周其洋，張書泰

(佛山市海天(高明)調(diào)味食品股份有限公司，廣東 佛山 528500)

谷氨酸是醬油等調(diào)味食品中最關(guān)鍵的呈味物質(zhì)之一，是衡量醬油質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[1,2]。醬油釀造原料中含有40%～50%的谷氨酰胺，如果能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為谷氨酸，不僅能提升原料的利用率，而且是釀造天然高品質(zhì)原油的技術(shù)支撐[3]。在醬油釀造過(guò)程中，米曲霉所產(chǎn)的谷氨酰胺酶是將谷氨酰胺水解為谷氨酸最重要的關(guān)鍵酶[4,5]。

與添加外源谷氨酰胺酶產(chǎn)品相比，通過(guò)菌種誘變選育高產(chǎn)谷氨酰胺酶的米曲霉，既提高了醬油的谷氨酸含量，降低了生產(chǎn)成本，又保證了釀造醬油的色、香、味[6-9]。傳統(tǒng)的菌種誘變方法包括物理誘變(如紫外、60Co、N+離子注入等)和化學(xué)誘變(如EMS、亞硝基胍等)。其中物理誘變回復(fù)突變嚴(yán)重，且多年的誘變?nèi)菀仔纬烧T變疲勞，而化學(xué)誘變的誘變劑多具有強(qiáng)致癌性[10-12]。常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)生物誘變育種技術(shù)是一種新型的誘變手段，具有射流溫度低，產(chǎn)生的等離子體均勻，無(wú)需真空裝置，操作簡(jiǎn)便，成本低，與生物大分子和細(xì)胞作用明顯等優(yōu)點(diǎn)[13-17]。目前已經(jīng)在提升米曲霉產(chǎn)曲酸和蛋白酶活力方面取得了良好效果，但尚未有利用ARTP誘變選育谷氨酰胺酶高產(chǎn)菌株的報(bào)道。

本研究利用剛萌發(fā)的孢子這一敏感受體，采用ARTP誘變技術(shù)進(jìn)行誘變，結(jié)合平板快速篩選和96孔板高通量檢測(cè)，建立了一套針對(duì)谷氨酰胺酶的米曲霉菌種高通量誘變選育方法，并通過(guò)醬油發(fā)酵驗(yàn)證了目標(biāo)菌株在高產(chǎn)谷氨酸方面的突出效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 出發(fā)菌株

滬釀3.042：購(gòu)自廣東省微生物研究所；菌株3.811、336-2、A98和A1428：由本公司菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：KH2PO41 g，MgSO40.5 g，(NH4)2SO40.5 g，可溶性淀粉20 g，豆汁1000 mL，于115 ℃滅菌15 min。

平板初篩培養(yǎng)基：L-谷氨酰胺10 g，酵母浸膏5 g，K2HPO41 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.5 g，酚紅0.015 g，于121 ℃滅菌15 min。

復(fù)篩培養(yǎng)基(種曲培養(yǎng)基)：麩皮12 g，豆粕3 g，水8 mL于250 mL容量瓶中，攪拌均勻后于121 ℃滅菌15 min。

制曲培養(yǎng)基：豆粕∶麩皮∶水為80∶20∶60，攪拌均勻后于121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 試劑

L-谷氨酰胺：純度>99%，美國(guó)西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich)生產(chǎn)；谷氨酸檢測(cè)試劑盒：德國(guó)拜發(fā)公司(R-Biopharm)生產(chǎn)；其他試劑：均為分析純，采用雙蒸水配制。

1.1.4 主要儀器

SKY-2102C恒溫振蕩搖床 上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(HPS-200生化培養(yǎng)箱) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；LB941多功能酶標(biāo)儀 德國(guó)Berthold公司；ARTP-Ⅲ誘變育種儀 思清源生物科技有限公司；臺(tái)式離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TD5M-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)；Thermo Shaker微孔板恒溫振蕩器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 出發(fā)菌株的選擇

對(duì)菌株滬釀3.042、3.811、336-2、A98和A1428進(jìn)行酶系及發(fā)酵性能測(cè)定，選擇綜合性能較好的菌株作為出發(fā)菌株。

