吳姍姍 王柏山 嚴 峰 張 寧 張 程 李志靜

(遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院臨床檢驗中心，沈陽110032)

肺癌是目前全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，吸煙、肺部持續(xù)慢性感染、遺傳等因素均可導致肺癌的發(fā)生。約有85%的病例屬于非小細胞肺癌(NSCLC),包括鱗癌、腺癌、腺鱗癌和大細胞肺癌等，多數(shù)病例在發(fā)現(xiàn)時已有局部浸潤或已發(fā)生轉(zhuǎn)移[1,2]。盡管在過去的幾十年已經(jīng)開發(fā)了多種化療和靶向治療方案，但是多數(shù)NSCLC仍會發(fā)生轉(zhuǎn)移或復發(fā)[3]。一些研究發(fā)現(xiàn)扶正抗癌方聯(lián)合化療藥物治療，能夠增加化療藥物敏感性并且降低其毒性[4,5]。扶正抗癌方具有扶正補虛,提高機體免疫力抗癌抑瘤的作用。但是具體免疫學機制尚不清楚。T細胞是機體抗腫瘤免疫的重要效應細胞，并且通過功能各異的細胞亞群來完成免疫調(diào)控機能。成熟T細胞分為 CD4+T和CD8+T細胞。CD8+T細胞又稱為細胞毒性T細胞，主要發(fā)揮對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視作用。CD8+T細胞通過T細胞受體(TCR)與靶細胞上的抗原肽-MHC-Ⅰ類分子結(jié)合,傳導活化信號并直接作用于靶細胞使其溶解。CD8+T細胞也可表達一些NK相關(guān)受體，有活化性受體NKG2D和抑制性受體NKG2A等，通過識別其相應的配體傳遞抑制或活化信號，抑制與活化信號發(fā)生整合，最終決定CD8+T細胞能否殺傷靶細胞[6]。

NKG2D是一種廣泛表達于免疫效應細胞(如NK細胞、CD8+αβT細胞、NKT細胞等)的活化性細胞表面受體，T細胞上的NKG2D是作為TCR激活的一個重要共刺激分子[7]。而且有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者的CD8+T細胞可以分別通過TCR或NKG2D受體識別自體和同種異體的腫瘤細胞[8]。食道癌Ⅲ/Ⅳ期患者的CD8+T細胞NKG2D受體表達顯著低于Ⅰ/Ⅱ期患者，說明其表達與腫瘤疾病的嚴重程度密切相關(guān)[9]。人類患宮頸癌時CD8+T細胞表達NKG2A上調(diào)使CD8+T細胞釋放穿孔素明顯減少，而且細胞毒性試驗表明NKG2A表達的上調(diào)可抑制CD8+T細胞的細胞毒作用[10]。無論是小鼠還是人類當阻斷抑制性的NKG2A受體時，可以通過提升CD8+T和NK細胞的效應功能從而加強對腫瘤的免疫作用[11]。由此可見，通過觀察CD8+T細胞表面NKG2D和NKG2A表達的高低，可以預測腫瘤疾病的嚴重程度。本研究旨在探索晚期NSCLC患者按療程規(guī)范服用扶正抗癌方前后CD8+T細胞表面NKG2D和NKG2A的表達情況。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 本研究通過本院倫理委員會審批以及患者的知情同意。選擇我院2018年5月至2019年1月期間收治的有病理學明確診斷的31例NSCLC晚期患者，其中男18例，女13例；年齡35～79歲，平均年齡為(45.5±3.8)歲，其中鱗癌14例，腺癌17例；TNM分期Ⅲa期8例，Ⅲb期11例，Ⅳ期12例。上述患者為治療組，根據(jù)服用扶正抗癌方前后分別定義為治療前組和治療后組。

