 ℃條件下,用體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇溶液分別提取15、30、45、60和75 min。

        提取溫度:稱(chēng)取干燥并粉碎后的萬(wàn)壽菊殘?jiān)?.0 g,在料液比1∶35(g/mL)、超聲功率200 W條件下,分別用80%乙醇溶液在30、40、50、60、70和80 ℃下提取45 min。

        提取功率:稱(chēng)取干燥并粉碎后的萬(wàn)壽菊殘?jiān)?.0 g,在料液比1∶35(g/mL)、50 ℃下,用體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇溶液分別在超聲功率為100、200、300、400和500 W時(shí)提取45 min。

        提取次數(shù):稱(chēng)取干燥并粉碎后的萬(wàn)壽菊殘?jiān)?.0 g,在料液比1∶35(g/mL)、超聲功率300 W、50 ℃條件下,用80%乙醇溶液提取45 min。分別提取1次、2次和3次。

        1.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,固定料液比1∶35(g/mL)、超聲波功率300 W、提取次數(shù)1次,選取提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時(shí)間3個(gè)因素,每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平,利用Design-ExpertV 8.0進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)[13]。因素水平如表1。

        表1 萬(wàn)壽菊殘?jiān)卸喾雍忘S酮提取Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels in response surface design for polyphenols and flavonoids extraction

        1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

        多酚提取率:在張村雪等[14]建立的方法基礎(chǔ)上,略有改動(dòng),測(cè)定樣品中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)。取沒(méi)食子酸分析標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,用水溶解定容至100 mL,分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL于10 mL容量瓶中,加入福林酚2.0 mL和Na2CO3溶液(75 mg/mL)2.0 mL,定容至10 mL搖勻后放置2 h顯色,765 nm下測(cè)定吸光度。以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),765 nm下吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),獲得線(xiàn)性回歸方程:y=123.27x+0.033 5,R2=0.998 1。將樣品提取液稀釋不同倍數(shù)后,吸取100 μL置于10 mL容量瓶中,按上述方法分別測(cè)定吸光度,代入回歸方程計(jì)算樣品中多酚提取率,計(jì)算過(guò)程中考慮不同稀釋倍數(shù)。

        黃酮提取率:在張村雪等[14]建立的方法基礎(chǔ)上,略有改動(dòng),測(cè)定樣品中黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。取干燥蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg,用水定容至50 mL,分別吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于10 mL容量瓶,加入NaNO2溶液(50 mg/mL)0.5 mL,放置 6 min后加入Al(NO3)3溶液(100 mg/mL)0.5 mL,放置6 min后再加入NaOH溶液(40 mg/mL)4 mL,加水定容至10 mL,15 min后于510 nm下測(cè)定吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度 (mg/mL)為橫坐標(biāo),510 nm下吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),獲得線(xiàn)性回歸方程:y= 12.494x-0.012,R2=0.999 4。將樣品提取液稀釋不同倍數(shù)后,吸取1 mL置于10 mL容量瓶中,按前述方法測(cè)定吸光度,代入回歸方程計(jì)算樣品中黃酮提取率,計(jì)算過(guò)程中考慮不同稀釋倍數(shù)。

        2 結(jié)果及分析

        2.1 超聲波輔助提取萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾雍忘S酮單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

        2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 由圖1可知,萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾雍忘S酮提取率均隨提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而上升,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)提取率最高,之后多酚和黃酮提取率有所下降。主要原因?yàn)橥ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)乙醇體積分?jǐn)?shù)使提取溶劑極性發(fā)生變化。根據(jù)相似相溶原理,提取溶劑與目標(biāo)提取物質(zhì)極性接近時(shí),有利于目標(biāo)提取物質(zhì)溶出,提取效果更佳[15-16]。因此,選定提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

