楊淑玲， 廖先萍， 范 星， 庹 潯

(1. 南昌大學(xué) 化學(xué)學(xué)院， 江西 南昌 330000； 2. 南昌大學(xué) 藥學(xué)院， 江西 南昌 330000)

1 引 言

黃體酮(Progesterone，PROG)是由卵巢黃體分泌的一種內(nèi)源性類(lèi)固醇激素，對(duì)雌激素激發(fā)過(guò)的子宮內(nèi)膜有顯著形態(tài)學(xué)影響，可以保護(hù)女性的子宮內(nèi)膜[1]。在女性懷孕期間，PROG可以降低子宮緊張度且抑制其興奮性，使孕激素所引起的子宮內(nèi)膜增殖期轉(zhuǎn)為分泌期，為孕卵著床提供有利條件并維持妊娠，同時(shí)促進(jìn)乳房發(fā)育，抑制排卵，支持并保障胎兒的早期生長(zhǎng)及發(fā)育。PROG也是臨床干預(yù)先兆流產(chǎn)的常用藥物之一[2]，但是大劑量黃體酮會(huì)給孕婦帶來(lái)乳腺脹痛、腸道不適、偏頭痛等副作用[3]。

血清白蛋白是生物體內(nèi)重要的載體蛋白，能運(yùn)輸許多藥物分子到達(dá)受體部位發(fā)揮藥效，還能與內(nèi)源性或外源性化合物結(jié)合起到儲(chǔ)存的作用[4-5]。牛血清白蛋白(BSA)與人血清白蛋白(HSA)的序列十分相似, 兩者之間的同源性高達(dá)76.5%，且不同氨基酸均為保守性替換[4]。BSA相較于HAS價(jià)廉易得，因此研究人員將BSA作為化學(xué)生物學(xué)中研究人類(lèi)血清白蛋白性質(zhì)的常用模型。利用光譜學(xué)技術(shù)特別是熒光光譜技術(shù)揭示BSA與藥物小分子之間的相互作用機(jī)制的研究工作已有廣泛報(bào)道[5-6]。隨著大量蛋白質(zhì)三維精細(xì)結(jié)構(gòu)的確定以及計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)的快速發(fā)展，分子對(duì)接技術(shù)已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)與小分子之間相互作用的有效手段[6-8]。例如，王曉霞等運(yùn)用該方法探究了鹽酸四環(huán)素與BSA的相互作用[9]。盡管?chē)?guó)內(nèi)外的學(xué)者對(duì)黃體酮多方面的藥理作用已經(jīng)有所認(rèn)識(shí)，但其中大多是關(guān)于黃體酮在先兆流產(chǎn)及腦神經(jīng)保護(hù)等臨床應(yīng)用方面的研究[3,10]，尚未關(guān)注PROG在體內(nèi)的傳輸機(jī)制以及與相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用。因此，本實(shí)驗(yàn)擬整合光譜學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在分子水平探究PROG與運(yùn)輸?shù)鞍?BSA)之間的相互作用機(jī)制，為揭示PROG對(duì)人體健康的影響提供數(shù)據(jù)參考。

2 實(shí) 驗(yàn)

2．1 試劑與儀器

試劑：BSA(BIOFROXX，德國(guó)，純度≥98%)，以超純水為溶劑配制成1×10-2mol·L-1的BSA儲(chǔ)備液，-20 ℃冷藏備用,臨用逐級(jí)稀釋?zhuān)籔ROG(上海源葉生物公司，純度≥99%)，用乙醇配制成1×10-2mol·L-1溶液，-20 ℃冷藏備用,臨用稀釋?zhuān)籘ris-HCl緩沖溶液：pH=7.4，含0.15 mol·L-1氯化鈉以調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

測(cè)試儀器:日立F-4500熒光光譜儀(帶溫控設(shè)備，石英比色皿)；METTLER TOLEDO pH計(jì)；布魯克TERSON-27紅外光譜儀(帶ATR附件)。

2．2 實(shí)驗(yàn)方法

2．2．1 熒光光譜和同步熒光光譜

293 K時(shí)，準(zhǔn)確移取3 mL的Tris-HCl緩沖液至1 cm的比色皿中，固定緩沖溶液中BSA濃度為3.33×10-7mol·L-1，逐漸增加PROG濃度(每次改變3.33×10-7mol·L-1)，掃描300～450 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的發(fā)射光譜并記錄結(jié)果，298，303,310 K的研究與上述步驟一致。

設(shè)置熒光的波長(zhǎng)差值Δλ分別為15 nm和60 nm，掃描同步熒光光譜并記錄結(jié)果。

2．2．2 分子對(duì)接技術(shù)研究PROG和BSA的相互作用

PROG的結(jié)構(gòu)采用ChemBio3D Ultra14.0生成，并用MMFF94分子力場(chǎng)進(jìn)行最低能量?jī)?yōu)化，將得到的構(gòu)型用于分子對(duì)接操作；從RSCB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載BSA的晶體結(jié)構(gòu)(編號(hào)1H9Z)，用Chemra程序檢查該晶體結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基并使之完整；采用軟件AutoDock Vina和Pymol對(duì)PROG和BSA的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行處理并模擬兩者1 ∶1結(jié)合時(shí)的構(gòu)象[6]。使用LigPlus+分析PROG和BSA之間的疏水作用力及氫鍵。