1.1.2病例入選標準 入選標準：①患者符合原發(fā)性非小細胞肺癌診斷標準[12]且無其他腫瘤史；②患者不伴發(fā)自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風濕性骨關(guān)節(jié)病等；③患者未服用激素類藥物或接受免疫抑制劑的治療；④排除活動性(病毒)感染。Karnofsky評分≥70分。選擇與患者性別年齡相匹配的健康人21例即健康對照組，其中男11例，女10例；年齡32～77歲，平均(42.3±3.5)歲。

1.1.3藥物干預 治療組服用院內(nèi)扶正抗癌方(基本組成：苦參15 g，生白術(shù)12 g，生甘草5 g，半夏15 g，大貝20 g，半枝蓮15 g，白花蛇草30 g，茯苓20 g，陳皮15 g，生苡仁30 g)；辨證加減：反復咳嗽并痰中帶血可加三七和仙鶴草等；胸痛者可加枳殼、香附、延胡索等；陰虛者可加沙參和麥冬等；陽虛者加巴戟天、肉蓯蓉和杜仲等。上述中藥由我院藥房提供并按正規(guī)流程制備，每日1劑水煎至150 ml，分3次服用，連續(xù)服用30日為1個療程。

1.2實驗方法

1.2.1T 淋巴細胞絕對數(shù)量檢測 完全依照1997年美國CDC頒布的CD4+T細胞和CD8+T細胞絕對值檢測指導方法嚴格執(zhí)行。具體步驟：將20 μl CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP試劑加入BD公司TruCOUNT管中，逆向加樣法加入50 μl EDTA抗凝血，室溫避光15 min，加入經(jīng)10倍稀釋的免洗溶血素450 μl，室溫避光15 min，樣本溶血充分后流式細胞儀FACSCalibur檢測，MULTISET 軟件進行分析。

1.2.2CD8+T細胞表面NKG2D和NKG2A的表達 具體步驟：采用熒光標記的單克隆抗體組合CD3 PE-Cy7/CD8 Percp-Cy5.5/NKG2D APC/NKG2A PE 對治療組和健康對照組的外周靜脈血進行表面染色，即每個研究對象均有一管按上述組合染色的樣本管，另設(shè)一管同型對照管。樣本管內(nèi)加入100 μl EDTA抗凝全血，按上述組合的單克隆抗體分別加入樣本管內(nèi)，室溫避光25 min后加入溶血素3 ml，繼續(xù)室溫避光8 min溶血充分后，300 g離心10 min棄上清。加入3 ml PBS進行洗滌，室溫下300 g離心10 min后棄上清，共洗滌兩次。最終加入含有1% 多聚甲醛的PBS 200 μl懸浮，BD FACSCalibur流式細胞儀檢測，CELLQUEST軟件進行分析。

1.2.3生存質(zhì)量評價 根據(jù)Karnofsky評分評價患者的生存質(zhì)量。提升：比治療前評分升高≥10分；平穩(wěn)：治療前后評分變化幅度≤10分；降低：比治療前評分減少≥10分[13]。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0軟件進行分析，計量資料用中位數(shù)的95%可信區(qū)間表示。各組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗，相關(guān)性采用Spearman 秩相關(guān)檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1CD4+T和CD8+T細胞絕對值在NC組、治療前組和治療后組的差別 NC組的CD4+T細胞絕對值顯著高于治療前組和治療后組(P<0.01)；治療前組和治療后組的CD4+T細胞絕對值無顯著性差異，見表1。NC組的CD8+T細胞絕對值顯著高于治療前組和治療后組(P<0.01)；治療后組的CD8+T細胞絕對值顯著高于治療前組(P<0.01)，見表1和圖1A。

2.2CD8+T細胞表面NKG2D和NKG2A在NC組、治療前組和治療后組所占百分比

2.2.1CD8+T細胞表面NKG2D+NKG2A-在NC組、治療前組和治療后組占百分比 NC組的NKG2D+NKG2A-CD8+T細胞的百分比顯著高于治療前組和治療后組(P<0.01)；治療后組NKG2D+NKG2A-CD8+T細胞的百分比顯著高于治療前組(P<0.01)，見表1、圖1B和圖 2,流式細胞圖見圖3。

