李瀟，李雪萍，漆永紅，郭成，李敏權,

(1.甘肅農業(yè)大學植物保護學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農業(yè)科學院植物保護研究所，甘肅 蘭州 730070)

番茄(LycopersiconesculentumMill.)是茄科番茄屬一年生或多年生草本蔬菜作物，原產南美洲，我國南北方廣泛栽培[1-2].隨著栽培年限的延長，病害的發(fā)生也逐年加重，尤其是根腐病類病害已成為阻礙番茄產業(yè)發(fā)展的主要因素之一[3-4].最早于1969年在日本發(fā)現(xiàn)番茄頸腐根腐病[5]，隨后于1971年在美國也發(fā)現(xiàn)了該病害[6].如今，加拿大、墨西哥、以色列、美國、日本、韓國、南非及歐洲多數(shù)國家的番茄均受到該病害的侵染，造成嚴重損失[7-9].而我國發(fā)現(xiàn)番茄頸腐根腐病較晚，最初于2007年在北京發(fā)現(xiàn)[10]，之后在江蘇、山東、遼寧、寧夏等地多年連作的塑料大棚和日光溫室中也相繼發(fā)現(xiàn)[11-12]，如山東省東北部煙臺市、壽光市等地區(qū)均有發(fā)生，其中壽光日光溫室番茄頸腐根腐病的發(fā)病率達80%以上，致死率達30%以上，造成嚴重減產，已成為山東省主要的番茄病害之一[13].2016年在河北省唐山市豐南區(qū)多個溫室內大面積發(fā)生，發(fā)病率達30%～60%，個別棚區(qū)絕收，造成嚴重經(jīng)濟損失[14].2016年作者在調查甘肅省番茄病害時，發(fā)現(xiàn)了該病害，為明確其病原，本研究采集了多地番茄頸腐根腐病的樣品，進行病原分離與鑒定，明確其致病性，并對來自國內外的33個番茄品種進行抗病性篩選，為該病害防控技術的研究提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗儀器與材料 儀器：高壓滅菌鍋、超低溫冰箱、光照培養(yǎng)箱、人工氣候箱、分析天平、超凈工作臺、顯微鏡、高速離心機、電泳槽、PCR儀.

材料：剪刀、鑷子、90 mm培養(yǎng)皿、封口膜、打孔器、接菌針、涂布器、離心管、移液槍、槍頭、酒精燈、玻璃棒、三角瓶、燒杯、200次Fungal DNA Kit試劑盒(OMEGA)、載玻片、蓋玻片、濾紙、鋁箔紙；馬鈴薯、康乃馨葉片、葡萄糖、瓊脂、瓊脂糖、dNTP、TaqDNA聚合酶、loading Buffer、DNA Marker.試驗所用藥品均為分析純.

1.1.2 試驗培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基(葡萄糖18 g、馬鈴薯2 000 g、瓊脂15 g、水1 000 mL)；PSA培養(yǎng)基(蔗糖18 g、馬鈴薯2 000 g、瓊脂15g、水1 000 mL)；PDB培養(yǎng)基(葡萄糖20 g、馬鈴薯2 000 g、水1 000 mL)；康乃馨培養(yǎng)基(瓊脂15 g、水1 000 mL、5×5 mm康乃馨葉片).

1.1.3 供試品種 供試番茄品種：包括進口品種6個(‘精品威尼斯’‘法國紅瑞娜’‘奇歐佳美’‘紅玉189’‘粉果番茄’‘F199’)，臺灣品種4個(‘富麗’‘千禧圣女果’‘臺灣粉玉女’‘金童F1’)大陸主栽品種23個(‘精品紅美女’‘粉圣果’‘中疏四號’‘黃洋梨’‘花繡球’‘元明粉玉女’‘元明紅玉女’‘綠寶石’‘改良春桃’‘元明黃嬌子’‘大黃金麗’‘賊不偷綠寶石’‘黃圓小番茄’‘紅五彩’‘紫圣果’‘紫五彩’‘托托斯加’‘迷你紫圣果’‘魔鬼櫻桃’‘美味櫻桃’‘紅色櫻桃’‘黃色櫻桃’‘粉冠一號’).供試品種由壽禾種業(yè)(欣欣然公司)提供.

1.2 試驗方法

1.2.1 病害調查 2016年6月對甘肅省平?jīng)鍪?、天水市、武威市等地的番茄頸腐根腐病進行調查，采用五點取樣法統(tǒng)計發(fā)病植株，計算發(fā)病率[15].

