劉海鵬

（衡水學院生命科學系 河北 衡水 053000）

金黃色葡萄球菌是常見的引起皮膚感染和食物中毒的致病菌[1]，易引起不同程度的化膿性炎癥，擴散疾病，如肺炎、菌血癥和敗血癥等。隨著抗菌藥物在醫(yī)學和獸醫(yī)臨床上的廣泛應用，金黃色葡萄球菌的耐藥性越來越高，已經(jīng)進化出了抵抗免疫系統(tǒng)攻擊的種類[2]。沙蠶是一類生活在海邊潮間帶的海洋生物，體內(nèi)含有多種生物活性成分，是可利用的重要的藥物資源[3]，因此研究和開發(fā)沙蠶體內(nèi)抗菌活性成分對解決耐藥菌株有重要意義。采用乙酸乙酯對沙蠶體內(nèi)活性物質(zhì)進行提取，并對提取物進行金黃色葡萄球菌體外抑菌實驗，為沙蠶體內(nèi)生物活性物質(zhì)的開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品與菌株。沙蠶，采購于山東舟山某水產(chǎn)養(yǎng)殖場。金黃色葡萄球菌，衡水學院微生物實驗室提供。

1.1.2 主要儀器。電熱鼓風干燥箱、XDSY-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SW-CT-IF超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、超聲波震蕩儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 沙蠶提取物的制備。將清水洗凈的沙蠶烘干、粉碎后研磨成粉末狀，將乙酸乙酯和沙蠶混勻，超聲波震蕩儀中震蕩30min，重復3次，所得濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，最后所得溶液用乙酸乙酯稀釋至濃度為100mg/ml，高壓滅菌后，放于4℃冰箱保存，備用。

1.2.2 菌懸液的制備。無菌條件下，將活化的金黃色葡萄球菌接種至LB培養(yǎng)基進行恒溫培養(yǎng)，并計算菌懸液濃度。取1 ml已制備好的菌懸液加到9 ml無菌水中進行10倍倍比稀釋，取1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9等5種稀釋度涂板，每個濃度做3個平行，做好標記，將涂好后的培養(yǎng)基倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)1～2 d。選擇每個平板上長有50～300個菌落的稀釋度計算菌落形成單位數(shù)。計算公式：每1 ml樣品中菌落形成單位數(shù)(CFU)=同一稀釋度3次重復的平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)，最后配制成濃度為1×106cfu/ml的菌液備用。

1.2.3 沙蠶提取物最小抑菌濃度(MIC)的測定。采用試管二倍稀釋法測定每種沙蠶活性提取物的最低抑菌濃度(MIC)。取已處理好的無菌試管，通過試管二倍稀釋法，制備試管提取物，濃度分別為50 mg/ml、12.5 mg/ml、 3.13 mg/ml、 0.78 mg/ml、 0.195 mg/ml、0.098 mg/ml，同時做空白對照和溶劑對照，空白對照不含提取物藥液，溶劑對照不含提取物但含有等劑量相應溶劑。

1.2.4 體外抑菌圈直徑測定。利用牛津杯法[4]測定沙蠶提取物體外抑菌圈直徑。用移液槍吸取100 μl沙蠶提取物注入牛津杯內(nèi)，將平板培養(yǎng)基在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察并測量抑制圈的直徑大小。每種提取物做3個重復，取平均值。結(jié)果判定，抑菌圈直徑小于10 mm為輕度抑菌，抑菌圈直徑10～15 mm為中度抑菌，抑菌圈直徑15～20 mm為高度抑菌，抑菌直徑大于20 mm為極度抑菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抑菌圈的測定。由表1可知，乙酸乙酯沙蠶提取物對金黃色葡萄球菌有中度抑菌效果。其抑菌圈直徑平均值為11.49 mm，空白對照組和乙酸乙酯抑菌圈直徑均為0 mm，無抑菌效果。

表1 不同沙蠶提取物體外抑菌圈直徑及抑菌效果

2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測定。由表2可知，乙酸乙酯沙蠶提取物金黃色葡萄球菌的MIC值為0.195 mg/ml。

表2 乙酸乙酯沙蠶提取物對金黃色葡萄球菌MIC的測定

3 討論

由于抗生素的大量使用，使得臨床上金黃色葡萄球菌的抗藥性越來越強，因此發(fā)現(xiàn)新的抗菌藥物迫在眉睫。本試驗通過使用乙酸乙酯對沙蠶體內(nèi)活性物質(zhì)提取，發(fā)現(xiàn)其提取物對金黃色葡萄球菌具備一定的抗菌性，表明沙蠶體內(nèi)的活性生物物質(zhì)有一定抗菌性，為今后相關研究打下了一定基礎。

在本試驗中，通過體外抑菌效果的測定，表明在沙蠶體內(nèi)存在某些生物活性物質(zhì)，這些物質(zhì)具有天然抗菌的作用，但抗菌效果并不顯著，需要進一步對乙酸乙酯粗提物進行分化，看看是哪些具體的成分起到了抗菌作用。