張玲玲,孫芬芳,張蓉希，王建化

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 海都學(xué)院，山東 萊陽(yáng) 265200)

丁香為桃金娘科植物丁香的干燥花蕾，是重要的食用香辛調(diào)料。丁香性味辛、溫，具有溫中降逆、散寒止痛、補(bǔ)腎助陽(yáng)的功效，也是重要的中藥材[1]。丁香中含有丁香酚、丁香油、黃酮等活性成分，是丁香應(yīng)用于調(diào)味食品及藥用的主要物質(zhì)[2,3]。有研究表明[4-8]，黃酮類化合物是一種天然的抗氧化劑，能有效阻止人體脂質(zhì)的自氧化反應(yīng)，及時(shí)清除體內(nèi)過(guò)量的自由基，延緩人體衰老。因此，黃酮類化合物的提取與抗氧化性的研究受到人們的廣泛關(guān)注。目前，李利華[9]研究正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選丁香總黃酮的提取工藝，李育博等[10]研究響應(yīng)面法優(yōu)化提取野生南果梨果肉中黃酮，劉蕓等[11]研究響應(yīng)面酶法輔助超聲提取芫荽總黃酮的工藝，王俊青等[12]研究響應(yīng)面法優(yōu)化南方紅豆杉葉總黃酮提取工藝，而用響應(yīng)面法優(yōu)化丁香中總黃酮的提取工藝及抗氧化性研究較少。因此，本研究利用超聲波輔助提取丁香中的總黃酮，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)得到最佳提取條件，然后對(duì)其抗氧化性進(jìn)行研究，以期提高對(duì)丁香總黃酮的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與利用價(jià)值，為丁香的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：優(yōu)級(jí)純，購(gòu)自博美生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH, ≥97.0%)：購(gòu)自福州飛凈生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等：均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)有限公司；丁香：市售。

SB25-12DTN型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；TU1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CP114型分析天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料處理

取丁香，干燥，粉碎，過(guò)40目篩，備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取烘干至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，加入濃度為60%的乙醇溶液溶解，定容至50 mL容量瓶中，搖勻，即得濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別移取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于10 mL的容量瓶中，加入0.3 mL 10%的亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min，再加入0.3 mL的10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，然后加4 mL的4%氫氧化鈉溶液，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻。10 min后，在510 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度(c)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程為A=7.8749c+0.02792(R2=0.995)。

1.2.4 丁香總黃酮含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9]的方法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，測(cè)得總黃酮含量，按照下式計(jì)算總黃酮的提取率，每個(gè)樣品做3次平行實(shí)驗(yàn)。

式中：c為測(cè)得的總黃酮濃度，mg/mL；V為提取液的體積，mL；M為稀釋倍數(shù)，m為丁香粉總質(zhì)量，g。

1.2.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.5.1 乙醇濃度對(duì)丁香總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份質(zhì)量為1 g的丁香粉末于具塞錐形瓶中，分別加入25 mL濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，設(shè)置超聲提取溫度為40 ℃，超聲提取時(shí)間為40 min，抽濾得浸提液。按1.2.4步驟測(cè)定總黃酮的含量，計(jì)算總黃酮的提取率，討論不同乙醇濃度對(duì)丁香總黃酮提取率的影響。

1.2.5.2 液料比對(duì)丁香總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份質(zhì)量為1 g的丁香粉末于具塞錐形瓶中，分別按照液料比15∶1、25∶1、35∶1、45∶1、55∶1加入60%的乙醇溶液，設(shè)置超聲提取溫度為40 ℃，超聲提取時(shí)間為40 min。按1.2.4步驟測(cè)定總黃酮的含量，計(jì)算總黃酮的提取率，討論不同液料比對(duì)丁香總黃酮提取率的影響。

1.2.5.3 提取時(shí)間對(duì)丁香總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份質(zhì)量為1 g的丁香粉末于具塞錐形瓶中，分別加入45 mL 60%的乙醇溶液，設(shè)置超聲提取溫度為40 ℃，超聲提取時(shí)間分別為30，40，50，60，70 min。按1.2.4步驟測(cè)定總黃酮的含量，計(jì)算總黃酮的提取率，討論不同提取時(shí)間對(duì)丁香總黃酮提取率的影響。

