王余磊，舒相華，張 雪，高云梅，楊 崑，張雅靖，呂 濤，宋春蓮

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201）

近年來，抗生素在醫(yī)療和畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的大量使用所導(dǎo)致的環(huán)境污染問題日趨嚴(yán)重。每年我國生產(chǎn)的21萬t的抗生素中9.7萬t的抗生素都流向了畜禽養(yǎng)殖場，大約占到了年產(chǎn)量的46.1%，而這巨大的使用量中90%的抗生素都是作為了動(dòng)物飼料的添加劑而被消耗掉，致使動(dòng)物的抗生素濫用現(xiàn)象十分嚴(yán)重，出現(xiàn)了大量的耐藥菌株，為畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展埋下了隱患的同時(shí)也為人類的生命健康帶來了威脅[1]。

四環(huán)素類抗生素（tetracyclineantibiotics，TCs）是由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，包括土霉素（Oxytetracycline，OTC）、四環(huán)素（Tetracycline，TC）和金霉素（Chlortetracycline，CTC）等。四環(huán)素類抗生素由于價(jià)格低廉，大量使用于許多疾病的預(yù)防與促進(jìn)動(dòng)物的生長，提高畜禽生產(chǎn)效率。但是禽畜組織中四環(huán)素類抗生素的殘留會(huì)影響食用者的健康，還會(huì)造成環(huán)境中四環(huán)素類抗生素的殘留，從而間接或直接進(jìn)入人體，增加人體的耐藥性，給人類公共健康帶來威脅[2]。為了保護(hù)環(huán)境和人類健康，國際食品法典委員會(huì)（CAC）制定了動(dòng)物組織及產(chǎn)品中獸藥殘留的最高殘留限量（MRLVDs）的規(guī)定，用以保障公眾健康和各國正常進(jìn)出口貿(mào)易。我國也制定了國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定四環(huán)素類抗生素的添加限量，所有食用性動(dòng)物肌肉組織中土霉素、四環(huán)素和金霉素的單個(gè)或復(fù)合物含量不得超過0.1 mg·kg-1。

獸藥殘留檢測(cè)方法目前主要有金標(biāo)檢測(cè)法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜-紫外檢測(cè)法[3]、氣相色譜法和質(zhì)譜法[4]等。四環(huán)素類抗生素最常用的化學(xué)檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[5]和高效液相質(zhì)譜聯(lián)用法。本研究在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上，建立了一種高效液相色譜法快速檢測(cè)雞肉組織中土霉素類藥物殘留的方法，為臨床快速準(zhǔn)確檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

檢測(cè)方法驗(yàn)證雞4羽；2個(gè)合作社飼養(yǎng)的烏骨雞各6羽。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑有乙腈（色譜級(jí)）、甲醇（色譜級(jí)）美國天地有限公司；甲醇（分析純）重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；正己烷（分析純）天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；土霉素對(duì)照品、四環(huán)素對(duì)照品、金霉素對(duì)照品北京索萊寶科技有限公司。

高效液相色譜儀島津LC-2030(配紫外檢測(cè)器)；色譜柱C18 4.6×150 mm，5μm；氮吹儀HSC-24A天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱為C18（4.6×150 mm，5μm）。以0.01 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液-乙腈=81∶19（體積比）為流動(dòng)相。檢測(cè)波長為350 nm，柱溫為40℃，流速為1.0 ml·min-1，進(jìn)樣量為10 ul。

1.3.2 溶液的制備 分別稱取OTC、TC、CTC對(duì)照品各10 mg，置于三個(gè)10 ml的棕色容量瓶中，然后用甲醇溶液溶解并定容到10 ml，制備得到的OTC、TC、CTC標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1 mg·ml-1。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取土霉素、四環(huán)素、鹽酸金霉素對(duì)照品各約100 mg，置于10 ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度線得到10 mg·ml-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液槍精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 ml，分別置100、50、25、10、5 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度線，搖勻。得到濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.1和0.2 mg·ml-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。所有的標(biāo)準(zhǔn)溶液都放置與4～6℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 樣品前處理 將組織剪碎稱取5 g，置于50 ml離心管中，加入25 ml甲醇，超聲5 min。8000 r·min-1，勻漿提取1 min。4 000 r·min-1離心15 min,將上清液移置150 ml的分液漏斗中。加入25 ml甲醇飽和的正己烷溶液，手動(dòng)振搖2 min，靜置分層。取下層溶液20 ml，置于25 ml的旋蒸瓶中，41℃水浴減壓蒸干，加入1 ml5%的高氯酸，渦旋1 min，移至1.5 ml離心管中，10 000r·min-1離心15 min，將上清液吸出過0.45μm濾膜，將濾液作為試樣溶液待測(cè)。

