曹夏，謝菊英，肖麗?

（1.湘南學(xué)院，湖南 郴州 423000；2.湘南學(xué)院附屬醫(yī)院，湖南 郴州 423000）

0 引言

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥((Post-menopausal osteoporosis,PMOP)主要發(fā)生在絕經(jīng)后婦女，由于雌激素缺乏導(dǎo)致骨量減少及骨組織結(jié)構(gòu)變化，使骨脆性增加易于骨折的一種全身代謝疾病。我國居民骨質(zhì)疏松癥流行病學(xué)調(diào)查顯示，骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為我國50 歲以上人群的重要健康問題，65 歲以上人群骨質(zhì)疏松癥患病率達(dá)32.0 %。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有自我復(fù)制和多向分化能力，體外不同誘導(dǎo)條件下，能夠向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等不同的細(xì)胞系分化[1]。研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥引起的骨量減少往往與骨髓中脂肪組織增多相伴行[2]，通過抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞的脂肪分化，可能達(dá)到預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的作用[3]；因此本研究擬通過實驗證實電針對BMSCs 成骨和成脂分化的影響，探討其治療骨質(zhì)疏松的可能機(jī)制。

1 材料和設(shè)備

1.1 實驗動物

健康未生育3 月齡SD 大鼠，48 只，SPF 級（Ⅱ級），雌性，體質(zhì)量(230±20)g，由湘南學(xué)院動物實驗中心提供。

1.2 試劑和器材

0.25×13 mm 一次性不銹鋼毫針(華佗牌)，SDZ-Ⅱ型電針儀(華佗牌)，倒置相差顯微(Olympus)，DMEM 培養(yǎng)液(GIBCOBRL 公司),胎牛血清(GIBCOBRL 公司)，吲哚米沙星(Sigma 公司)，胰島素注射液(萬邦制藥)，地塞米松(Sigma 公司)，抗壞血酸(Sigma 公司)，CO2細(xì)胞孵箱(Heraeus)等。

2 實驗方法

2.1 動物分組及模型制備方法

將48 只雌性SD 大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、雌激素組、電針組4 組，每組各12 只。模型制備：3 月齡SD 雌性大鼠SPF 級（Ⅱ級），造模前大鼠于室內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。術(shù)前禁食12 h，2 %戊巴比妥(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，從背側(cè)入路行雙測卵巢摘除術(shù)。術(shù)后每日肌注1.5 mL 青霉素（4 萬單位/mL）抗炎，連續(xù)3 d。所有實驗動物自由攝水和進(jìn)食，飼養(yǎng)12 w。

2.2 干預(yù)措施

正常組：正常飼養(yǎng)，不做任何處理。模型組：行雙測卵巢摘除術(shù)造大鼠骨質(zhì)疏松癥模型；雌激素組：造模后，尼爾雌醇l mg·kg-1 體重，使用前配成混懸液(濃度為0.167 mg/m1)，1 次/周灌胃，連續(xù)給藥12 w；電針組：造模成功后，選取主穴腎俞、脾俞、肝俞、膈俞、命門、關(guān)元、足三里、三陰交，并通電針儀刺激，以針體輕微顫動、大鼠能耐受為宜，留針10 分鐘。在模型成功既開始針刺，每日一次，十次一療程，療程間隔3 d，共治療12 w，7 個療程。

2.3 標(biāo)本采用與檢測

2.3.1 骨密度檢測

實驗結(jié)束后處死大鼠，取出右側(cè)股骨，去除表面附著軟組織，保留骨膜，置于生理鹽水中，放入-80 ℃冰箱中保存，采用雙能X 線骨密度儀檢測股骨骨密度，單位為g/cm2，表示大鼠股骨掃描區(qū)域內(nèi)每平方厘米含有的骨礦物質(zhì)。

2.3.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)

以2%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠，無菌條件下分離大鼠左側(cè)股骨，刮除骨膜和軟組織，切除股骨兩端。用5 mL DMEM 培養(yǎng)液沖出骨髓，吹散細(xì)胞，2000 r/min，離心10 min,棄上清。用DMEM 培養(yǎng)液3 mL 制成骨髓細(xì)胞懸液,貼壁緩慢加入裝有等體積淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，2000 r/min，離心30 min。小心吸取界面層細(xì)胞，用DMEM 培養(yǎng)液洗兩次，收集細(xì)胞，血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，以4×106/mL的密度接種于培養(yǎng)瓶，加入DMEM 全培養(yǎng)液(含10 %胎牛血清，25 mmol/L HEPES，100 U/mL 青霉素，100g/mL 鏈霉素)，置37 ℃，5 % CO2孵箱中，第5 d首次換液，棄懸浮細(xì)胞。第14 d 將融合生長的細(xì)胞以2.5 g/L 胰蛋白酶消化傳代。

2.3.3 BMSCs 細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定

取生長狀態(tài)良好的P3 代細(xì)胞,傾棄培養(yǎng)液,用PBS 洗滌細(xì)胞兩遍,加入胰蛋白酶消化約2 min，在顯微鏡下見細(xì)胞變圓,有少量細(xì)胞懸浮時，加完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)，用PBS 清洗3 遍，1500 r/min 離心5 min，棄上清，加PBS 制成細(xì)胞懸液，用200 目篩網(wǎng)過濾，確定細(xì)胞濃度1×105個/mL，分別加入CD29、CD44、CD45 抗體，檢測相應(yīng)的抗原表達(dá)量。

