王愛萍，陳 冰，劉紅亮，周景明，陳玉梅，劉燕凱，祁艷華，張改平

(鄭州大學 生命科學學院，鄭州 450000)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一類嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的高度接觸性傳染病[1]。PRRSV是單股正鏈RNA病毒，屬于套式病毒目 (Nidovirales)，動脈炎病毒科 (Arterividae)[2]。PRRSV分為兩種基因型：歐洲型(基因Ⅰ型)和北美洲型(基因Ⅱ型)[3]。

PRRSV的基因組大小約15kb，包含至少12個開放閱讀框 (Open reading frames,ORFs)，分別編碼不同的病毒蛋白[4]。由ORF4編碼的GP4蛋白參與病毒的轉運，在病毒復制中起重要作用[5]。GP4與GP2a、GP2b、GP3可形成異源多聚體，在病毒感染中發(fā)揮關鍵作用[6-7]。有研究報道，GP4與GP2、GP3和GP5相互作用，與CD163受體相識別，介導PRRSV侵染宿主細胞[8]。

PRRSV感染機體后，引發(fā)體液免疫應答，從而產生多種特異性抗體，有助于避免機體再次感染。有研究證明，中和抗體在抗PRRSV感染中起重要作用[9-10]，相關中和表位已有報道。本研究通過合成PRRSV GP4蛋白的重疊多肽，經多肽ELISA篩選GP4蛋白的B細胞表位，旨在深入了解和研究GP4蛋白的B細胞表位，為PRRSV的抗體檢測及其表位疫苗的研究提供 幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗動物血清

PRRSV陰性血清及JXA1-R毒株免疫的PRRSV陽性血清由鄭州大學生命科學學院動物分子免疫實驗室保存。

1.2 GP4重疊多肽的設計

根據GenBank數據庫中發(fā)表的PRRSV GP4蛋白序列(GenBank:ACN 93856.1)，設計合成17條重疊多肽，每條多肽長18個氨基酸，相鄰肽段重疊9個氨基酸殘基。覆蓋了除去N端信號肽序列(前22個氨基酸)的完整的GP4蛋白，送由上海吉爾生化有限公司進行合成，將重疊多肽分別命名為GP4-1～GP4-17。

1.3 間接ELISA

將1 mg多肽干粉溶于50 μL 二甲基亞砜(DMSO)中，每管5 μL分裝，凍存于-80 ℃ 冰箱。

用碳酸鹽緩沖溶液(CBS)將多肽稀釋至10 ng/μL，每孔100 μL作為包被抗原，設立3個平行對照，PRRSV N蛋白作為陽性對照。在用50 g/L脫脂奶進行封閉后，將PRRSV陰性血清和陽性血清按照1∶100的比例稀釋作為一抗，HRP標記的羊抗豬IgG(Goat anti-Swine IgG/HRP)以 1∶5 000的比例稀釋作為二抗，最后避光顯色 5 min后終止，測定OD450 nm值。

1.4 Dot-ELISA

將條狀硝酸纖維素膜(NC膜)在磷酸鹽緩沖液(PBS)中完全浸濕，室溫風干。將多肽用PBS稀釋至2 μg/μL，取1 μL點在膜上，干燥，PRRSV N蛋白作為陽性對照。用50 g/L脫脂奶封閉2 h后，以1∶100稀釋的PRRSV陰性血清和PRRSV陽性血清為一抗，二抗是以 1∶5 000的比例稀釋后的HRP標記的羊抗豬IgG，最后化學發(fā)光法顯示試驗結果。

1.5 抗免疫顯性肽段抗體水平的測定

將篩選得到的免疫顯性多肽用CBS稀釋至10 ng/μL，100μL/孔作為包被抗原，設立3個平行對照，并以不相關多肽作為陰性對照。封閉液為50 g/L脫脂奶，試驗豬免疫前的陰性血清和免疫后每周采血分離得到的陽性血清以1∶100的比例稀釋作為一抗，1∶5 000稀釋的HRP標記的羊抗豬IgG作為二抗，最后避光顯色5 min，終止后測定OD450 nm值。

2 結果與分析

2.1 GP4蛋白重疊多肽的合成

最終成功合成13條重疊多肽(表1)，GP4-11、GP4-12、GP4-16、GP4-17號重疊多肽未成功合成。合成的多肽純度均能達到95%以上，滿足后續(xù)的試驗要求。

表1 重疊多肽的合成Table 1 Synthesis of overlapping peptides

2.2 ELISA篩選GP4蛋白免疫顯性肽段

以13條重疊多肽作為包被抗原，通過間接ELISA的方法對多肽與血清間的反應進行測定，ELISA結果如圖1所示。圖1中GP4-1、GP4-2、GP4-4和GP4-5號肽段與陽性血清產生反應，將具有陽性反應的結果匯總為圖2，以便觀察并分析結果。從圖2可知，GP4-1號肽與9411、9437號試驗豬的血清有較弱的陽性反應；GP4-2號肽與9400、9411、9427、9464號試驗豬的血清有較弱的陽性反應；GP4-4號肽與5頭試驗豬的血清均有較強的陽性反應；GP4-5號肽與5頭試驗豬的血清均有較弱的陽性反應，其余肽段與陽性血清樣品均沒有反應。

圖1中A、B、C、D、E圖分別對應編號為9400、9411、9427、9437、9464試驗豬的試驗結果?？v坐標為OD450nm值，橫坐標為多肽編號，PC為陽性對照(PRRSV N蛋白)。淺色矩形代表免疫前，深色矩形代表免疫后12周。