1.2.2 病原分離和純化 將采回的樣品洗凈，選擇典型發(fā)病植株，從病健交界處剪下根段，切成5 mm×5 mm組織塊；70%酒精處理30 s后，放入0.1%的升汞溶液中消毒30 s，再用無菌水洗3次，放在已滅菌的濾紙上吸干水分，置于PDA平板上；25 ℃培養(yǎng)2～3 d，待菌絲長出，輕輕挑取并接種于PDA平板上進行初步純化，然后采用單孢分離法進一步純化[15-16]；將分離得到的鐮孢菌經(jīng)鏡檢，已產孢的直接進行單孢分離，未產孢的經(jīng)康乃馨培養(yǎng)基誘導產孢后進行單孢分離，將單孢子置于PSA培養(yǎng)基上，測定生長速率，觀察培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征.

1.2.3 病原鑒定 菌株鑒定采用形態(tài)學和分子生物學鑒定相結合的方法進行.鐮孢菌形態(tài)學鑒定以Booth[17]的分類系統(tǒng)為基礎，同時參考Lester等[18]和Leslie等[19]的分類系統(tǒng).根據(jù)菌落的生長特性、顏色、菌絲的形態(tài)特征、孢子的形態(tài)、大小等進行鑒定.分子生物學鑒定采用CTAB法[20]提取菌株基因組DNA，采用真菌通用引物進行ITS序列擴增，PCR擴增產物由上海生工生物工程技術服務有限公司純化并測序，利用Blastn(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，獲得相近菌株r-DNA-ITS序列，利用Clustalx 1.8按照最高同源性的原則進行排序，采用MEGA 5.0軟件Neighbor-joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并采用自舉法(bootstrap)對系統(tǒng)發(fā)育樹進行檢驗，重復1 000次.

1.2.4 致病性測定 采用盆栽法對該病原菌的菌株進行致病性測定，選取當?shù)刂髟苑哑贩N‘中蔬4號’，用70%酒精表面消毒后，用45 ℃溫水催芽，選取出芽一致的種子播種于營養(yǎng)缽中，每個營養(yǎng)缽10株，置于溫室下生長.并用打孔器在菌落邊緣取直徑6 mm菌餅4片，放入裝有150 mL PDB液體培養(yǎng)基三角瓶中，在25 ℃、125 r/min條件下振蕩培養(yǎng)4 d，用無菌水將培養(yǎng)液稀釋為濃度1.0×107個/mL孢子懸浮液，制成菌液.待番茄苗長到4～5片真葉時，在土壤下面 1～2 cm處用滅菌竹片刺傷0.5 cm× 0.1 cm植株表皮，將10 mL菌液澆灌至刺傷部位，每個菌株3個重復，每個重復10株幼苗，覆土，30 d后統(tǒng)計其發(fā)病情況，計算方法如下[16]：

發(fā)病率(%)=發(fā)病幼苗數(shù)/幼苗總數(shù)×100%

病情指數(shù)=(∑各級發(fā)病株數(shù)×病害分級代表值)/最高病級數(shù)×調查總數(shù)×100

分級標準： 0健康無??；1根基部變褐，不軟腐，不縊縮，葉子健康，根無明顯病斑；2根基部變褐，并有明顯縊縮，葉尖或葉片發(fā)黃，根變褐； 3根基部變褐腐爛，葉片發(fā)黃，根變褐甚至變黑；4根及根基部腐爛，整株幼苗壞死.

1.2.5 菌株再分離 從致病性測定發(fā)病植株中再次分離病原，培養(yǎng)并觀察其培養(yǎng)特征及顯微形態(tài)，確定是否與接入菌一致.

1.2.6 品種抗性篩選 以供試的33個品種和分離得到的致病菌(F.oxysporum)為試驗材料，育苗和接種方法同致病性測定方法一致，試驗設3次重復.

抗病性標準參考潘衛(wèi)萍、尚春明、郭威濤等[21-24]的指標，依據(jù)番茄幼苗實際發(fā)病情況調整為：免疫(I)：病情指數(shù)為0；抗病(R)：病情指數(shù)0.1～20.0；中抗(MR)：病情指數(shù)20.1～30.0；中感(MS)：病情指數(shù)30.1～40.0；感病(S)：病情指數(shù)40.1～60.0；高感 (HS)：病情指數(shù)60.1以上.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2007軟件進行統(tǒng)計分析和作圖，并采用SPSS 19.0軟件和Duncan氏新復極差法進行多重比較(P<0.05).

2 結果與分析

2.1 番茄頸腐根腐病田間調查及發(fā)病癥狀

2.1.1 發(fā)病率 調查發(fā)現(xiàn)，番茄頸腐根腐病在甘肅省番茄種植區(qū)發(fā)生普遍，大棚較田間發(fā)生嚴重，如天水地區(qū)此病害的發(fā)生率高達40%，平?jīng)龅貐^(qū)為37%，武威地區(qū)發(fā)病率最低但也達22%左右(表1).