2．2．3 紅外光譜測(cè)定

按照文獻(xiàn)[11]的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定BSA游離體系和PROG-BSA復(fù)合物體系的紅外光譜。儀器參數(shù)設(shè)置如下：分辨率4 cm-1，掃描背景和樣品次數(shù)64次。

3 結(jié)果與討論

3．1 PROG與BSA 相互作用的熒光光譜分析

BSA結(jié)構(gòu)中的芳香族氨基酸殘基(Trp/Tyr/Phe)能夠發(fā)射一定強(qiáng)度的內(nèi)源熒光[8,12]。當(dāng)以280 nm為激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)，345 nm譜帶為這些氨基酸的主要熒光信號(hào)，而在該條件下PROG不發(fā)熒光。因此利用熒光光譜探究PROG對(duì)BSA熒光強(qiáng)度的影響可以很好地揭示兩者之間的相互作用機(jī)制。如圖1所示，隨著研究體系中PROG濃度的增加，BSA的熒光強(qiáng)度逐漸降低，說(shuō)明PROG誘導(dǎo)BSA的內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅，即兩者之間存在相互作用。

[BSA]1-9= 3.33×10-7mol·L-1, [PROG]1-9=(0, 3.33, 6.66, 10, 13.33, 16.66, 20, 23.33, 26.66)×10-7mol·L-1

圖1 PROG-BSA體系的熒光光譜

Fig.1 Fluorescence spectra of PROG-BSA system

3．2 PROG與BSA結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)與作用力類(lèi)型判斷

根據(jù)Stern-Volmer方程處理熒光光譜實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以進(jìn)一步推斷猝滅機(jī)理：

F0/F=1 +Ksv[Q]=1 +Kqτ0[Q],

(1)

在298 K時(shí)，PROG 對(duì)BSA的猝滅速率常數(shù)Kq為5.0×1012L·mol-1·s-1，比各種猝滅劑對(duì)生物大分子的最大碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1高出2個(gè)數(shù)量級(jí)，由此可以判斷PROG的存在誘導(dǎo)BSA的熒光產(chǎn)生了靜態(tài)猝滅[4,13]。

根據(jù)方程(2)可以計(jì)算PROG-BSA體系在不同溫度下的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n：

lg[(F0-F)/F]=lgKa+nlg[Q],

(2)

由擬合直線的斜率和截距所得結(jié)果如表1所示。隨著體系溫度的上升，PROG與BSA之間的結(jié)合常數(shù)Ka逐漸降低，進(jìn)一步確認(rèn)PROG對(duì)BSA具有靜態(tài)猝滅作用[12,14]。此外，在人體體溫范圍(36～37 ℃)內(nèi)PROG與BSA的結(jié)合常數(shù)達(dá)到104級(jí)別，說(shuō)明其進(jìn)入人體后與血液中的白蛋白具有較強(qiáng)的相互作用[14]，從而被白蛋白運(yùn)輸?shù)桨衅鞴?。通過(guò)分析藥物與蛋白質(zhì)大分子反應(yīng)前后兩者熱力學(xué)熵變?chǔ)和焓變?chǔ)的相對(duì)大小即可判斷復(fù)合物的作用力類(lèi)型[14-16]。若ΔH<0、ΔS<0，主要表現(xiàn)為范德華力和氫鍵；ΔH<0、ΔS﹥0，主要表現(xiàn)為靜電作用力；ΔH﹥0、ΔS﹥0，主要表現(xiàn)為疏水作用力。根據(jù)表1可知，ΔG<0，ΔH<0、ΔS<0，說(shuō)明反應(yīng)可以自發(fā)進(jìn)行，且PROG和BSA之間的作用力為范德華力和氫鍵。

表1 不同溫度下PROG-BSA體系的熱力學(xué)常數(shù)

3．3 PROG與BSA的結(jié)合位點(diǎn)的確定

從表1可知，PROG和BSA之間存在1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。BSA有兩個(gè)與小分子藥物結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)，分別位于結(jié)構(gòu)域ⅡA(結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ)和ⅢA(結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ)內(nèi)[14,17]。位點(diǎn)Ⅰ中含有兩個(gè)能夠產(chǎn)生熒光的氨基酸(Trp和Tyr)，而位點(diǎn)Ⅱ只含有Tyr殘基。激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，可同時(shí)激發(fā)Trp和Tyr熒光，而激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm僅能激發(fā)Tyr的熒光[18]。因此，對(duì)比不同激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)PROG對(duì)BSA的熒光猝滅程度，可確定復(fù)合物體系的結(jié)合位點(diǎn)。如圖2所示，熒光光譜結(jié)果表明，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，PROG對(duì)BSA的熒光猝滅程度明顯大于295 nm時(shí)PROG對(duì)BSA的熒光猝滅程度，即Trp殘基和Tyr殘基均參與了猝滅過(guò)程，說(shuō)明PROG和BSA的結(jié)合位點(diǎn)為位點(diǎn)Ⅰ[19]。

圖2 不同濃度PROG下BSA的熒光光譜

Fig.2 Fluorescence spectra of BSA at different concentrations of PROG

[BSA]=3.33×10-7mol·L-1, [PROG]1-5=(0, 3.33, 6.66, 10, 13.33)×10-7mol·L-1

圖3 PROG-BSA體系的同步熒光光譜。(a)λ=15 nm; (b)λ=60 nm。

Fig.3 Synchronized fluorescence spectra of PROG-BSA system. (a)λ=15 nm. (b)λ=60 nm.

