董慶喆　谷海燕　張念凱　連媛媛　徐禛　史海磊　姜曉丹

摘要：目的 ?探討白介素17單克隆抗體（IL-17mAb）的不同給予劑量及方式在變應(yīng)性鼻炎小鼠氣道炎癥中的作用。方法 ?將48只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為A、 B、 C、 D、 E、 F組，每組8只。分別于第0、 7、 14 d將20 μg卵清蛋白（OVA）加2 mg鋁佐劑腹腔注射處理A、C、D、E及F組小鼠，間隔7 d，第22天開始進(jìn)行鼻腔激發(fā)，每天每側(cè)鼻孔各給予OVA 10 μl（共500 μg）滴鼻，連續(xù)7 d。A、C、D、E組小鼠于每次OVA鼻腔激發(fā)前1 h分別給予生理鹽水、100 ng IL-17mAb、500 ng IL-17mAb、5 μg IL-17mAb滴鼻，F(xiàn)組小鼠于每次OVA鼻腔激發(fā)前4 h給予5 μg IL-17mAb腹腔注射，B組小鼠于相同時(shí)間點(diǎn)給予等量生理鹽水腹腔注射及滴鼻。所有小鼠于最后1次激發(fā)后評(píng)估鼻部癥狀學(xué)變化，Diff-Quik染色觀察鼻腔灌洗液（NLF）中嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況，ELISA方法檢測(cè)血清及NLF中IL-6、IL-10水平，鼻黏膜組織行甲苯胺藍(lán)染色觀察肥大細(xì)胞。結(jié)果 ?4周末A組所有小鼠癥狀學(xué)評(píng)分均>5分，提示造模成功。F組小鼠的撓鼻及噴嚏次數(shù)均少于A組（P<0.05）;F組小鼠NLF中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)、血清IL-6水平低于A組，血清及NLF中IL-10水平均高于A組（P<0.05）;E組小鼠血清中IL-10水平高于A組（P<0.05）;A組小鼠鼻黏膜組織中肥大細(xì)胞數(shù)多于B組，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P<0.01）;F組小鼠鼻黏膜組織中肥大細(xì)胞數(shù)少于A組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;F組小鼠鼻黏膜組織中肥大細(xì)胞數(shù)與B組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 ?高劑量的（5 μg）IL-17mAb腹腔注射處于激發(fā)階段的變應(yīng)性鼻炎小鼠促使小鼠變應(yīng)性鼻炎癥狀明顯減輕，鼻腔灌洗液嗜酸性粒細(xì)胞減少。促使變應(yīng)性鼻炎小鼠血清中IL-6表達(dá)降低，血清中及鼻腔灌洗液中IL-10表達(dá)升高，因此推測(cè)這些細(xì)胞因子的變化可能抑制Th17/促進(jìn)Treg的分化，進(jìn)而對(duì)變態(tài)反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。

關(guān)鍵詞：白介素17單克隆抗體;鼻炎;變應(yīng)性;小鼠;氣道炎癥

中圖分類號(hào)：R765.21 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.19.018

文章編號(hào)：1006-1959（2019）19-0058-05

Effect of Interleukin-17 Monoclonal Antibody on Airway Inflammation

in Mice with Allergic Rhinitis

DONG Qing-zhe1，GU Hai-yan2，ZHANG Nian-kai3，LIAN Yuan-yuan3，XU Zhen3，SHI Hai-lei2，JIANG Xiao-dan3

（Department of Biological Specimen1，Department of Pathology2，Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery3，

Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266003，Shandong，China）

Abstract：Objective ?To investigate the effects of different doses and modes of interleukin-17 monoclonal antibody （IL-17mAb） on airway inflammation in mice with allergic rhinitis. Methods ?48 mice were randomly divided into groups A， B， C， D， E， and F， with 8 rats in each group. On the 0th， 7th， and 14th d， 20 μg of ovalbumin （OVA） plus 2 mg of aluminum adjuvant were intraperitoneally injected into mice of group A， C， D， E and F at intervals of 7 d. The nasal challenge began on the 22nd d. 10 μl （500 μg total） of OVA was administered to each nostril on each day for 7 d. Group A， C， D， and E mice were given normal saline， 100 ng IL-17 mAb， 500 ng IL-17 mAb， and 5 μg IL-17 mAb nasally 1 h before each OVA nasal challenge. Group F mice were given. 5 μg of IL-17mAb was intraperitoneally injected 4 h before OVA nasal challenge， and group B mice were given the same amount of normal saline intraperitoneal injection and nasal drops at the same time point. All mice were evaluated for nasal symptom changes after the last challenge. Diff-Quik staining was used to observe eosinophil infiltration in nasal lavage fluid （NLF）. ELISA was used to detect the level of IL-6 and IL-10 in serum and NLF.The nasal mucosa was stained with toluidine blue for observation of mast cells.Results ?After 4 weeks， all mice in group A had a symptoms score of >5， suggesting successful modeling. The number of sneezing and sneezing in group F was lower than that in group A （P<0.05）. The number of eosinophils ?in NLF and serum IL-6 of group F were lower than those in group A， IL-10 in serum and NLF of group F was higher than that of group A （P<0.05）. The level of IL-10 in serum of group E was higher than that of group A （P<0.05）. The number of mast cells in nasal mucosa of group A was higher than that of group B，the difference was significant （P<0.01）. The number of mast cells in nasal mucosa of group F was less than that of group A， but the difference was not statistically significant （P>0.05）. The number of mast cells in nasal mucosa of group F was similar to group B，there was no significant difference in the B group （P>0.05）. Conclusion ?High-dose （5μg） IL-17mAb intraperitoneal injection of allergic rhinitis mice in the stimulating phase promotes a significant reduction in allergic rhinitis in mice and a decrease in eosinophils in nasal lavage fluid. Decrease the expression of IL-6 in the serum of mice with allergic rhinitis， and increase the expression of IL-10 in serum and nasal lavage fluid. Therefore， it is speculated that changes in these cytokines may inhibit Th17/promoting the differentiation of Treg， thereby inhibiting allergic reactions.

Key words：Interleukin-17 monoclonal antibody;Rhinitis;Allergic;Mouse;Airway inflammation

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是特應(yīng)性機(jī)體接觸過敏原后主要由IgE介導(dǎo)的多種細(xì)胞因子參與的鼻黏膜非感染性疾病，是常見呼吸道慢性疾病[1]。有資料表明，AR與Th1、Th2、Th17和Treg等細(xì)胞參與的免疫失衡有著密切聯(lián)系[2]。白細(xì)胞介素17A（IL-17A）是近年發(fā)現(xiàn)的由Th17等多種細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，可以募集炎癥細(xì)胞，參與炎癥性疾病。研究表明IL-17A參與變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病過程，促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞分泌相關(guān)炎癥因子，增強(qiáng)嗜酸性粒細(xì)胞活 ? 性[3]。本研究擬通過體內(nèi)試驗(yàn)探討白介素17單克隆抗體（IL-17mAb）不同劑量及給藥方式對(duì)變應(yīng)性鼻炎小鼠模型氣道炎癥過程中的效應(yīng)及相關(guān)機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器 ?鋁佐劑（Thermo），卵清蛋白（ovalbumin，OVA，Ⅲ級(jí)，Sigma），IL-17單克隆抗體（Sigma），IL-6及IL-10 ELISA試劑盒（Elabscience），紫外分光光度儀（Beckman，DUR640），Diff-Quik試劑盒（Solarbio），全電動(dòng)智能顯微鏡（Olympus，BX63），細(xì)胞離心涂片機(jī)（Thermo scientific shandon cytospin 4）。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組處理 ?SPF級(jí)BALB/c小鼠48只，6～8周齡，雌性，20～25 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，實(shí)驗(yàn)前給予適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。所有實(shí)驗(yàn)操作通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將48只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字法分為A、B、C、D、E和F組，每組8只，分別于第0、7、14天將20 μg OVA加2 mg鋁佐劑腹腔注射處理A、C、D、E及F組小鼠，間隔7 d，第22天開始進(jìn)行鼻腔激發(fā)，每天每側(cè)鼻孔各給予OVA 10 μl（共500 μg）滴鼻，連續(xù)7 d。A、C、D、E組小鼠于每次OVA鼻腔激發(fā)前1 h分別給予生理鹽水（每側(cè)鼻孔各10 μl）、100 ng IL-17 mAb（濃度5 μg/ml，每側(cè)鼻孔各10 μl）、500 ng IL-17mAb（濃度25 μg/ml，每側(cè)鼻孔各10 μl）、5 μg IL-17mAb（濃度250 μg/ml，每側(cè)鼻孔各10 μl）滴鼻，F(xiàn)組小鼠于每次OVA鼻腔激發(fā)前4 h給予5 μg IL-17mAb腹腔注射（濃度50 μg/ml，100 μl），B組小鼠于相同時(shí)間點(diǎn)給予等量生理鹽水腹腔注射及滴鼻。