圖2中A、B、C、D分別代表GP4-1、GP4-2、GP4-4、GP4-5號肽段與5頭試驗豬PRRSV陰性和陽性血清的反應結果，縱坐標為OD450nm值，橫坐標為試驗豬編號，淺色矩形代表免疫前，深色矩形代表免疫后12周。

2.3 Dot-ELISA方法篩選GP4蛋白免疫顯性肽段

以13條重疊多肽作為抗原，通過Dot-ELISA的方法進行篩選，結果如圖3所示。GP4-4號肽段與5頭試驗豬的血清樣品均有明顯的陽性反應；GP4-1號肽與9437號豬的陽性血清有較弱的陽性反應；GP4-2號肽與9400號豬的陽性血清有較弱的陽性反應；其余多肽與5頭試驗豬的血清樣品均沒有陽性反應。Dot-ELISA與間接ELISA的結果基本一致，篩選出1個GP4蛋白B細胞免疫顯性肽段GP4-4：Ⅰ(50) SCLRHGDSSSPTIRKSS (67)。

圖3中，GP4-1～15為肽段編號，N代表PRRSV N蛋白，9400、9411、9427、9437、9464為試驗豬編號，PC代表免疫后12周的結果，NC代表免疫前的結果。

2.4 抗GP4-4號肽段的抗體水平

以篩選出來的免疫顯性多肽GP4-4作為包被抗原，測定其抗體水平，結果如圖4所示?？笹P4-4號肽段的抗體可在免疫后3～5周被檢測到，之后呈現為較均勻的穩(wěn)步上升。

圖4中，9400、9411、9427、9437、9464為試驗豬編號?？v坐標為OD450nm值，橫坐標為免疫周數，NC為陰性對照(不相關多肽)。

A、B、C、D、E分別對應編號為9400、9411、9427、9437、9464參試豬的試驗結果 A,B,C,D,and E correspond to the experimental results of pigs numbered 9400,9411,9427,9437,and 9464,respectively

圖1 ELISA方法篩選PRRSV GP4蛋白免疫顯性肽段
Fig.1 Screening immunodominant peptides of PRRSV GP4 protein by ELISA method

A、B、C、D分別代表GP4-1、GP4-2、GP4-4、GP4-5號肽段與5頭參試豬PRRSV陰性和陽性血清的反應結果 A,B,C,and D represent the results of the reaction of the GP4-1,GP4-2,GP4-4,and GP4-5 peptides with the PRRSV-negative serum and the positive serum of the five experimental pigs,respectively

圖2 ELISA方法篩選PRRSV GP4蛋白免疫顯性肽段
Fig.2 Screen immunodominant peptides of PRRSV GP4 protein by ELISA method

圖3 Dot-ELISA方法篩選PRRSV GP4蛋白免疫顯性肽段Fig.3 Screening immunodominant peptides of PRRSV GP4 protein by Dot-ELISA method

圖4 ELISA方法檢測針對GP4-4號多肽的抗體的消長規(guī)律Fig.4 The growth and decline of antibodies against GP4-4 polypeptide detected by ELISA method

3 討 論

本研究在設計GP4蛋白的重疊多肽時，考慮到信號肽的主要功能是幫助蛋白跨膜定位，因此將GP4蛋白的信號肽區(qū)域截取掉，只對23～178 位氨基酸進行多肽設計與合成。另外，已知B細胞表位的大小一般為5～15個氨基酸殘基，為盡量避免表位篩選遺漏，本試驗在設計重疊多肽時，將每段多肽的殘基數定為18個，相鄰肽段重疊9個氨基酸殘基。

本研究通過合成PRRSV GP4蛋白的重疊多肽，經多肽ELISA對PRRSV JXA1-R毒株GP4蛋白的重疊多肽進行篩選，結果顯示GP4-4號肽段與所有試驗豬陽性血清均有較強陽性反應；GP4-1、GP4-2號肽段并不是與所有的試驗豬陽性血清都產生反應，且反應較弱，存在個體差異；另外，GP4-5號肽段與所有試驗豬陽性血清均有較弱的陽性反應，這可能是由于GP4-5號肽段與GP4-4號肽段存在9個氨基酸殘基重疊的原因。Dot-ELISA結果也顯示GP4-4號肽段與所有試驗豬陽性血清均有較強陽性反應，與間接ELISA的結果一致。初步篩選得到的GP4-4號肽段(50～67 aa)與Meulenberg等[11]和De Lima等[12]篩選的B細胞表位存在較大的重疊區(qū)域，驗證了前人結果的同時也說明該肽段為優(yōu)勢肽段。GP4-4號肽段(50～67 aa)還包含中和表位核心區(qū)域51～65 aa或59～67 aa[11-13]，具有很大的研究價值。

在本研究中，抗GP4-4號肽段的抗體可在免疫后3～5周被檢測到，該肽段包含中和表位，并且已知針對PRRSV GP4蛋白的中和抗體可在豬感染PRRSV后20 d左右時被檢測到[14]，本研究的結果與已有報道基本一致。研究表明，中和抗體在抗PRRSV感染中起關鍵作用[9-10]。血清中的中和抗體可以保護高危易感群體，包括懷孕母豬和仔豬。因此，在對豬進行PRRSV疫苗免疫后，可檢測機體內是否產生針對GP4蛋白B細胞中和表位的抗體，來判斷機體是否產生中和抗體，從而評估疫苗是否對機體產生了保護作用。

總之，對PRRSV GP4蛋白B細胞表位的研究不僅能夠用于PRRSV的抗體檢測，還對PRRSV表位疫苗的研究有所幫助，表位疫苗則是未來疫苗的發(fā)展方向。