        2.1.2 料液比 由圖2可知,在料液比為1∶35(g/mL)以前,萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾?、黃酮提取率均隨料液比減小而升高。其原因?yàn)殡S著提取溶劑用量增大,萬(wàn)壽菊殘?jiān)w粒與提取溶劑之間接觸面積增加,有利于多酚和黃酮兩類(lèi)提取目標(biāo)物質(zhì)向溶劑中轉(zhuǎn)移擴(kuò)散,使提取率升高[17-18]。當(dāng)液料比達(dá)到1∶35(g/mL)時(shí),提取率達(dá)到最高,此后,隨著料液比減小,多酚、黃酮提取率均有所下降。同時(shí)從成本角度分析,提取溶劑用量越多,成本越高。因此,選擇料液比1∶35(g/mL)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

        圖1 提取液乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾雍忘S酮提取效果的影響Fig.1 Effects of ethanol volume fraction on extraction rate of polyphenol and flavonoid from marigold residues

        圖2 料液比對(duì)萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾雍忘S酮提取效果的影響Fig.2 Effects of solid-to-liquid ratio on extraction rate of polyphenols and flavonoids from marigold residues

        2.1.3 提取時(shí)間 由圖3可知,萬(wàn)壽菊殘?jiān)卸喾雍忘S酮提取率均先隨提取時(shí)間增加而升高,當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到45 min時(shí)提取率最高,此后,隨著提取時(shí)間增加,多酚、黃酮提取率均有所下降。其原因可能為隨著提取時(shí)間增加,在較高溫度下,多酚和黃酮受超聲波空化效應(yīng)影響在一定程度上分解,導(dǎo)致提取率下降[16,19]。因此,選擇提取時(shí)間45 min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

        2.1.4 提取溫度 由圖4可知,萬(wàn)壽菊殘?jiān)卸喾雍忘S酮提取率均隨提取溫度升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。30~50 ℃時(shí),多酚、黃酮提取率隨提取溫度上升而逐漸升高,在50 ℃時(shí)達(dá)到最大,此后,提取率隨提取溫度上升有所下降。其原因可能為多酚、黃酮類(lèi)等生物活性物質(zhì)對(duì)溫度較為敏感,在較高溫度下有一定程度分解,導(dǎo)致提取率下降[20-21]。因此,選擇提取溫度50 ℃進(jìn)行后續(xù) 試驗(yàn)。

        圖3 提取時(shí)間對(duì)萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾雍忘S酮提取效果的影響Fig.3 Effects of ultrasonic treatment time on extraction rate of polyphenol and flavonoid from marigold residues

        圖4 提取溫度對(duì)萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾雍忘S酮提取效果的影響Fig.4 Effects of ultrasonic treatment temperature on extraction rate of polyphenols and flavonoids from marigold residues

        2.1.5 超聲功率 由圖5可知,萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾雍忘S酮提取率均隨超聲功率增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。在超聲功率為100~300 W,多酚、黃酮提取率隨超聲功率增大而逐漸提升,當(dāng)超聲功率達(dá)到300 W時(shí)提取率最高,此后,提取率隨超聲功率增大而有所下降。其原因可能為功率增大使超聲波空化作用增強(qiáng)而促進(jìn)多酚和黃酮有效溶出,但功率過(guò)大又會(huì)造成多酚、黃酮分解,使提取率降低。因此,選擇超聲功率300 W進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)[19-20,22]。

        圖5 超聲功率對(duì)萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾雍忘S酮提取效果的影響Fig.5 Effects of ultrasonic power on extraction rate of polyphenols and flavonoids from marigold residues

        2.1.6 提取次數(shù) 由圖6可知,提取次數(shù)為1次、2次和3次時(shí),萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾雍忘S酮提取率差異很小。說(shuō)明一次提取已能充分提取萬(wàn)壽菊殘?jiān)卸喾雍忘S酮。從成本角度分析,提取次數(shù)越多成本越高。因此,選擇1次提取進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

        圖6 提取次數(shù)對(duì)萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾雍忘S酮提取效果的影響Fig.6 Effects of extraction times on extraction rate of polyphenols and flavonoids from marigold residues