1.3癥狀學(xué)評(píng)分 ?于4周末最后1次鼻腔激發(fā)完成后觀察30 min并進(jìn)行疊加計(jì)分評(píng)價(jià)動(dòng)物模型癥狀，根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分，撓鼻1～5次計(jì)1分，6～15次計(jì)2分，>15次計(jì)3分;噴嚏1～3個(gè)計(jì)1分， 4～10個(gè)計(jì)2分，>10個(gè)計(jì)3分;流涕至前鼻孔計(jì)1分，流出前鼻孔計(jì)2分，涕流滿面計(jì)3分;總分如超過5分，表示造模成功。

1.4血清IL-6及IL-10含量測(cè)定 ?于4周末最后 ? 1次激發(fā)完成后24 h，各組小鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 μl/g）麻醉后，摘眼球取全血于EP管中，4℃離心機(jī)，3000 r/min，離心10 min，留取血清-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。ELISA法檢測(cè)血清中IL-6、IL-10的含量（按照說明書逐步操作）。

1.5鼻腔灌洗液（nasal lavage fluid，NLF）嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及上清液中IL-6、IL-10含量測(cè)定 ?所有小鼠取血后斷頭處死，將頭部皮膚剝離，剪除下頜骨，將鼻咽部暴露，移液器取500 μl PBS溶液自鼻咽部開口處緩慢滴入鼻腔，自前鼻孔收集NLF，重復(fù) ? ? 2 次。4℃離心機(jī)，5000 r/min，離心15 min，將上清

-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。沉淀物?00 μl PBS重懸，置于細(xì)胞離心涂片機(jī)，600 r/min，離心6 min。自然晾干后進(jìn)行Diff-Quik染色，封片，計(jì)算嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)，判斷嗜酸性粒細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)為分葉核，并且細(xì)胞質(zhì)中有嗜酸性顆粒。ELISA法檢測(cè)NLF上清液中IL-6及IL-10的含量（按照說明書逐步操作）。

1.6鼻黏膜組織中肥大細(xì)胞計(jì)數(shù) ?將小鼠鼻部組織置于4%的多聚甲醛溶液中固定48 h，流水沖洗組織4 h，然后置于20%的EDTANa脫鈣液中進(jìn)行脫鈣。待脫鈣完成后，給予石蠟包埋，切片。將鼻黏膜組織行甲苯胺藍(lán)染色，于低倍鏡下鼻黏膜上皮下固有層選取5個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞多的區(qū)域，高倍鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)（選取10個(gè)高倍鏡，×400），取每高倍鏡視野下的均數(shù)。計(jì)算肥大細(xì)胞數(shù)，顯微鏡下肥大細(xì)胞胞質(zhì)呈異染性紫紅色。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 ?采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用M（P25，P75）表示，非參數(shù)Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

2結(jié)果

2.1癥狀學(xué)評(píng)分比較 ?4周末A組所有小鼠癥狀學(xué)評(píng)分均>5分，按照上述行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，表示造模成功。A、B、C、D、E、F組評(píng)分分別為7.0（6.3，8.0）、1.5（1.0，2.8）、8.0（7.0，8.8）、6.5（6.0，7.8）、5.5（4.3，6.0）及3.0（3.0，4.8）分。F組小鼠的撓鼻及噴嚏次數(shù)少于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=23.312，P=0.013;H=23.812，P=0.010），見表1。

2.2 NLF中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)比較 ?A組小鼠NLF中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)高于B組，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（H=30.750，P=0.000）。F組小鼠NLF中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=21.625，P=0.030），見圖1。

2.3血清及NLF中IL-6、IL-10含量比較 ?A組小鼠血清及NLF中IL-6水平高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=21.562，P=0.031;H=26.250，P=0.003），A組小鼠NLF中IL-10水平低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=22.125，P=0.024），A組小鼠血清中IL-10水平低于B組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=17.375，P=0.196）。F組小鼠血清中IL-6水平低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=22.500，P=0.020）。F組小鼠血清及NLF中IL-10水平高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=26.938，P=0.002;H=24.250，P=0.008）。E組小鼠血清中IL-10水平高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=21.688，P=0.029），見圖2。

