高曉娟，劉鳳紅，王君高

(1.齊魯理工學院，濟南 250200；2.齊魯工業(yè)大學，濟南 250200)

濰坊一醬油生產(chǎn)廠商生產(chǎn)的某批次部分醬油出現(xiàn)脹罐問題，醬油在貯存過程中出現(xiàn)產(chǎn)氣脹罐的現(xiàn)象，不但破壞了產(chǎn)品外觀，也降低了產(chǎn)品質(zhì)量，包括營養(yǎng)成分的破壞、pH值的改變等，給生產(chǎn)企業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，同時，脹罐爆裂還可能危及人身安全[1]。因此，研究醬油脹罐問題勢在必行。

該研究欲從微生物角度分析脹罐問題產(chǎn)生的原因，分析產(chǎn)氣微生物的種類，并通過添加防腐劑或改變滅菌溫度實現(xiàn)脹罐問題的解決[2,3]。另外，研究脹罐醬油的原因不僅可以預防和解決醬油脹罐問題，同時對普遍存在于食品行業(yè)中的脹罐現(xiàn)象提供了一定的指導作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脹罐醬油：取自山東某釀造廠；達標醬油：取自脹罐醬油釀造廠及實驗室自制醬油；酒精：實驗室自制93% vol食用酒精；AgNO3、鉻酸鉀、NaCl、NaOH、苯甲酸鈉：均為分析純，天津市大茂化學試劑廠；牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂：均為生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海市海宏實驗設(shè)備有限公司；恒溫水浴鍋 余姚市亞星儀器儀表有限公司；GMSX-280滅菌鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；XS-212-201光學顯微鏡 南京江南永新光學有限公司；MP1002電子天平 上海恒平科學儀器有限公司；超凈工作臺 江蘇凈化設(shè)備有限公司。

1.3 實驗分析方法

1.3.1 酸度的測定

根據(jù)酸堿中和原理，用NaOH標準溶液滴定試樣中的總酸，以pH 8.2為電位滴定終點，根據(jù)消耗NaOH標準溶液的體積計算出試樣中總酸的含量。

1.3.2 醬油鹽含量(以氯化鈉計)的測定[4]

該方法是以鉻酸鉀為指示劑，用AgNO3滴定樣品中的NaCl。此法是利用AgNO3與NaCl反應產(chǎn)生乳白色沉淀，當溶液中存在游離的Ag+時，鉻酸鉀與其發(fā)生顯色反應，變?yōu)殚偌t色即為滴定終點。根據(jù)消耗的AgNO3標準溶液的體積計算出試樣中的鹽含量。

1.4 微生物的篩選方法

1.4.1 培養(yǎng)基的選擇

醬油培養(yǎng)基：取達標醬油250 mL于500 mL三角瓶中，瓊脂4.5 g于250 mL三角瓶中并加入水50 mL，121 ℃滅菌20 min。冷卻到50 ℃左右，在超凈工作臺上，將瓊脂倒入滅菌后的醬油中混勻即可。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH 7.0～7.2。

馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH自然。

在無菌條件下，取脹罐醬油和達標醬油各200 μL于3種培養(yǎng)基平板上，涂布均勻后，于30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，觀察微生物的生長情況。

1.4.2 革蘭氏染色法[5]

制片(涂菌→干燥→固定)→染色(初染→媒染→脫色→復染)→干燥→鏡檢(革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色)。

1.5 防腐劑的添加對醬油的影響實驗

實驗使用的防腐劑為苯甲酸鈉和酒精[6]。采用酒精作為防腐劑之一，原因有以下幾點：一是醬油本身含有一定量的酒精，酒精的存在對醬油香氣的產(chǎn)生有一定作用；二是酒精具有一定的殺菌作用，在食品中加入酒精會有一定抑菌效果；三是現(xiàn)在的防腐劑開發(fā)主要向著天然提取物發(fā)展，酒精作為防腐劑具有安全性。此外，將酒精添加到一些調(diào)味品中，可以增加調(diào)味品的作用，如酒精可以去腥味。

1.5.1 酒精對微生物抑制情況的研究

取實驗室自制醬油1600 mL分裝到8個250 mL三角瓶中，每個三角瓶裝200 mL，80 ℃滅菌30 min，冷卻后按表1加入苯甲酸鈉和酒精?；靹蚍饪?，室溫保存。

表1 防腐劑的添加量

將上述醬油放置40 d后，分別取1 mL于平板上，倒入冷卻到40 ℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)基冷卻后，將其放入恒溫培養(yǎng)箱中，30 ℃倒置培養(yǎng)1 d，取出，記錄菌落數(shù)[7]。

1.5.2 防腐劑對脹氣微生物的抑制情況

取實驗室自制醬油5000 mL，80 ℃滅菌30 min，分裝到9個550 mL塑料瓶中，每瓶500 mL。每瓶中加入脹罐醬油10 mL，按表2加入防腐劑?；靹蚝?，用實驗室自制醬油將瓶補滿。用排空氣體的氣球封口，室溫保存，觀察產(chǎn)氣情況。

表2 防腐劑的種類及添加量

1.6 滅菌溫度對醬油的影響實驗

取脹罐醬油300 mL分裝到3個250 mL三角瓶中，分別在70，80，90 ℃滅菌20 min，冷卻后裝入細口的塑料瓶(250 mL)中，再添加實驗室醬油100 mL，混勻后，用排空空氣的氣球封口，室溫保存，觀察產(chǎn)氣情況。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 醬油成分分析