2.3.4 RT-PCR 法檢測成脂誘導(dǎo)后BMSCs 脂蛋白脂酶LPL-mRNA 的表達(dá)

成脂肪誘導(dǎo)后，培養(yǎng)第14 d，分別提取誘導(dǎo)的正常組、模型組、電針組、雌激素組MSCs 總RNA，運用RT-PCR 檢測LPLmRNA 的表達(dá)。細(xì)胞總RNA 的提取按TRIZOL 試劑說明書進(jìn)行。利用GelPro 凝膠成像圖像分析系統(tǒng)對各組LPL 產(chǎn)物和GAPDH 進(jìn)行半定量分析。記錄各條帶積分光密度(IOD)，將檢測基因與GAPDH 條帶IOD 相比較得到其相對IOD。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均用±s 表示，檢驗各組數(shù)據(jù)正態(tài)性、方差齊性，計量資料比較采用單因素的方差分析，組間比較采用 LSD 法。

3 結(jié)果

3.1 骨密度值比較

與正常組相比，模型組骨密度值較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明切除雙側(cè)卵巢后會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生，模型制作成功。與模型組相比，雌激素組、電針組的骨密度值增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但電針組和雌激素組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明電針和雌激素治療均能減輕大鼠去卵巢后骨量丟失，且療效相似。見表1。

表1 各組大鼠右側(cè)股骨骨密度值 ±s（g/cm2）

注：與正常組比較*P<0.01；與模型組比較#P<0.01。

3.2 BMSCs 細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定

結(jié)果顯示CD29、CD44 染色的P3 代 BMSCs 顯微鏡下呈綠色，染色率達(dá) 98.1 %和96.8 %，呈陽性表達(dá)，CD45 染色率1.32 %，呈陰性表達(dá)，表明所培養(yǎng)細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，可用于后續(xù)實驗。

3.3 成脂誘導(dǎo)后BMSCs 脂蛋白脂酶（LPL）mRNA 的表達(dá)

成脂誘導(dǎo)后，模型組較正常組LPL-mRNA 表達(dá)增高（P<0.01），說明模型組BMSCs 成脂分化能力增強(qiáng)。雌激素組和電針組LPL-mRNA 表達(dá)低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明雌激素和電針治療均能夠抑制BMSCs 的成脂分化。雌激素組和電針組比較，LPL-mRNA 表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）見表2。

表2 各組BMSCs 成脂誘導(dǎo)后LPL-mRNA 的表達(dá)（±s）

表2 各組BMSCs 成脂誘導(dǎo)后LPL-mRNA 的表達(dá)（±s）

注：與正常組比較*P<0.01;與模型組比較#P<0.01。

4 討論

骨質(zhì)疏松癥是以骨量下降和微結(jié)構(gòu)破壞為主要特征，有研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥引起的骨量減少往往與骨髓中的脂肪組織增多相伴行[2]。在骨髓微環(huán)境中，成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞都來源于BMSCs，絕經(jīng)后的女性隨著年齡的增加，雌激素水平下降，成脂分化能力得到增強(qiáng)，成骨分化活動受到抑制[4]，由于成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞兩者可以相互轉(zhuǎn)換，并且存在”此消彼長”的關(guān)系[5]。因此，抑制于BMSCs的脂肪分化、促進(jìn)其成骨分化為骨質(zhì)疏松癥的治療提供了新思路。但長期應(yīng)用雌激素治療卻存在著使患乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、心血管意外等疾病增加的風(fēng)險。相對于藥物治療，針灸治療骨質(zhì)疏松癥具有標(biāo)本兼治、多靶點施治、無毒副作用等獨特優(yōu)勢，運用針刺療法治療骨質(zhì)疏松癥已得到廣泛運用并已有一定的理論支持[6-9]。鑒于此，本研究根據(jù)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的中醫(yī)學(xué)病因病機(jī)“根本在于腎虛，涉及脾、肝，病理表現(xiàn)為精氣不足、骨髓空虛、骨質(zhì)脆弱；其標(biāo)是痰瘀阻絡(luò)、氣血失和，病邪侵襲以致癥狀出現(xiàn)而發(fā)本病”[10]，確立了以補(bǔ)腎健脾、疏肝活血針刺治療原則，選用腎俞、脾俞穴、肝俞、膈俞、命門、中脘、關(guān)元、足三里、三陰交等穴，諸穴共用，以抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞的脂肪分化、促進(jìn)成骨分化為突破口，從分子水平動態(tài)、系統(tǒng)地觀察這些指標(biāo)在病變過程中的變化規(guī)律以及針刺干預(yù)的作用機(jī)制。

LPL 是脂肪細(xì)胞分化第一階段的標(biāo)志基因，為了確定電針對BMSCs 成脂分化的影響，本研究以SD 大鼠為研究對象，采用卵巢切除法模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型，在體外對大鼠BMSCs 進(jìn)行培養(yǎng)，觀察不同組別大鼠在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后，其LPL-mRNA 的表達(dá)。結(jié)果顯示：雌激素組和電針組大鼠BMSCs 的LPLmRNA 的表達(dá)較模型組降低，說明雌激素和針刺治療均能在早期降低BMSCs 的成脂分化，由于成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞存在著“此消彼長”的關(guān)系，因此可以間接反映電針可以促進(jìn)絕經(jīng)模型大鼠骨髓成骨細(xì)胞的增長，且骨密度檢查結(jié)果也提示電針治療能夠減輕大鼠去卵巢后骨量的丟失，因此抑制BMSCs 成脂分化，可能是電針治療骨質(zhì)疏松癥的重要機(jī)制。