費(fèi)潔羽，楊凌杰，廖晨茜，何麗娜，陳志豪，王石磊

(浙江樹人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江 杭州 310015)

黃酮類化合物是一類常見的次生代謝產(chǎn)物，具有抗癌、抗氧化、抗炎、降低血脂和高血壓、改善血管脆性和通透性、預(yù)防冠心病和心絞痛等多種藥理活性，在藥品開發(fā)和保健食品開發(fā)中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[1-2]。黃酮大多數(shù)與糖結(jié)合，以黃酮苷的形式存在，少量以游離態(tài)存在。黃酮提取方法主要有溶劑回流提取法、大孔吸附樹脂法、超聲波或微波輔助提取法、超臨界流體提取法、酶解法等[3]。目前關(guān)于黃酮的提取已有較多研究，但靈芝中黃酮的提取研究目前仍較少。竹靈芝是一種喜熱靈芝(Ganoderma calidophilum)[4]，生長于云南、海南等地，竹靈芝中黃酮含量的相關(guān)研究則更少。超聲波能夠破壞細(xì)胞壁并增大溶劑向細(xì)胞的滲透量，有利于目標(biāo)提取成分的溶出，且超聲波的熱效應(yīng)可使溶劑和原料組織溫度升高，提高目標(biāo)提取成分的溶出，加快提取。超聲波輔助提取具有提取效率高、提取時(shí)間短、適用性廣、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，在天然產(chǎn)物的提取中應(yīng)用廣泛[5]。本文主要研究超聲波輔助下的竹靈芝中黃酮的提取。

1 材料與儀器

無水乙醇、NaNO2、NaOH、Al(NO3)3(以上均為分析純試劑)，蘆丁(純度98%，阿拉丁)，竹靈芝(市售，采于云南文山)、容量瓶，電子分析天平，紫外分光光度計(jì)(日本島津UV-124型)，超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確稱取于蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，用50 %乙醇溶解并定容至100 mL，得到濃度為1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0 ，0.2，0.4，0.6 ，0.8，1.0 mL于25 mL容量瓶中，加入1.0 mL 5 % NaNO2溶液，搖勻靜置5 min后再加入1.0 mL 10 % Al(NO3)3溶液，搖勻，放置5 min后加人10 mL 4% NaOH溶液，用50 %乙醇定容。以50 %乙醇為空白對照，在波長510 nm處測定標(biāo)準(zhǔn)樣的吸光度，得到蘆丁質(zhì)量濃度(mg/mL)與吸光度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 竹靈芝中總黃酮的提取工藝優(yōu)化

2.2.1 料液比對靈芝黃酮得率的影響

精密稱取5份待測靈芝樣品，每份1 g，置錐形瓶中，加入乙醇濃度50 %、料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60的乙醇，在60 ℃溫度下超聲提取40 min。過濾上清液，將濾液置于100 mL容量瓶中，用50 %乙醇定容。

將5種提取條件下得到的靈芝濾液分別取1.0 mL于25 mL容量瓶中，加入1.0 mL 5 % NaNO2溶液，搖勻靜置5 min后再加入1.0 mL 10 % Al(NO3)3溶液，搖勻，放置5 min后加人10 mL 4 % NaOH溶液，用50 %乙醇定容。以50 %乙醇為空白對照，在波長510 nm處測定標(biāo)準(zhǔn)樣的吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)換計(jì)算即可。

2.2.2 超聲時(shí)間對靈芝黃酮得率的影響

精密稱取6份待測靈芝樣品，每份1 g，置錐形瓶中，加入濃度50 %、料液比為1∶40的乙醇，在60 ℃下，分別在提取時(shí)間20,30,40,50,60,70 min的條件下超聲提取。后續(xù)操作同“2.2.1”所述方法，計(jì)算黃酮的提取得率。

2.2.3 乙醇濃度對靈芝黃酮得率的影響

精密稱取4份待測靈芝樣品，每份1 g，置錐形瓶中，分別加入料液比1∶40的50%，60%，70%，80%乙醇，在60 ℃下超聲提取50 min。后續(xù)操作同“2.2.1”所述方法，計(jì)算黃酮的提取得率。

2.2.4 超聲溫度對靈芝黃酮得率的影響

精密稱取4份待測靈芝樣品，每份1 g，置錐形瓶中，加入料液比1∶40，濃度70 %的乙醇，分別在40，50，60，70 ℃條件下超聲提取50 min。后續(xù)操作同“2.2.1”所述方法，隨后計(jì)算各實(shí)驗(yàn)條件下黃酮的提取得率。

2.2.5 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，把料液比、超聲時(shí)間、乙醇濃度、超聲溫度為自變量，靈芝黃酮得率為評價(jià)指標(biāo)，根據(jù)L9(34)的正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。篩選出最優(yōu)提取條件，并利用該方案進(jìn)行三次提取，驗(yàn)證方法的穩(wěn)定性

3 結(jié)果和分析

3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

將吸光度對蘆丁溶液的濃度進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程y = 0.4527x - 0.0007，R2= 0.9998，表明在該范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1和圖1。

表1 蘆丁濃度與吸光度之間的關(guān)系Tab.1 relationship between the concentration of luding and the absorbance