2.2.2CD8+T細胞表面NKG2D-NKG2A+在NC組、治療前組和治療后組所占百分比 NC組的NKG2D-NKG2A+CD8+T細胞的百分比顯著低于治療前組(P<0.01)；NC組也顯著低于治療后組(P<0.05)；而治療前組和治療后組無顯著性差異,見表1、圖1C和圖 2,流式細胞圖見圖3。

2.2.3CD8+T細胞表面NKG2D+NKG2A+在NC組、治療前組和治療后組占百分比 NC組的NKG2D+NKG2A+CD8+T細胞的百分比顯著低于治療前組(P<0.01)；在其余各組間無顯著性差異,見表1、圖1D和圖 2,流式細胞圖見圖3。

2.3治療前組不同病理類型上述指標的差別 治療前組包含鱗癌14例，腺癌17例。鱗癌NKG2D+NKG2A+CD8+T細胞的百分比顯著低于腺癌(P<0.05);CD4+T、 CD8+T細胞絕對值以及NKG2D+NKG2A-CD8+T(%)、NKG2D-NKG2A+CD8+T(%)在鱗癌患者和腺癌患者間并無顯著性差異,見表2。

GroupsnCD4+T(cells/μl)CD8+T(cells/μl)NKG2D+NKG2A-(%)NKG2D-NKG2A+(%)NKG2D+NKG2A+(%)Pre31449(268,623)347(241,437)2)74.7(66.2,78.7)2)0.7(0.2,1.1)2)8.6(2.7,15.1)2)Post31495(343,672)426(366,547)2)81.9(69.6,86.3)2)0.5(0.1,0.9)1)5.4(1.6,10.8)NC21946(746,1 138)679(527,863)93.1(87.8,94.0)0.1(0,0.2)2.8(2.2,4.9)

Note:Compared with NC group，1)P<0.05，2)P<0.01.

圖1 治療前、治療后和NC組的CD8+T細胞絕對值、NKG2D+NKG2A-CD8+T(%)、NKG2D-NKG2A+CD8+T(%)、NKG2D+NKG2A+CD8+T(%)的差異Fig.1 Comparison percentage of NKG2D+NKG2A-CD8+T cells， NKG2D-NKG2A+CD8+T cells,NKG2D+NKG2A+CD8+T cells and absolute counts of CD8+ T cells among Pre-treatment group,Post-treatment group and NC three groupsNote: A.The comparison of the absolute counts of CD8+T cells;B.The comparison of the percentage of NKG2D+NKG2A-CD8+T cells;C.The comparison of the percentage of NKG2D-NKG2A+CD8+T cells;D.The comparison of the percentage of NKG2D+NKG2A+CD8+T cells.

圖2 治療前、治療后和NC組NKG2D+NKG2A-CD8+T(%)、NKG2D-NKG2A+CD8+T(%)、NKG2D+NKG2A+CD8+T(%)以及NKG2D-NKG2A-CD8+T(%)Fig.2 Percentage of NKG2D+NKG2A-CD8+T cells， NKG2D-NKG2A+CD8+T cells,NKG2D+NKG2A+CD8+T cells and NKG2D-NKG2A-CD8+T cells among Pre-treatment group,Post-treatment group and NC three groups

圖3 各組CD8+T細胞表達NKG2D和NKG2A不同亞群所占百分比的流式細胞圖Fig.3 Representative flow cytometric graphs of NKG2D+/-NKG2A+/-CD8+T cells in Pre-treatment group,Post-treatment group and NC group

Pathological typenCD4+T(cells/μl)CD8+T(cells/μl)NKG2D+NKG2A-(%)NKG2D-NKG2A+(%)NKG2D+NKG2A+(%)Squamous cell carcinoma14416(205,668)361(230,395)73.0(62.3,81.5)0.6(0.2,1.1)4.4(2.3,8.9)1)Adeno carcinoma17449(309,588)311(241,474)75.0(69.6,78.4)0.7(0.4,1.4)13.8(5.6,19.1)

Note:Compared with Adenocarcinoma group，1)P<0.05.