表1 不同地區(qū)番茄頸腐根腐病田間發(fā)生情況調查

同列數(shù)據(jù)肩標不同字母表示在0.05水平上差異顯著.

Data in the same column followed by different letters are significantly different atP<0.05.

2.1.2 發(fā)病癥狀 番茄頸腐根腐病在田間的癥狀主要表現(xiàn)在莖基部有深褐色病斑，3～5葉幼苗期發(fā)病引起植株死亡，造成缺苗斷壟，5葉期至開花結果期發(fā)病，則表現(xiàn)為莖基部病斑不斷擴展，有時病斑長達5～10 cm，植株最終萎蔫死亡.該病害最初從側根入侵，在側根形成褐色壞死斑進而侵染主根，后期病斑擴展至地上莖基部.番茄頸腐根腐病的幼苗癥狀先在側根形成圓形，褐色病變，受侵染的幼苗發(fā)黃并且側根開始脫落，在主根上發(fā)生褐色壞死病斑，嚴重情況下，根皮層干燥褐變，整株死亡.成株期癥狀主要表現(xiàn)在莖基部以及根部變成黑褐色，皮層腐爛，下部葉片變黃脫落，在地面以下部分，可見褐色腐爛，縱切面可見維管束褐色、韌皮部褐色腐爛嚴重時番茄植株可能枯萎(圖1).

2.2 病原的分離鑒定

2.2.1 形態(tài)學特征 從采到的24份樣品中共分離純化到6株菌，在PSA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)，氣生菌絲羊毛狀，白色、粉色至紫色，產生粉色或紫色色素；菌株之間形態(tài)差異較大，有些菌株產生淡黃色或墨綠色微菌核；大型分生孢子鐮刀形，兩端漸尖，足細胞較明顯，多為2～4分隔，(35～47.5)μm×(3～5)μm；小型分生孢子卵形、橢圓形或腎形，假頭生，0～1分隔，(5～20)μm×(2.5～4.5)μm；厚垣孢子大量，多單生、對生、間生或頂生，球形5.5～10 μm，產孢細胞為單瓶梗，較短，單生或具分枝，(3.75～12.5)μm×(2.5～3.75)μm，參照Booth和Lester等分類系統(tǒng)，初步確定為尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporum)(圖2).

A、B：番茄幼苗發(fā)病癥狀；C、D：成株期番茄發(fā)病癥狀.A、B：Symptoms of tomato seedlings;C、D:Symptoms of tomato in adult stage.圖1 番茄頸腐根腐病發(fā)病癥狀Figure 1 Symptoms observed in the samples

A：菌株正面菌落形態(tài)；B：菌株背面菌落形態(tài)； C：大型分生孢子和小型分生孢子；D：厚垣孢子.A:Colony;B:Underside of colony；C:Macroconidia and Microcondia；D：Chlamydospore.圖2 菌株的培養(yǎng)形態(tài)及顯微形態(tài)Figure 2 Morphological characteristics of strain

2.2.2 分子生物學鑒定 將測序所得到的結果在NCBI數(shù)據(jù)庫中經(jīng)Blast后，發(fā)現(xiàn)其與尖孢鐮孢菌的同源性較高，相似性均在99%以上，建樹發(fā)現(xiàn)，此6株菌與尖孢鐮孢菌的遺傳距離為0，自展支持率為100，因此，此6株菌被鑒定為尖孢鐮孢菌.

圖3 基于18s rDNA序列構建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Construction of strain system development tree based on 18s rDNA sequence

2.3 致病性測定

如圖4所示，接種尖孢鐮刀菌后番茄植株發(fā)病明顯，癥狀典型，各菌株的發(fā)病率及病情指數(shù)如表2所示，6株菌的發(fā)病率較高，在85%左右，病情指數(shù)63左右，差異不顯著，致病力強.從其發(fā)病部位再次分離菌株進行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，其與接入時形態(tài)一致，符合柯赫氏法則，因此，此6株尖孢鐮孢菌確定為番茄頸腐根腐病的病原.

2.4 品種抗性鑒定

由表3結果可得，在供試33個番茄品種中，完全免疫的品種未發(fā)現(xiàn)；篩選得到抗病品種4個，分別是‘精品紅美女’‘花繡球’‘元明粉玉女’和‘紅色櫻桃’；中抗品種3個，分別是‘紫五彩’‘粉果番茄’和‘金童F1’；中感品種8個，分別是‘中疏四號’‘黃洋梨’‘元明紅玉女’‘大黃金麗’‘黃圓小番茄’‘紅玉189’‘臺灣粉玉女’和‘粉冠一號’；感病品種17個，分別是‘粉圣果’‘精品威尼斯’‘元明黃嬌子’‘法國紅瑞娜’‘賊不偷綠寶石’‘奇歐佳美’‘富麗’‘美味櫻桃’‘F199’‘黃色櫻桃’‘綠寶石’‘改良春桃’‘紅五彩’‘紫圣果’‘托托斯加’‘迷你紫圣果’和‘千禧圣女果’；高感品種1個，是‘魔鬼櫻桃’.