1.2.2 孢子萌發(fā)敏感體的培育

孢子懸浮液的制備：選擇成熟的斜面菌種，用孢子鏟鏟取一平鏟孢子于裝有50 mL生理鹽水(另外添加了0.1%吐溫80)的150 mL三角瓶中，三角瓶中裝有玻璃珠，于恒溫振蕩搖床200 r/min振蕩10 min，過(guò)G2砂芯漏斗，得孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，調(diào)整濃度為108個(gè)/mL。

萌發(fā)敏感體的培育：吸取孢子懸浮液，按10%(V/V)接種量接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，于恒溫震蕩搖床中160 r/min，30 ℃培養(yǎng)4 h，使得孢子剛剛萌發(fā)，用G3砂芯漏斗過(guò)濾去除未萌發(fā)的孢子，截留萌發(fā)的孢子，用生理鹽水洗下，重懸，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，調(diào)整濃度為107個(gè)/mL，獲得萌發(fā)敏感體菌懸液，備用。

1.2.3 ARTP誘變時(shí)間的確定

選擇不同的誘變處理時(shí)間(20，40，60，80，100，110，120，140，160 s)，在功率120 W、氣流量10 L/min的條件下，對(duì)萌發(fā)敏感體進(jìn)行ARTP誘變，以未經(jīng)誘變的菌懸液為對(duì)照，涂布平板，計(jì)算致死率。

1.2.4 誘變菌株平板初篩

孢子萌發(fā)敏感體經(jīng)ARTP誘變后，將孢子液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，進(jìn)行涂布，于30 ℃培養(yǎng)。在平板培養(yǎng)基上，挑選生長(zhǎng)速度快、紅色變色圈大的菌落，接種試管斜面，確定為初篩菌株。

1.2.5 誘變菌株制曲復(fù)篩

將初篩菌株進(jìn)行小規(guī)模制曲發(fā)酵，檢測(cè)成曲的孢子數(shù)、中性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、糖化酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶活力。其中，孢子數(shù)的檢測(cè)方法參照文志州的方法；中性蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶活力的檢測(cè)方法參照李荔等的方法；纖維素酶、果膠酶、糖化酶的檢測(cè)方法參照譚永水等的方法[18-20]。

1.2.6 誘變菌株快速發(fā)酵

采用高鹽稀態(tài)發(fā)酵法，于30 ℃發(fā)酵20 d。發(fā)酵醪汁過(guò)濾，取濾液檢測(cè)發(fā)酵原油的總酸、氨基氮、谷氨酸指標(biāo)。篩選綜合性能優(yōu)異的菌株，確定為復(fù)篩菌株。

1.2.6.1 總酸、氨基氮的測(cè)定

總酸和氨基氮的檢測(cè)參照李荔等的方法。

1.2.6.2 L-谷氨酸的測(cè)定

L-谷氨酸采用德國(guó)拜發(fā)公司(R-Biopharm)的谷氨酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 原油氨基酸分析

過(guò)濾醬渣，取過(guò)濾的醬油測(cè)得游離氨基酸。測(cè)定過(guò)程委托中廣測(cè)進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 出發(fā)菌株的選擇

通過(guò)制曲測(cè)定菌株滬釀3.042、3.811、336-2、A98和A1428的孢子數(shù)、中性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、糖化酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶的活力；通過(guò)快速醬油發(fā)酵測(cè)定其總酸、氨基氮、谷氨酸等指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 出發(fā)菌株主要指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，菌株A1428綜合酶活力和醬油發(fā)酵后L-谷氨酸含量相對(duì)較高。因此，以菌株A1428為出發(fā)菌株進(jìn)行ARTP誘變，選育高產(chǎn)谷氨酰胺酶活力的菌株。

2.2 ARTP誘變時(shí)間的確定

將菌株A1428孢子懸浮液適當(dāng)稀釋后，取10 μL在誘變育種儀上進(jìn)行誘變，設(shè)定功率為120 W，氣流量為10 L/min。誘變時(shí)間為20，40，60，80，100，110，120，140，160 s，以0 s作為對(duì)照，誘變結(jié)束后用生理鹽水洗滌墊片，適當(dāng)稀釋后取100 μL涂布，于30 ℃培養(yǎng)72 h，計(jì)算誘變致死率，見(jiàn)圖1。