出峰順序與時(shí)間的確定將配制好的1 mg·ml-1土霉素、四環(huán)素和金霉素三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)0.45μm濾膜過濾后，放入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣6次，取平均值。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定稱取9份已剪碎的樣品各5 ±0.01g，放入50 ml離心管中。分別加入50 ul不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0.02、0.04、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2 mg·ml-1，配制成相對(duì)于樣品濃度為0.2、0.4、1、2、3、4、5、10、20μg·g-1，按照樣品前處理方法進(jìn)行操作。繪制土霉素、四環(huán)素和金霉素三種四環(huán)素類抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取3份已經(jīng)剪碎的空白樣品各5±0.01 g，按照 0.3 mg·ml-1、0.4mg·ml-1和 0.5mg·ml-1添加量添加三種標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，計(jì)算樣品的加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 一種高效液相色譜檢測(cè)雞肉中土霉素類抗生素方法

2.1.1 出峰順序與時(shí)間

如圖一所示：根據(jù)6次重復(fù)進(jìn)樣得出平均出峰時(shí)間，土霉3.65min，四環(huán)素4.41 min，金霉素9.62 min。土霉素、四環(huán)素、金霉素依次出峰且分離度良好。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品出峰順序和時(shí)間

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

在1.3.1色譜條件下進(jìn)樣，已標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表1，表明三種抗生素在各自的范圍內(nèi)線性關(guān)系較好。

表1 土霉素、四環(huán)素和金霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.3 方法檢出限

按照樣品前處理的方法進(jìn)行操作，經(jīng)過HPLC分析，得到土霉素、四環(huán)素的方法檢出限為20μg·kg-1，金霉素的方法檢出限為100μg·kg-1。

2.1.4 變異系數(shù)與添加回收率試驗(yàn)

由表2顯示，三個(gè)空白樣品在三個(gè)不同濃度下的回收率范圍為84.33%～107%，回收率良好。

2.1.5 實(shí)驗(yàn)組土霉素測(cè)定結(jié)果

將實(shí)驗(yàn)組陽性對(duì)照和空白對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品平行測(cè)定三次，結(jié)果見表3，相關(guān)色譜圖見圖2。

圖2 A為土霉素陽性對(duì)照，B為空白對(duì)照

由表3可知，土霉素陽性對(duì)照組的胸肌和腿肌樣品檢測(cè)結(jié)果都超出獸藥最高殘留限量3～8倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過我國MRLVDs的規(guī)定（0.1mg·kg-1），空白對(duì)照組未檢出殘留。證明本方法成立。

表2 添加回收率與變異系數(shù)

表3 土霉素陽性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果

2.2 雞場樣品測(cè)定與分析

采用1.3.3方法處理待測(cè)樣品，用1.3.1色譜條件進(jìn)行檢測(cè)分析，色譜圖見圖3。檢測(cè)結(jié)果表明所有樣品都未檢測(cè)出土霉素、四環(huán)素和金霉素獸藥殘留。

圖3 C為待測(cè)樣品

3 討論

3.1 提取方法的選擇

本研究樣品處理方法和GB/T20764—2006[6]方法有很大改進(jìn)，本方法使用的是甲醇-正己烷-高氯酸組合提取法，此方法操作重現(xiàn)性好，便于批量處理。GB/T20764—2006所使用的萃取柱提取方法，這種提取方法雖然操作簡單，重現(xiàn)性差，并且成本高，不利于批量處理。而本方法尚有不足之處，樣品前處理步驟復(fù)雜，相對(duì)于固相萃取柱提取法耗時(shí)較長，因此，以后仍需要改進(jìn)。

3.2 流動(dòng)相選擇

以 78：22、81：19 和 85：15(V：V)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn) ,結(jié)果表明流動(dòng)相為 81：19(V：V)的比例分離效果較好; 隨后又考察了0.8 ml/min 和 1.0 ml/min 的流速, 最終確定本實(shí)驗(yàn)流速為 1ml/min。在此色譜條件下, 試樣中土霉素、四環(huán)素、金霉素均得到較好的分離,與高廣慧[7]結(jié)果一致。

3.3 波長的選擇

土霉素、四環(huán)素、金霉素在265 nm和350 nm兩個(gè)波長處都有較好的吸收峰[8]，而在265 nm波長下，吸收強(qiáng)度好，與鮑會(huì)梅所得結(jié)果相符合，但色譜圖的基線不如前者平穩(wěn)，綜合考量，選擇350 nm為檢測(cè)波長。

4 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜測(cè)定雞肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素、藥物殘留的方法，采用甲醇-正己烷-高氯酸組合提取法，建立了雞肉樣品提取、凈化、濃縮的前處理方法，并優(yōu)化了高效液相色譜條件，可同時(shí)測(cè)定雞肉中上述3種四環(huán)素類藥物殘留，該法簡便、準(zhǔn)確，可用于該類獸藥的殘留監(jiān)控。

從待測(cè)樣品的檢測(cè)結(jié)果來看，此農(nóng)戶家養(yǎng)殖的雞土霉素、四環(huán)素和金霉素的陽性檢出率為零。