TNMnCD4+T(cells/μl)CD8+T(cells/μl)NKG2D+NKG2A-(%)NKG2D-NKG2A+(%)NKG2D+NKG2A+(%)Ⅲ19581(449,643)2)391(278,466)1)77.4(75.0,82.5)2)0.4(0.2,0.8)2)8.6(3.7,13.9)Ⅳ12248(191,335)267(185,357)61.5(53.4,67.4)1.1(0.8,2.4)9.8(2.6,25.9)

Note:Compared with Phase Ⅳ group，1)P<0.05，2)P<0.01.

圖4 Ⅲ期、Ⅳ期患者CD4+和CD8+T細胞絕對值、NKG2D+NKG2A-CD8+T(%)以及NKG2D-NKG2A+CD8+T(%)的差異Fig.4 Comparison the percentage of NKG2D+NKG2A-CD8+T(%)，NKG2D-NKG2A+CD8+T(%)，absolute counts of CD4+ T cells and absolute counts of CD8+ T cells between Phase Ⅲ and Phase ⅣNote: A.The comparison of the absolute counts of CD4+T cells;B.The comparison of the absolute counts of CD8+T cells;C.The comparison of the percentage of NKG2D+NKG2A-CD8+T cells;D.The comparison of the percentage of NKG2D-NKG2A+CD8+T cells.

GendersnCD4+T(cells/μl)CD8+T(cells/μl)NKG2D+NKG2A-(%)NKG2D-NKG2A+(%)NKG2D+NKG2A+(%)Males18472(329,601)315(256,470)75.5(70.5,79.0)0.6(0.2,1.0)9.0(6.6,18.8)Females13437(299,633)360(218,395)71.8(61.3,79.0)0.8(0.4,1.4)8.7(6.2,18.3)

圖5 NSCLC患者治療前和治療后NKG2D+NKG2A-CD8+T(%)和NKG2D-NKG2A+CD8+T(%)的相關(guān)性(A和B)Fig.5 Correlation analysis of percentage of NKG2D+NKG2A-CD8+T cells and percentage of NKG2D-NKG2A+CD8+T cells between Pre-treatment group and Post-treatment groupNote: A.The correlation analysis of the percentage of NKG2D+NKG2A-CD8+T cells and percentage of NKG2D-NKG2A+CD8+T cells in pre-treatment group;B.The correlation analysis of the percentage of NKG2D+NKG2A-CD8+T cells and percentage of NKG2D-NKG2A+CD8+T cells in post-treatment group.

2.4治療前組不同TNM分期患者上述指標的差別 治療前組包含Ⅲ期19例，Ⅳ期12例。Ⅲ期的CD4+T細胞絕對值顯著高于Ⅳ期(P<0.01),見表3和圖4A；Ⅲ期的CD8+T細胞絕對值顯著高于Ⅳ期(P<0.05),見表3和圖4B；Ⅲ期的NKG2D+NKG2A-CD8+T(%)顯著高于Ⅳ期(P<0.01),見表3和圖4C；Ⅲ期的NKG2D-NKG2A+CD8+T(%)顯著低于Ⅳ期(P<0.01),見表3和圖4D。

2.5治療前組不同性別上述指標的差別 治療前組包含女性10例，男性11例，CD4+T、CD8+T細胞絕對值以及NKG2D+NKG2A-CD8+T(%)、NKG2D-NKG2A+CD8+T(%)、NKG2D+NKG2A+CD8+T(%)在女性和男性間并無顯著性差異,見表4。

2.6相關(guān)性分析 治療前組NKG2D+NKG2A-CD8+T(%)與NKG2D-NKG2A+CD8+T(%)呈負相關(guān)(P<0.01，R=-0.66),見圖5A。