圖1 ARTP致死率曲線圖

由圖1可知，隨著誘變處理時(shí)間的延長(zhǎng)，曲霉致死率逐漸上升。當(dāng)誘變處理時(shí)間為40～100 s時(shí)，曲霉致死率變化較小，均在80%左右。誘變時(shí)間增加至120～140 s時(shí)，致死率達(dá)到90%～95%；當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到160 s時(shí)，曲霉致死率達(dá)到100%。為了獲得較高正突變率和較高高產(chǎn)谷氨酰胺酶活力的菌株，本試驗(yàn)將致死率設(shè)定在90%以上。因此，選擇120 s作為ARTP的誘變處理時(shí)間。

2.3 誘變菌株初篩平板

菌株A1428孢子萌發(fā)敏感體經(jīng)ARTP誘變后，在平板培養(yǎng)基上篩選得到5株生長(zhǎng)快、顏色變化快、色澤深的菌落作為初篩菌株，見(jiàn)圖2。

圖2 誘變菌株平板初篩

2.4 誘變菌株小試復(fù)篩分析

將初篩得到的誘變菌株酶活力和發(fā)酵進(jìn)行小試復(fù)篩。選擇醬油制曲中菌株孢子數(shù)、中性蛋白酶活力、淀粉酶活力和谷氨酰胺酶活力評(píng)價(jià)初篩菌株酶活力。以發(fā)酵后原油總酸、氨基氮和L-谷氨酸含量評(píng)價(jià)菌株發(fā)酵性能，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 誘變菌株制曲指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

由表2可知，制曲階段誘變菌株A17的孢子數(shù)僅為59億個(gè)/g，不適于工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。誘變菌株A235的中性蛋白酶活力太低，不利于曲料中蛋白質(zhì)水解和原料利用。誘變菌株A103、A380和A457中，菌株A380的綜合酶活力較高，孢子數(shù)適宜。其中，誘變菌株A380制曲階段谷氨酰胺酶活力最高，發(fā)酵階段氨基氮含量和L-谷氨酸含量較高。

2.5 菌株發(fā)酵原油氨基酸比較

發(fā)酵結(jié)束后，過(guò)濾醬渣，取過(guò)濾的醬油測(cè)得游離氨基酸，比較菌株A1428及誘變菌株A380發(fā)酵原油中16種氨基酸分布，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 原油游離氨基酸含量比較

續(xù) 表

由表3可知，2株菌株發(fā)酵原油16種氨基酸中谷氨酸含量占比最高，菌株A380的游離氨基酸總量高于A1428。其中，菌株A380原油鮮味氨基酸Glu和Asp較菌株A1428高，這可能與菌株谷氨酰胺酶活力存在差異有關(guān)；菌株A380和A1428原油甜味氨基酸(Thr、Ser、Pro、Gly、Ala)所占比例分別為32%和37%；菌株A380和A1428原油苦味氨基酸(Met、Ile、Leu、Phe、His、Lys、Arg)所占比例分別為35%和26%[21,22]。氨基酸含量是醬油風(fēng)味的一個(gè)重要指標(biāo)，菌株A380原油中鮮味氨基酸、甜味氨基酸較出發(fā)菌株A1428都有一定的提升，苦味氨基酸相對(duì)較低，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本文以綜合性能優(yōu)良的醬油生產(chǎn)曲霉菌株A1428為出發(fā)菌株，利用ARTP作為誘變方法，最佳誘變條件為：功率120 W，氣流量10 L/min，誘變時(shí)間120 s。經(jīng)平板初篩和醬油制曲、發(fā)酵復(fù)篩，結(jié)合96孔板法建立高通量篩選誘變菌株的方法，得到一株高產(chǎn)谷氨酰胺酶菌株A380。該菌株谷氨酰胺酶活力較出發(fā)菌株高25%，發(fā)酵原油谷氨酸含量提高了20%。比較出發(fā)菌株和誘變菌株A380發(fā)酵原油氨基酸分布，發(fā)現(xiàn)菌株A380原油中鮮味氨基酸、甜味氨基酸較出發(fā)菌株A1428都有一定的提升，苦味氨基酸相對(duì)較低。

誘變菌株A380的中性蛋白酶和淀粉酶相比出發(fā)菌株都有一定的提升，對(duì)原料中蛋白質(zhì)等大分子的分解、轉(zhuǎn)化都有重要的作用。下一步可擴(kuò)大試驗(yàn)規(guī)模，繼續(xù)研究誘變菌株A380的穩(wěn)定性、抗雜菌能力，以及氨基氮生產(chǎn)率、谷氨酸生成率、全氮水解率和原料利用率等經(jīng)濟(jì)指標(biāo)，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。