3 討論

番茄根腐類病害是一個龐大的復合體，國內很多報道將其混為一談，或者僅僅由于絲核菌屬引起的根腐或者疫霉和腐霉引起的番茄晚疫類根腐[25-27]，從而忽略了鐮孢菌引起的根腐病害，另外，不同生態(tài)區(qū)域、地理、氣候、土壤等因素的差異會導致病原菌的組成以及優(yōu)勢種的不相同.本研究首次對采自甘肅省番茄頸腐根腐病的樣品進行了病原菌的分離與鑒定，結果表明，尖孢鐮孢菌是引起該病害的主要病原，這與耿麗華等[10]的報道結果類似，其報道尖孢鐮孢菌既能引起番茄頸腐根腐病，同時還引起番茄枯萎病的發(fā)生，頸腐根腐病與枯萎病發(fā)病條件差異很大，枯萎病一般發(fā)病在高溫條件下，約30 ℃以上，而頸腐根腐病在25 ℃左右發(fā)病，二者之間的聯(lián)系有待進一步研究.對分離出的6株病原菌進行致病性測定，結果表明，經(jīng)病原菌處理30 d后，番茄植株發(fā)病率和病情指數(shù)分別為85%和63左右，張尚卿等[11]報道通過莖基部接種法和浸種法，接種15 d后，番茄莖腐根腐病的發(fā)病率分別為93.33%和66.67%.與本試驗結果有區(qū)別，引起該結果不同的原因可能是接種方法與時間不同所引起的.本試驗對33個番茄品種進行了抗性篩選試驗，結果發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)品種抗性較差，從品種材料分析，國外進口和臺灣的10個品種，其中7個表現(xiàn)為感病.這可能是由于我國傳統(tǒng)依靠引進國外品種和臺灣番茄品種增加品質和產量，但隨著栽培年限的增加，病原菌已經(jīng)對部分品種產生抗性，從而導致病情指數(shù)的上升，這與李景富等[28]的研究結果不同，其報道國外品種抗性大于國內品種抗性.由于不同種植地區(qū)的環(huán)境差異，需進一步進行大田區(qū)域試驗，確定甘肅省抗番茄根腐頸腐病的優(yōu)勢品種，方可進行大面積推廣和種植.近些年國內不斷加大對番茄種質資源的開發(fā)和培育，新的品種已經(jīng)對番茄根腐類病害產生一定抗病性，比如‘精品紅玉女’‘元明粉玉女’‘花繡球’等.本次研究豐富了我國對番茄頸腐根腐病種質資源的篩選和利用，為番茄生產提供了理論指導.同時，由于目前番茄生產大多數(shù)品種表現(xiàn)感病，故需加強品種的替換和改良工作.

A：尖孢鐮孢菌處理后；B：健康植株；A：Treated with Fusarium oxysporum;B：Healthy plants.圖4 尖孢鐮孢菌對番茄的致病性測定Figure 4 Pathogenicity of Fusarium oxysporum to tomatoes

表2 尖孢鐮孢菌對番茄的致病性測定

同列數(shù)據(jù)肩標不同字母表示在0.05水平上差異顯著.

Data in the same column followed by different letters are significantly different atP<0.05.

表3 33個番茄品種接種尖孢鐮孢菌的發(fā)病率、病情指數(shù)與抗性評價

同列數(shù)據(jù)后不同字母表示在 0.05水平上差異顯著(新復極差法).

Data in the same column followed by different letters are significantly different atP<0.05(New Complex Polarity Method).

4 結論

本研究經(jīng)病原菌分離純化培養(yǎng)、致病性測定、菌株再分離、結合菌落形態(tài)學觀察和分子鑒定，確定該病害病原是尖孢鐮刀菌.致病性測定發(fā)現(xiàn)，接種尖孢鐮孢菌的植株發(fā)病明顯，癥狀顯著，不同地區(qū)采集分離的尖孢鐮孢菌致病性均較強，發(fā)病率在85%左右，病情指數(shù)為63左右.通過品種抗性鑒定，篩選出‘精品紅美女’‘花繡球’‘元明粉玉女’和‘紅色櫻桃’4個抗性品種.