1.2.5.4 提取溫度對(duì)丁香總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份質(zhì)量為1 g的丁香粉末于具塞錐形瓶中，分別加入45 mL 60%的乙醇溶液，然后將5個(gè)具塞錐形瓶置于超聲波清洗機(jī)中超聲，設(shè)置超聲提取時(shí)間為60 min，超聲提取溫度分別為40，45，50，55，60 ℃。按1.2.4步驟測(cè)定總黃酮的含量，計(jì)算總黃酮的提取率，討論不同提取溫度對(duì)丁香總黃酮提取率的影響。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)以上的單因素試驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以總黃酮的提取率為響應(yīng)值，在乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間3個(gè)單因素的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素及水平表

1.2.7 DPPH自由基清除活性

參考馬莎莎等的測(cè)定方法并略作改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取適量 DPPH 粉末用乙醇溶解并定容，配制成0.071 mmol/L的DPPH 溶液。取1 mL不同濃度的樣品提取液及0.071 mmol/L的DPPH 溶液4 mL，用乙醇定容至10 mL，室溫下暗處反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度。以相應(yīng)濃度的Vc做對(duì)照，計(jì)算樣品的DPPH 自由基清除率。

式中：A0為未加樣的DPPH的吸光度；Ai為待測(cè)樣品與DPPH反應(yīng)后的吸光度;Aj為未加DPPH的樣品溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)丁香總黃酮提取率的影響

圖1 乙醇濃度對(duì)丁香總黃酮提取率的影響

由圖1可知，乙醇濃度為30%～60%，總黃酮的提取率穩(wěn)步上升，并在乙醇濃度為60%時(shí)達(dá)到最高，分析原因可能是總黃酮在乙醇中的溶解度隨乙醇濃度上升而上升。乙醇濃度為60%～80%，總黃酮的提取率慢慢下降，分析原因可能是乙醇濃度過(guò)高使丁香中的部分其他物質(zhì)析出增加，影響黃酮類化合物的溶出。因此，從總黃酮的提取率考慮，選取乙醇的濃度為60%。

2.1.2 液料比對(duì)丁香總黃酮提取率的影響

圖2 液料比對(duì)丁香總黃酮提取率的影響

由圖2可知，液料比(mL/g)在15∶1～45∶1，總黃酮的提取率一直保持快速上升狀態(tài)，分析原因可能是增大溶劑量，加大接觸面積，促進(jìn)丁香中總黃酮的有效浸提。在液料比超過(guò)45∶1 (mL/g)以后，提取率逐漸下降，分析原因可能是液料比為45∶1 (mL/g)，丁香中的總黃酮已基本溶出，繼續(xù)增大液料比，可能會(huì)有部分物質(zhì)溶出并阻礙了總黃酮的析出。因此，從總黃酮的提取率考慮，選取液料比為45∶1 (mL/g)。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)丁香總黃酮提取率的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)丁香總黃酮提取率的影響

由圖3可知，提取時(shí)間在30～60 min，提取率一直保持上升，60 min以后提取率慢慢下降，分析原因可能是在提取時(shí)間60 min以內(nèi)，丁香與乙醇充分接觸，接觸時(shí)間越長(zhǎng)，總黃酮溶出量越多，到60 min時(shí)總黃酮已基本溶出。提取時(shí)間超過(guò)60 min，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，部分黃酮化合物發(fā)生了分解或者降解[13]。因此，從總黃酮的提取率和穩(wěn)定性考慮，選取最佳提取時(shí)間為60 min。

2.1.4 提取溫度對(duì)丁香總黃酮提取率的影響

圖4 提取溫度對(duì)丁香總黃酮提取率的影響

由圖4可知，提取溫度對(duì)丁香中總黃酮提取率的影響比其他因素略小。提取溫度由40 ℃上升到50 ℃，提取率緩慢上升，提取溫度由50 ℃上升到60 ℃，提取率緩慢下降。分析原因可能是提取溫度在50 ℃以內(nèi)，溫度升高，加快了丁香中分子的運(yùn)動(dòng)速率，總黃酮的溶出量增加。提取溫度超過(guò)50 ℃，隨著溫度的上升，使浸提液中部分成分與總黃酮發(fā)生了反應(yīng)，減少了有效成分[14]。因此，從總黃酮的提取率和穩(wěn)定性考慮，選取最佳提取溫度為50 ℃。