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.1 Relationship between rutin concentration and the absorbance

3.2 竹靈芝中總黃酮的提取工藝優(yōu)化

3.2.1 料液比對靈芝黃酮得率的影響

不同料液比下靈芝黃酮得率如圖2所示，由圖2可知，在料液比低于 1∶40 時(shí)，提取用液增加使靈芝黃酮得率也隨之增加，當(dāng)料液比超過1∶40 后，總黃酮提取得率增加緩慢。

圖2 不同提取條件與靈芝總黃酮得率之間的關(guān)系

Fig.2 the extraction yield of total flavonoids under different extraction conditions

3.2.2 超聲時(shí)間對靈芝黃酮得率的影響

不同超聲時(shí)間下靈芝黃酮得率如圖2所示。實(shí)驗(yàn)表明：超聲時(shí)間為50 min時(shí)，靈芝中黃酮提取得率最高，為6.086 mg/g；當(dāng)超聲時(shí)間未達(dá)到50 min 時(shí)，超聲時(shí)間越久，靈芝中黃酮的得率越大，可以得出一定時(shí)間的超聲波處理有利于靈芝中黃酮類化合物的提取的結(jié)論；但當(dāng)超聲時(shí)間超過50 min 后，靈芝中黃酮得率反而降低，但下降的幅度并不太大，這可能是由于超聲時(shí)間過長，導(dǎo)致靈芝中黃酮類成分被破壞，從而降低提取得率。

3.2.3 乙醇濃度對靈芝黃酮得率的影響

由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度小于70 %時(shí)，隨著乙醇濃度的增加會(huì)使靈芝中黃酮的得率也隨之上升，當(dāng)乙醇濃度大于70 %時(shí)，黃酮類化合物的得率隨著乙醇濃度的增加而呈現(xiàn)下降的趨勢。原因可能是因?yàn)橐掖紳舛炔煌?，其極性也不相同，而黃酮類化合物有很大的極性范圍，可以推斷出當(dāng)乙醇濃度為70 %時(shí)，它的極性可能與靈芝中黃酮類化合物的極性最為相似，所以在70 %的乙醇濃度下是最適合竹靈芝中黃酮的提取條件。

3.2.4 超聲溫度對靈芝黃酮得率的影響

實(shí)驗(yàn)表明：提取率隨著超聲溫度的提高而提高，達(dá)到60 ℃最大?？赡苁怯捎陔S著超聲波的溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)才變得更加激烈，從而加快了靈芝中黃酮成分的擴(kuò)散，促進(jìn)了有效成分在試劑中的溶出，有利于黃酮類化合物的浸出。

3.2.5 正交實(shí)驗(yàn)

選擇了料液比(A)、超聲時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)、超聲溫度(D)四個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，初步確定各因素的較優(yōu)條件，再采用L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝。通過正交實(shí)驗(yàn)研究了各因素對提取率的影響，確定了各影響因素的先后順序?yàn)锳>C>D>B，即料液比的影響最明顯，其次是乙醇濃度，然后是超聲溫度，最后是超聲時(shí)間。通過正交實(shí)驗(yàn)確定超聲波法提取靈芝中黃酮含量的最佳工藝條件為A3B3C2D1，即最優(yōu)的提取條件為料液比1∶50，超聲時(shí)間60 min，乙醇濃度70 %，超聲溫度50 ℃。

表2 試驗(yàn)因素水平Tab.2 Factor level of orthogonal experiment

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果Tab.3 Orthogonal experiment chart and result

3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，利用正交試驗(yàn)得出的最佳提取條件對靈芝中的黃酮進(jìn)行提取，平行進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)，三次實(shí)驗(yàn)的得率結(jié)果分別為:7.275，7.268，7.264，平均值為7.269 mg/g。從三次測定的靈芝黃酮得率可以看出，正交設(shè)計(jì)的得出的最佳提取方案，提取率較高，且具有較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

(1)以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在濃度0～1.0 mg/mL范圍內(nèi)反應(yīng)物與吸光度之間的線性關(guān)系較好。

(2)從竹靈芝中提取總黃酮時(shí)，總黃酮的得率隨著提取溶劑的增加，逐漸增加，當(dāng)提取溶劑超過40倍時(shí)，隨著提取溶劑的增加，黃酮得率的增加很緩慢；黃酮得率隨著超聲時(shí)間的增加先升高再降低，在50 min時(shí)有最高提取得率；乙醇濃度增加，黃酮提取得率先增加后減少，在70%乙醇濃度時(shí)有最高的提取得率；隨著超聲時(shí)間的增加，黃酮得率逐漸提高，到60min后，黃酮得率增加不再明顯甚至有所下降。

(3)通過正交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)利用乙醇溶液對靈芝中的黃酮進(jìn)行提取時(shí)，各因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響順序依次為料液比>乙醇濃度>超聲溫度>超聲時(shí)間，最優(yōu)的提取條件為料液比1∶50，超聲時(shí)間60 min，乙醇濃度70 %，超聲溫度50 ℃，在該條件下對靈芝中的黃酮進(jìn)行提取有最高的提取得率，提取得率約為每1g竹靈芝中可提取得7.27mg的總黃酮。