治療后組NKG2D+NKG2A-CD8+T(%)與NKG2D-NKG2A+CD8+T(%)也呈負相關(guān)(P<0.01，R=-0.54)，見圖5B。

2.7治療后生存質(zhì)量評價 共31例患者治療前后Karnofsky評分的變化，其中7例患者評分升高≥10分，占總體的22.0%；19例患者評分變化幅度≤10分，占總體的61.2%；5例患者評分減少≥10分，占總體的16.1%。83.9%的患者治療后生存質(zhì)量都穩(wěn)中有升。

3 討論

中醫(yī)定義肺癌是一種全身屬虛，局部屬實，本虛標實之病證，邪毒聚結(jié)，最易耗傷人體正氣，隨著邪長正消，正氣受戕益甚。可見正虛是肺癌的內(nèi)因,也是推動肺癌發(fā)展的關(guān)鍵,扶正培本以及時時顧護正氣是中醫(yī)對肺癌進行辨證施治的核心。中醫(yī)的正氣主要由先天的元氣和后天的中氣構(gòu)成。有研究發(fā)現(xiàn)通過補中益氣不僅可以改善非特異性免疫，特異性免疫也會有所改善[14]。中醫(yī)學的正氣理論與現(xiàn)代醫(yī)學的免疫理論有相通之處但是不能等同，二者的關(guān)聯(lián)有待深入研究，本研究旨在探索按療程規(guī)范服用扶正抗癌方前后，NSCLC晚期患者CD8+T細胞表面表達NKG2D和NKG2A的變化。

CD4+T細胞又稱為輔助性T細胞，可以調(diào)控或輔助其他淋巴細胞發(fā)揮功能。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC晚期患者CD4+T細胞絕對值顯著低于NC組，在按療程規(guī)范服用扶正抗癌方前后患者CD4+T細胞絕對值無顯著性變化。眾多研究表明，細胞毒性T細胞可以抑制惡性實體瘤的生長[15]。NSCLC晚期患者CD8+T細胞絕對值顯著低于NC組，應用扶正抗癌方后患者CD8+T細胞絕對值較治療前明顯升高。應用扶正抗癌方后NSCLC晚期患者CD8+T細胞絕對值顯著升高，有利于抑制患者體內(nèi)腫瘤的生長。

腫瘤浸潤的NKG2D+CD8+T細胞可以識別并消除表達NKG2D配體的腫瘤細胞[16]。Lin等[17]的研究發(fā)現(xiàn)：與腫瘤細胞共同孵育后，CD8+T細胞表達NKG2D顯著下調(diào)。當阻斷NKG2D或其配體可抑制CD8+T細胞殺傷腫瘤的活性。其研究顯示NKG2D受體可能是胃癌的有利預后指標，并推測NKG2D表達下降是腫瘤的免疫逃逸機制[17]。有數(shù)據(jù)表明NSCLC晚期患者較早期患者CD8+T細胞表達NKG2D顯著下降[18]。相似的結(jié)果在本研究同樣得到了印證，本研究發(fā)現(xiàn)NSCLCⅢ期患者的NKG2D+NKG2A-CD8+T占百分比顯著高于Ⅳ期，隨著腫瘤疾病的進展CD8+T細胞表達NKG2D會明顯減少?；颊叻梅稣拱┓胶?，83.9%的患者生存質(zhì)量評價穩(wěn)中有升，只有16.1%的患者生存質(zhì)量評價下降。與其相對應的我們發(fā)現(xiàn)治療后NKG2D+NKG2A-CD8+T占百分比較治療前顯著升高但是仍然顯著低于NC組。結(jié)果表明患者在服用扶正抗癌方后CD8+T細胞表達NKG2D顯著上調(diào)，可能有利于體內(nèi)CD8+T細胞識別并殺傷腫瘤細胞，從而使患者的一般狀況得到改善，二者之間存在因果關(guān)聯(lián)。