2.2 響應(yīng)面分析及試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理

利用Design-Expert V8.0.6軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸方程擬合，得到丁香總黃酮提取率(Y)對(duì)自變量液料比(A)、提取時(shí)間(B)和乙醇濃度(C)的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=+12.12+0.31A+0.25B+0.33C-0.34AB-0.067AC+0.31BC-1.34A2-1.52B2-1.86C2。

表3 回歸方程方差分析表

注：“*”表示P<0.05，顯著；“**”表示P<0.01，極顯著。

由表3可知，模型的P<0.0001，顯示模型極顯著，此模型中失擬性不顯著(P>0.05)，表示此模型設(shè)計(jì)的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值相近，有良好的線性關(guān)系，根據(jù)此模型可以得到丁香中總黃酮提取的最優(yōu)工藝。由表3中F值可知，各因素對(duì)丁香總黃酮提取率的影響因素大小順序是：C(乙醇濃度)>A(液料比)>B(提取時(shí)間)。其中，一次項(xiàng)A，C、二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響極顯著(P<0.01)，一次項(xiàng)B、交互項(xiàng)AB、BC對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響顯著。

通過(guò)Design-Expert V8.0.6軟件，輸入試驗(yàn)結(jié)果可得到圖5的響應(yīng)曲面圖。

圖5 兩因素間的交互作用對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖

圖5非常直觀地表現(xiàn)了液料比與乙醇濃度、液料比與提取時(shí)間、乙醇濃度與提取時(shí)間兩兩因素間的交互作用。響應(yīng)曲面圖中圖形陡峭程度越小代表相互作用越小，反之則越大[15]。由圖5可知，兩兩因素間均有一定的交互作用，其中AB和BC的交互作用更顯著，這與表3中的顯著性結(jié)果一致。

2.3 總黃酮最佳提取工藝條件的驗(yàn)證

通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到超聲提取丁香總黃酮的最佳工藝條件為：液料比46.04∶1(mL/g)，提取時(shí)間60.80 min，乙醇濃度60.92%，在該條件下總黃酮的理論提取率是12.16%，為方便驗(yàn)證該方法的可行性，采用上述條件的調(diào)整值：液料比46∶1(mL/g)，提取時(shí)間61 min，乙醇濃度61%，對(duì)丁香中的總黃酮進(jìn)行提取。結(jié)果表明：超聲輔助提取丁香中的總黃酮平均提取收率(n=3)為12.11%，RSD=0.38%。結(jié)果與軟件分析得到的理論值相近，證明試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦x擇可靠，此提取工藝可行。

2.4 DPPH自由基清除活性

按以上提取工藝條件提取丁香中的總黃酮，配制不同濃度的溶液，按1.2.7試驗(yàn)方法研究總黃酮的抗氧化性。丁香總黃酮和Vc的DPPH自由基清除率結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 丁香總黃酮DPPH自由基清除效果

由圖6可知，丁香總黃酮和Vc對(duì)DPPH自由基都具有明顯的清除效果，且隨著濃度升高而逐漸增加。在試樣濃度小于0.3mg/mL時(shí)，Vc的清除率明顯大于丁香總黃酮的清除率。當(dāng)試樣濃度大于0.3mg/mL時(shí)，丁香總黃酮與Vc的清除率越來(lái)越接近，丁香總黃酮的清除率達(dá)到90%以上，這與黃晶玲等的研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本文采用超聲波輔助提取法從丁香中提取總黃酮，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色，測(cè)定總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線為： A=7.8749c+0.02792(R2=0.995)。

通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化丁香總黃酮的提取工藝，以總黃酮的提取率作為考核標(biāo)準(zhǔn)，得到最佳條件為乙醇濃度61%，液料比46∶1(mL/g)，超聲提取時(shí)間61 min，超聲提取溫度50 ℃。該方法簡(jiǎn)單快速，提取率高，為丁香中總黃酮的應(yīng)用前景提供了保障。

DPPH自由基清除試驗(yàn)表明，丁香總黃酮對(duì)DPPH自由基具有明顯的清除效果，且隨著濃度升高而逐漸增加。丁香總黃酮的濃度大于0.3 mg/L時(shí)，清除率達(dá)到90%以上。