本實驗對該廠的脹罐醬油和達標醬油的酸度、含鹽量(以氯化鈉計)進行了測定，兩者進行對比，結(jié)果見表3。

表3 達標醬油與脹罐醬油化學成分分析結(jié)果

由表3可知，達標醬油與脹罐醬油的酸度無明顯的差異，總酸均低于國家標準，可以認為引起脹罐發(fā)生的微生物不產(chǎn)酸；食鹽是殺死和抑制微生物生長的防腐劑，也是各種酶活力的抑制劑，不同食鹽含量對各種微生物有著不同的抑制作用。國家標準(GB-3-77)規(guī)定，醬油衛(wèi)生標準要求食鹽含量不低于15 g/dL(以氯化鈉計)。通過實驗證明，樣品中的食鹽含量亦在國標控制范圍內(nèi)，初步排除是常引起醬油脹罐的耐鹽性產(chǎn)膜酵母污染的可能性[8]。

2.2 產(chǎn)氣微生物的篩選分析[9-12]

2.2.1 在醬油培養(yǎng)基上

無任何微生物生長，培養(yǎng)時間不斷延長，也沒有微生物的生長。

2.2.2 在馬鈴薯培養(yǎng)基上

培養(yǎng)3 d后，有菌落生成，且菌落形態(tài)各異，證明生長的微生物種類較多。分別取2種典型菌落進行實驗分析，經(jīng)鏡檢觀察到，一種微生物大小與啤酒酵母相近，呈球狀，耐高鹽，但生長緩慢，經(jīng)鑒定該菌不產(chǎn)氣；另一種微生物經(jīng)革蘭氏染色為革蘭氏陽性菌，有芽孢，經(jīng)產(chǎn)氣實驗鑒定有氣體產(chǎn)生，但生長緩慢，原因可能是該菌的耐鹽性不高，但是可以在醬油內(nèi)以芽孢的形式存活。

2.2.3 在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上

菌落呈乳白色，邊緣不均勻，菌落無光澤。該菌呈球狀，為革蘭氏陰性菌，不產(chǎn)芽孢，且無氣體產(chǎn)生。

上述實驗表明，在脹罐醬油中不僅含有產(chǎn)氣的微生物，同時含有不產(chǎn)氣的微生物。具體是何種微生物，需要后續(xù)的大量科研工作。

2.3 防腐劑對脹罐問題的影響

2.3.1 酒精的抑菌效果

實驗結(jié)果表明，加入1%酒精的樣品醬油在室溫保存2個月后，外觀無特殊現(xiàn)象；而未添加酒精的樣品醬油表層形成明顯的菌醭，在容器表面上有一些白色斑點形成，從外觀形態(tài)分析應為霉菌類微生物，由此可以初步判斷酒精對霉菌的抑制效果比較好。

采用菌落計數(shù)法定量研究酒精的抑菌效果，見表4。

表4 酒精的抑菌結(jié)果

由表4可知，酒精的抑菌效果差異性很大，不同濃度的酒精的抑制效果不同，選其作為防腐劑使用，必須選擇合適的濃度。另外，實驗表明，有些微生物不在酒精的抑制范圍內(nèi)。

2.3.2 酒精和苯甲酸鈉的協(xié)同抑菌效果

本實驗采用的是氣球收集氣體方法，實驗后觀察氣球膨脹程度，見表5。

表5 不同添加劑及其添加量對產(chǎn)氣的影響結(jié)果

注：“+”表示產(chǎn)氣量的大小，+越多表示產(chǎn)氣量越大；“-”表示產(chǎn)氣量是+的一半。

由表5可知，在2#、3#、8#、9#的單因素實驗中，2#、3#實驗現(xiàn)象表明，酒精對微生物存在著抑制作用，但是由于受抑菌范圍的影響，對產(chǎn)氣微生物的抑制作用不明顯。加入3%酒精的3#的產(chǎn)氣量明顯比1#(對照)多，由此可看出酒精對產(chǎn)氣菌的抑制作用需要在特定量范圍內(nèi)。由8#、9#產(chǎn)氣現(xiàn)象可知苯甲酸鈉對脹罐抑制有一定成效。

在雙因素實驗(4#、5#、6#、7#)中，抑菌效果很明顯。實驗表明，添加0.6‰苯甲酸鈉和2%食用酒精抑制產(chǎn)氣效果最好。同時已有報道指出，酒精可以增加苯甲酸鈉在酸性環(huán)境中的溶解度，進而提高防腐效果，還可減少苯甲酸鈉的添加量。

2.4 滅菌溫度對脹罐的抑制情況

表6 溫度對脹罐的抑制效果

注：“+”表示產(chǎn)氣量的大小，+越多表示產(chǎn)氣量越大；“-”表示產(chǎn)氣量是+的一半。

由表6可知，80 ℃的滅菌效果最理想，而廠家通常采用的成品滅菌方式一般為80 ℃，30 min。因此，從一定程度上可以說明脹罐發(fā)生的原因不是醬油滅菌不徹底，可能是在包裝過程中發(fā)生的二次污染導致的，這就提示廠家應多注重包裝過程中的滅菌工作，如采用輻照殺菌技術(shù)、微波殺菌技術(shù)等。該實驗結(jié)果也說明，引起脹罐發(fā)生的微生物應為中溫菌，高溫對其有很好的殺滅作用。

3 小結(jié)

實驗研究表明，脹罐醬油的酸度和鹽含量都在國標范圍內(nèi)，酸度為1.98 g/dL，鹽含量為16.43 g/dL；高溫滅菌實驗表明該微生物不耐高溫，80 ℃滅菌30 min，可以在一定程度上解決脹罐問題，而引起問題醬油脹罐的原因很可能是在包裝過程中的二次污染；在解決方法上，可以添加0.6‰的苯甲酸鈉、2%的食用酒精(93% vol)，在保證防腐效果的同時減少苯甲酸鈉的使用量。