        2.2 超聲波輔助提取萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾雍忘S酮響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

        2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選擇對(duì)萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾印ⅫS酮提取效果影響較為明顯的乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時(shí)間和提取溫度3個(gè)因素,進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),結(jié)果如表2所示。

        表2 超聲波提取萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾狱S酮響應(yīng)面分析結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis for polyphenols and flavonoids extraction from marigold residues

        2.2.2 多酚提取響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析及交互作用影響 對(duì)表2中萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾犹崛〗Y(jié)果進(jìn)行分析,建立回歸方程:Y=-1 861.905 0+ 39.119 0A+9.162 8B+16.684 3C+0.006 2AB- 0.008 8AC-0.034 4BC-0.239 2A2- 0.081 2B2- 0.150 5C2。Y為多酚提取率,A為提取液乙醇體積分?jǐn)?shù),B為提取時(shí)間,C為提取溫度。

        超聲波提取萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾禹憫?yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果如表3所示,不同因素交互作用對(duì)多酚提取率影響如圖7所示。由表3可知,所建立的方程模型具有高度顯著性(P<0.000 1)。失擬項(xiàng)不顯著(P=0.064 1>0.05),擬合程度較好(R2=0.994 5,AdjR2=0.987 4),可以較好反映多酚提取率與提取液乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取溫度之間關(guān)系,用于優(yōu)化萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾犹崛?。不同因素中,A、B、A2、B2、C2對(duì)萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾犹崛÷示哂袠O顯著影響(P<0.01),C對(duì)萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾犹崛÷示哂酗@著影響(P<0.05),3個(gè)因素之間交互作用對(duì)多酚提取率影響均不顯著(P>0.05),說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)所選取的3個(gè)因素之間交互作用對(duì)多酚提取率影響較弱。

        根據(jù)建立的回歸方程,在選取因素范圍內(nèi),得到超聲波提取萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾幼顑?yōu)工藝參數(shù)為:乙醇體積分?jǐn)?shù)81.54%,提取時(shí)間49.49 min,溫度47.39 ℃,在此條件下得到的多酚理論提取率為354.86 mg/g。

        表3 超聲波提取萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾禹憫?yīng)面方差分析Table 3 Analysis of variance for fitted regression model for polyphenols extraction from marigold residues

        注:**表示差異極顯著,*表示差異顯著。下同。

        Note:** show extremly significant difference,* significant difference.The same below.

        圖7 不同因素對(duì)萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾犹崛⌒Ч换プ饔糜绊慒ig.7 Response surface plots for interaction effects of different factors on extraction rate of polyphenols from marigold residues

        2.2.3 黃酮提取響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析及交互作用影響 對(duì)表2中萬(wàn)壽菊殘?jiān)S酮提取結(jié)果進(jìn)行分析,建立回歸方程:Y=-481.525 0+ 5.957 5A+8.880 5B+9.440 8C+0.010 6AB+ 0.000 7AC-0.008 1BC-0.041 0A2- 0.093 5B2-0.090 3C2。Y為黃酮提取率,A為提取液乙醇濃度體積分?jǐn)?shù),B為提取時(shí)間,C為提取溫度。

        超聲波提取萬(wàn)壽菊殘?jiān)S酮響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果如表4所示,不同因素交互作用對(duì)黃酮提取率影響如圖8所示。由表4可知,所建立的方程模型具有高度顯著性(P< 0.000 1)。失擬項(xiàng)不顯著(P=0.154 6>0.05),擬合程度較好(R2=0.990 3,AdjR2=0.977 8),可以較好反映黃酮提取率與提取液乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取溫度之間關(guān)系,用于優(yōu)化萬(wàn)壽菊殘?jiān)S酮提取。不同因素中,B、A2、B2、C2對(duì)萬(wàn)壽菊殘?jiān)S酮提取率具有極顯著影響(P<0.01),3個(gè)因素之間交互作用對(duì)黃酮提取率影響均不顯著(P>0.05),說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)所選取的3個(gè)因素之間交互作用對(duì)黃酮提取率影響較弱。