2.4鼻黏膜組織中肥大細(xì)胞表達(dá)情況 ?A組小鼠鼻黏膜組織中肥大細(xì)胞數(shù)多于B組，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（H=28.312，P=0.001）。F組小鼠鼻黏膜組織中肥大細(xì)胞數(shù)少于A組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=17.062，P=0.222），F(xiàn)組小鼠鼻黏膜組織中肥大細(xì)胞數(shù)與B組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=11.250，P=1.000），見圖3、圖4。

3討論

IL-17A是Th17細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞合成和分泌IL-6、IL-8等細(xì)胞因子，是一種致炎細(xì)胞因子[4]。在多種慢性炎癥性疾病、變態(tài)反應(yīng)及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用[5]。有多個(gè)研究顯示了IL-17A在變應(yīng)性鼻炎發(fā)病中的作用[6，7]。顧兆偉等[8]使用10 μg的IL-17A抗體于每次OVA激發(fā)前30 min滴鼻，發(fā)現(xiàn)IL-17A抗體可以抑制變應(yīng)性鼻炎鼠模型中IL-17A及Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RORγtmRNA表達(dá)水平，升高Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA表達(dá)水平，但是關(guān)于變應(yīng)性鼻炎小鼠癥狀學(xué)及炎癥細(xì)胞的影響沒有進(jìn)行研究和分析，只對(duì)這個(gè)抗體濃度進(jìn)行了研究。為了尋找更有效的抗體濃度及給藥方式，在本研究中探討了不同濃度及給藥方式下IL-17mAb在變應(yīng)性鼻炎小鼠模型氣道炎癥中的作用，發(fā)現(xiàn)F組小鼠撓鼻及噴嚏次數(shù)均少于A組（P<0.05），鼻腔灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)少于A組（P<0.05）。為今后IL-17mAb在治療變應(yīng)性鼻炎的研究中奠定了一定的基礎(chǔ)。

IL-6主要由T淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等所分泌，在激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化、分化、增殖及炎癥反應(yīng)中起重要作用[9]。已有研究證實(shí)Treg細(xì)胞通過抑制Th2、Th17細(xì)胞分化，在變態(tài)反應(yīng)性疾病中起到負(fù)調(diào)節(jié)的作用[2，10]，而IL-6具有誘導(dǎo)Th17抑制Treg分化的作用[11]。IL-10能抑制多種促炎細(xì)胞因子、黏附分子和趨化因子的表達(dá)，具有抗炎作用。IL-10在Treg的分化和功能行使中也起著非常重要的作用。Treg細(xì)胞可通過分泌細(xì)胞因子IL-10和/或TGF-β來抑制抗原特異性免疫應(yīng)答，使機(jī)體在一定條件下產(chǎn)生免疫耐受[12，13]。本研究發(fā)現(xiàn)，變應(yīng)性鼻炎小鼠血清及鼻腔灌洗液中IL-6水平均高于正常對(duì)照組（P<0.05）;鼻腔灌洗液中IL-10水平低于正常對(duì)照組（P<0.05）;5 μg的IL-17mAb腹腔注射干預(yù)后使得變應(yīng)性鼻炎小鼠血清中IL-6水平降低（P<0.05）;血清及鼻腔灌洗液中IL-10水平均升高（P<0.05）;5 μg的IL-17mAb滴鼻亦使變應(yīng)性鼻炎小鼠血清中IL-10水平升高（P<0.05），進(jìn)而對(duì)變應(yīng)性鼻炎小鼠氣道炎癥起到了保護(hù)作用。

綜上所述，高劑量的（5 μg）IL-17mAb腹腔注射處于激發(fā)階段的變應(yīng)性鼻炎小鼠，促使小鼠變應(yīng)性鼻炎癥狀明顯減輕，鼻腔灌洗液嗜酸性粒細(xì)胞減少并促使變應(yīng)性鼻炎小鼠血清中IL-6表達(dá)降低，血清中及鼻腔灌洗液中IL-10表達(dá)升高，因此推測(cè)這些細(xì)胞因子的變化可能抑制Th17/促進(jìn)Treg的分化，進(jìn)而對(duì)變態(tài)反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。本研究不足之處在于腹腔注射組沒有進(jìn)行不同劑量的對(duì)比研究，沒有探討出效價(jià)更好的劑量，有待于今后的工作中進(jìn)一步研究。

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