3．4 PROG對(duì)BSA構(gòu)象的影響

[BSA]=[PROG]=3.33×10-7 mol·L-1

Fig.4 FT-IR spectroscopy of BSA and PROG-BSA system

表2 加入PROG前后BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的百分含量

Tab.2 Percentage of each conformation in BSA before and after addition of PROG

體系α-螺旋/%β-折疊/%β-轉(zhuǎn)角/%β-片層/%BSAPROG-BSA64.0760.6811.6626.0019.4011.994.871.33

當(dāng)PROG與BSA的物質(zhì)的量比為1∶1時(shí)，α-螺旋含量由64.07%降低到60.68%，即PRORG的存在會(huì)誘導(dǎo)BSA α-螺旋構(gòu)象減少。紅外光譜和同步熒光的結(jié)果相互印證，都表明PROG會(huì)使BSA的構(gòu)象發(fā)生變化。

3．5 PROG和BSA結(jié)合能量轉(zhuǎn)移

根據(jù)F?rster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移定理，當(dāng)小分子藥物與蛋白質(zhì)之間滿足最大距離在7 nm范圍內(nèi)，將會(huì)發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移[13,21]。如圖5所示，PROG和BSA之間存在非輻射能量轉(zhuǎn)移的可能性。將光譜重疊部分采用矩形分割法求出PROG和BSA濃度比為1 ∶1時(shí)，兩者積分值J=6.87×10-17cm·L·mol-1、R0=1.07 nm、r0=1.63 nm。PROG和BSA反應(yīng)的結(jié)合距離小于7 nm，滿足非輻射能量轉(zhuǎn)移條件，即PROG和BSA之間存在非輻射能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致BSA熒光猝滅。

[BSA]=[PROG] =3.33×10-6 mol·L-1

Fig.5 Overlapping of fluorescence spectrum of BSA(a) and ultraviolet absorption of PROG(b)

3．6 分子對(duì)接

分子模擬可以在理論上對(duì)生物大分子和活性小分子之間作用的模式進(jìn)行合理預(yù)測(cè)[13,16-17]。本研究使用AutoDock Vina對(duì)PROG和BSA的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合情況進(jìn)行模擬分析。模擬結(jié)果表明PROG進(jìn)入BSA結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ的吉布斯自由能ΔGⅠ=-36.425 kJ，進(jìn)入位點(diǎn)Ⅱ的吉布斯自由能ΔGⅡ=-34.332 kJ。根據(jù)相關(guān)熱力學(xué)理論，可以推測(cè)當(dāng)PROG和BSA結(jié)合時(shí)，PROG更傾向于進(jìn)入BSA的結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ內(nèi)結(jié)合，模擬結(jié)果與位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖6顯示了PROG進(jìn)入到BSA中的疏水空腔I時(shí)兩者形成復(fù)合物的三維構(gòu)象。通過(guò)LigPlus+軟件進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)PROG與Trp214、Lys199、Lys195、Ala291等氨基酸殘基之間存在相互作用。除此之外，PROG還與Lys195殘基之間存在鍵長(zhǎng)為0.288 nm的氫鍵。Trp214是BSA的主要發(fā)光基團(tuán)，由此可知PROG與Trp214的相互作用是引起B(yǎng)SA熒光猝滅的主要原因，該結(jié)果與熒光光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖6 PROG與BSA在結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ的分子對(duì)接模擬圖。(a)AutoDock Vina軟件分析結(jié)果；(b)Ligplus+軟件分析結(jié)果。

Fig.6 Molecular docking model of PROG and BSA. (a)Analysis results by AutoDock Vina. (b) Analysis results by Ligplus+.

4 結(jié) 論

通過(guò)整合多種光譜學(xué)和分子模擬技術(shù)方法對(duì)PROG與BSA的結(jié)合機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)研究。結(jié)果表明，PROG能夠自發(fā)與BSA形成穩(wěn)定的二元復(fù)合物。熒光光譜和分子對(duì)接結(jié)果互相印證，都表明PROG與Trp214之間的相互作用是導(dǎo)致BSA熒光猝滅的主要原因。紅外光譜結(jié)果顯示PROG誘導(dǎo)BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。在正常人體體溫條件下，PROG與BSA的結(jié)合常數(shù)達(dá)到104級(jí)別，說(shuō)明兩者之間具有較強(qiáng)的相互作用。該研究結(jié)果為進(jìn)一步探究黃體酮在生物體內(nèi)的作用機(jī)制提供了一定的參考數(shù)據(jù)。