        根據(jù)建立的回歸方程,在選取因素范圍內(nèi),得到超聲波提取萬(wàn)壽菊殘?jiān)S酮最優(yōu)工藝參數(shù)為:乙醇體積分?jǐn)?shù)79.46%、提取時(shí)間49.81 min、溫度50.33 ℃,在此條件下得到的黃酮理論提取率為 214.01 mg/g。

        表4 超聲波提取萬(wàn)壽菊殘?jiān)S酮響應(yīng)面回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance for fitted regression model for flavonoid extraction from marigold residues

        圖8 不同因素對(duì)萬(wàn)壽菊殘?jiān)S酮提取效果交互作用影響Fig.8 Response surface plots for interaction effects of different factors on extraction rate of flavonoids from marigold residues

        2.2.4 多酚和黃酮最優(yōu)工藝參數(shù)確定 以多酚、黃酮提取率最大化為目標(biāo),對(duì)萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾印ⅫS酮提取結(jié)果進(jìn)行綜合分析。并考慮提取工藝實(shí)際可操作性,對(duì)前述得到萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾?、黃酮類(lèi)物質(zhì)最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行修正,按照乙醇體積分?jǐn)?shù)為81%、提取時(shí)間50 min、提取溫度49 ℃的條件進(jìn)行5次平行驗(yàn)證性試驗(yàn)。最終多酚平均提取率為356.67 mg/g、黃酮平均提取率為216.04 mg/g,與理論提取率接近。證明本研究建立的萬(wàn)壽菊殘?jiān)崛《喾?、黃酮回歸模型的有效性。

        3 結(jié)論與展望

        本研究以亞臨界提取制備葉黃素后的副產(chǎn)物萬(wàn)壽菊殘?jiān)鼮樵?,利用超聲波輔助提取技術(shù),通過(guò)單因素試驗(yàn)和Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),得到多酚和黃酮的最優(yōu)提取工藝參數(shù):乙醇體積分?jǐn)?shù)81%、提取時(shí)間50 min、提取溫度49 ℃、料液比1∶35(g/mL)、超聲功率300 W。在此條件下,萬(wàn)壽菊殘?jiān)喾雍忘S酮提取率分別為 356.67 mg/g和216.04 mg/g,能夠提取得到絕大多數(shù)的多酚、黃酮等水溶性生物活性物質(zhì)。

        本研究?jī)?yōu)化得到的萬(wàn)壽菊殘?jiān)卸喾?、黃酮提取率相對(duì)其他文獻(xiàn)較高,其原因可能為本研究所用原料為亞臨界提取制備葉黃素后的殘?jiān)黐23]。一方面,亞臨界萃取對(duì)脂溶性物質(zhì)具有良好的提取效果,使萬(wàn)壽菊顆粒中葉黃素等脂溶性物質(zhì)能夠最大限度浸出,剩余水溶性活性物質(zhì)更加富集[24]。另一方面,亞臨界對(duì)提取基質(zhì)具有較好的粉碎孔化作用,能夠在一定程度上促進(jìn)提高活性物質(zhì)的提取分離效率[24]。研究結(jié)果說(shuō)明亞臨界提取葉黃素后的萬(wàn)壽菊殘?jiān)泻胸S富的多酚、黃酮等水溶性生物活性物質(zhì),具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景和價(jià)值。

        萬(wàn)壽菊植物多酚、黃酮類(lèi)成分復(fù)雜、種類(lèi)多樣,且二者在較大程度上交叉存在[5,25-26]。本研究團(tuán)隊(duì)下一步將在此基礎(chǔ)上,對(duì)萬(wàn)壽菊殘?jiān)卸喾印ⅫS酮類(lèi)物質(zhì)進(jìn)一步分離、純化、鑒定,探究并闡明多酚、黃酮類(lèi)物質(zhì)的具體化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成。

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