劉 楊，劉翊忠，李瓊毅

（1.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

EMCV是微RNA病毒科心病毒屬的病毒。1945年首次從一只黑猩猩的體內(nèi)分離得到，隨后在多國被相繼報道[1]。懷孕母豬感染EMCV之后可導致木乃伊胎和繁殖機能障礙，臨近分娩時可發(fā)生流產(chǎn)、木乃伊胎增加和小豬離乳前死亡。仔豬感染致死，哺乳小豬致死率甚至可達到100%[2]。較大豬和成豬通常不顯性感染，成豬偶爾發(fā)生死亡。人感染時常呈現(xiàn)散發(fā)，患者可表現(xiàn)間歇性頭痛、頸項強直，嘔吐和發(fā)熱[3]。

該病毒可通過多種途徑感染動物和人類，但具體的感染機制目前尚未完全清楚，有報道稱包括EMCV在內(nèi)的心臟病毒可能經(jīng)由內(nèi)吞途徑感染宿主細胞[4]。發(fā)動蛋白可以參與多種內(nèi)吞途徑，為大多數(shù)內(nèi)吞途徑提供動力[5]，包括經(jīng)典的網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞途徑，在非網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞途徑中，目前發(fā)現(xiàn)只有小窩蛋白依賴的內(nèi)吞途徑需要發(fā)動蛋白的參與。近年來，越來越多的研究提示發(fā)動蛋白依賴型內(nèi)吞途徑可參與多種病毒感染宿主細胞，如猿猴空泡病毒40、冠狀病毒和口蹄疫病毒等[6]。

1 材料與方法

1.1 細胞及毒株

人宮頸癌細胞（Hela）、倉鼠腎細胞（BHK-21）、腦心肌炎病毒（EMCV）由甘肅省蘭州市西北民族大學生物醫(yī)學研究中心提供。

1.2 主要儀器與試劑

凝膠成像系統(tǒng)（GE）；酶標儀（Thermo Fisher）；Proliferation細胞活力檢測試劑盒購自Gromega公司；鼠源VP1抗體由南京農(nóng)業(yè)大學動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室提供；抑制劑Dynasore 購自Abcam公司，MitMab購自Tocris公司。

1.3 特異性抑制劑濃度篩選

參考已有文獻將發(fā)動蛋白特異性抑制劑Dynasore和MitMab配置成含F(xiàn)BS的不同濃度工作液，然后作用于Hela細胞24 h。24 h后，按照Proliferation細胞活力檢測試劑盒說明書進行細胞活力檢測，重復三次，篩選兩種抑制劑適宜工作濃度。

1.4 特異性抑制劑試驗

1.4.1 特異性抑制劑作用下EMCV攻毒 配置含F(xiàn)BS的適宜濃度的Dynasore和MitMab工作液，作用于Hela細胞1h，1h后進行EMCV攻毒，接毒量為0.1MOI，病毒體積=細胞數(shù)× 0.1MOI/0.7 ×TCID50[7]。接毒1 h后棄去毒液，換為Dynasore和MitMab的細胞維持液。于感染后24 h收集細胞和上清。

1.4.2 Western bolt檢測Hela細胞中VP1含量 收集Hela細胞，RIPA裂解，產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜。脫脂奶粉封閉1 h，加入鼠抗VP1一抗（1：5000稀釋），室溫孵育2 h，PBST洗膜5次，每次5 min，再加入HRP標記的山羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，PBST洗膜5次，ECL顯色。

1.4.3 病毒滴度檢測 將收集到的上清10倍梯度稀釋（10-1～10-8）接種于96孔板的BHK-21細胞中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育6天，統(tǒng)計病毒感染陽性細胞孔的數(shù)量，Karber法計算病毒滴度。

1.4.4 病毒拷貝數(shù)檢測 實時熒光定量測定上清的病毒拷貝數(shù)，TaqMan 實時熒光定量PCR參考本實驗室已建立的方法。

2 結(jié)果

2.1 特異性抑制劑濃度篩選

將Hela細胞在含有不同濃度特異性抑制劑Dynasore和MitMab培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后測定細胞活力。確定Dynasore的適宜工作濃度：25 μM和50μM（圖1A），MitMab的適宜工作濃度2.5 μm 和5.0 μM（圖1B）。

圖 1 細胞活力檢測

2.2 特異性抑制劑作用下EMCV攻毒試驗

2.2.1 Hela細胞中VP1含量檢測結(jié)果 將Dynasore和MitMab處理過的Hela細胞進行EMCV攻毒試驗，收集細胞檢測VP1含量，對檢測結(jié)果進行灰度分析。結(jié)果顯示經(jīng)25 μM和50 μM的Dynasore作用后VP1含量顯著下降（圖2AB），經(jīng)過2.5 μM MitMab作用后VP1下降不明顯（圖2CD），經(jīng)過5.0 μM MitMab作用后VP1含量下降顯著（圖2CD）。

圖 2 VP1蛋白含量檢測

2.2.2 病毒滴度檢測結(jié)果 將Dynasore和MitMab處理過的Hela細胞進行EMCV攻毒試驗，收集上清進行病毒滴度檢測。結(jié)果顯示經(jīng)過25 μM和50 μM的Dynasore作用后病毒滴度均下降明顯（圖3A），經(jīng)2.5 μM和5.0 μM MitMab處理后病毒滴度同樣顯著下降（圖3B）。

圖3 病毒滴度檢測結(jié)果

2.2.3 病毒拷貝數(shù)檢測檢測結(jié)果 上清病毒拷貝數(shù)檢測結(jié)果顯示經(jīng)過25 μM和50 μM Dynasore作用后病毒拷貝數(shù)下降很明顯（圖4A）。經(jīng)2.5 μM和5.0 μM MitMab處理后病毒拷貝數(shù)同樣下降明顯（圖4B）。

圖 4 病毒拷貝數(shù)檢測結(jié)果

3 分析與討論

選取對細胞活力無影響的抑制劑濃度作用于Hela細胞后進行EMCV攻毒，接毒24 h后收集細胞檢測VP1含量，收集上清液檢測病毒拷貝數(shù)和病毒滴度，分別從蛋白和基因等水平檢測病毒感染狀況。蛋白、病毒拷貝數(shù)和病毒滴度檢測結(jié)果顯示經(jīng)抑制劑Dynasore和MitMab作用后EMCV感染Hela細胞受到抑制，雖然三種檢測結(jié)果中實驗組和對照組之間的差異顯著性不完全相同，但大體的趨勢一致；都可提示發(fā)動蛋白依賴型內(nèi)吞途徑抑制劑Dynasore和MitMab可以抑制病毒感染Hela細胞，證明了EMCV感染Hela細胞依賴于發(fā)動蛋白發(fā)揮作用。

本試驗初步探索了發(fā)動蛋白在EMCV感染Hela細胞中的作用，證明了發(fā)動蛋白參與EMCV感染Hela細胞。這一發(fā)現(xiàn)大大降低了研究EMCV通過內(nèi)吞途徑感染宿主細胞的范圍，可以有針對性的研究網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導的內(nèi)吞途徑。另外，這一發(fā)現(xiàn)為使用Dynasore和MitMab預防和治療EMCV以及其他通過發(fā)動蛋白依賴型內(nèi)吞途徑感染人與動物的病毒提供了一個可行的思路。隨著發(fā)動蛋白參與病毒感染這一機制研究的不斷深入，有可能從發(fā)動蛋白著手，為防治人與動物的腦心肌炎提供更優(yōu)的方法。