NKG2A是一種帶有酪氨酸抑制性基序(ITIM)的NK相關(guān)抑制性受體，既表達于NK細胞又表達于T細胞[19]。在健康個體的外周血中約有5%的CD8+T細胞表面可穩(wěn)定表達NKG2A，當有慢性抗原刺激時這種表達可以上調(diào)[20]。NKG2A/CD94形成的異二聚體可與人類非經(jīng)典的MHCⅠ類分子復合物HLA-E結(jié)合，傳導抑制信號從而抑制NK和CD8+T細胞的活性[21]。最新研究發(fā)現(xiàn)：通過阻斷CD8+T細胞而非NK細胞表面的NKG2A受體，可以提高機體對治療性腫瘤疫苗的臨床反應[22]。Yu等[18]的研究發(fā)現(xiàn)NSCLC晚期患者較早期患者CD8+T細胞表達NKG2A顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLCⅢ期患者的NKG2D-NKG2A+CD8+T占百分比顯著低于Ⅳ期，隨著腫瘤疾病的進展CD8+T細胞表達NKG2A增多。我們的結(jié)果與Yu等[18]的研究結(jié)果相符。患者服用扶正抗癌方后，大部分患者生存質(zhì)量保持穩(wěn)中有升的狀態(tài)。我們發(fā)現(xiàn)治療后NKG2D-NKG2A+和NKG2D+NKG2A+CD8+T兩群細胞的百分比，較治療前雖有下降的趨勢但并無統(tǒng)計學差異。我們推測之所以沒有產(chǎn)生統(tǒng)計學差異，可能是由于本研究的樣本量偏小?；颊呱尜|(zhì)量的改善還是與CD8+T細胞表達NKG2A減少的趨勢相對應的，但是CD8+T細胞對腫瘤細胞的殺傷功能是否有改善則需要進一步的研究證實。

NKG2D和NKG2A受體可同時表達于CD8+T細胞，CD8+T細胞的活性取決于上述兩個受體疊加的效果。本研究的相關(guān)性結(jié)果顯示無論在治療前還是治療后，NSCLC晚期患者NKG2D+NKG2A-CD8+T和NKG2D-NKG2A+CD8+T兩群細胞的百分比呈負相關(guān)，說明CD8+T細胞表達NKG2D和NKG2A受體呈現(xiàn)互為消長的狀態(tài)。免疫活化和免疫抑制之間存在平衡，可以間接反映免疫監(jiān)視的效果，在腫瘤微環(huán)境中免疫活化和免疫抑制信號的比例可以更好地預測免疫治療的結(jié)果[23]。我們的結(jié)果也再次印證這種CD8+T細胞上免疫活化和免疫抑制的平衡理論。

本研究的NSCLC晚期患者包含鱗癌14例、腺癌17例，鱗癌NKG2D+NKG2A+CD8+T細胞的百分比顯著低于腺癌患者，其他細胞群無顯著性差異。而之前Yu等[18]的研究發(fā)現(xiàn)鱗癌CD8+T細胞表達NKG2D和NKG2A有低于腺癌的趨勢但無顯著性差異，之所以結(jié)果會有差異，我們推測可能是由于患者構(gòu)成的不同引起上述的差異，Yu等[18]的研究包含23例早期患者和17例晚期患者，而我們的患者全部是晚期患者。NKG2D和NKG2A同時表達于同一個CD8+T細胞，二者可能處于一種博弈狀態(tài)，CD8+T細胞是否能夠殺傷腫瘤細胞主要取決于腫瘤細胞表面何種受體的配體處于優(yōu)勢，但仍有待于進一步的研究證實。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC晚期患者CD8+T細胞表達NKG2D和NKG2A的水平無性別差異，這與Yu等[18]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，NSCLC晚期患者按照辨證施治的原則，服用扶正抗癌方一個月大部分患者生存質(zhì)量穩(wěn)中有升，與之相對應的CD8+T細胞表達NKG2D升高和NKG2A降低，我們推測扶正抗癌方的應用可能激活體內(nèi)CD8+T細胞殺傷腫瘤細胞的活性，有利于改善患者預后?？梢猿蔀槭中g(shù)、放化療以及靶向治療的輔助療法，而且眾多研究已經(jīng)證實服用扶正抗癌方可增加放化療敏感性同時降低放化療引起的不良反應。