郭元順，王樹峰，李生瑄，王靜汝，董 鑫，李 潔

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

武昌魚、鯽魚、草魚和鰱魚4種鯉科魚類均為淡水魚，分布廣泛，且抗病力強(qiáng)、易飼養(yǎng)，肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，是我國優(yōu)良的主要淡水養(yǎng)殖魚類。然而其遺傳資源的研究和優(yōu)良品種的培育卻遠(yuǎn)落后于家畜家禽。環(huán)境污染導(dǎo)致的水生生態(tài)系統(tǒng)的嚴(yán)重破壞，許多水生生物已經(jīng)或正在滅絕[1]。

魚類的線粒體DNA(簡稱mtDNA)與核DNA相比，具有分子小、編碼效率高、拷貝數(shù)多、結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速度快、不同區(qū)域進(jìn)化速度存在差異以及母性遺傳等特點(diǎn)[2]。目前，隨著DNA測序技術(shù)和分子信息學(xué)的快速發(fā)展，線粒體DNA作為遺傳標(biāo)記被越來越廣泛地應(yīng)用于群體遺傳和系統(tǒng)進(jìn)化的研究，生物的遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，也是種質(zhì)資源保護(hù)和利用的前提和基礎(chǔ)[3]。本研究對鯉科魚類線粒體atp6基因（atp6基因是重要的線粒體功能基因[4]）序列進(jìn)行測序并分析鯉科4個(gè)屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,旨為今后的漁業(yè)資源研究提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)所使用的四種鯉科類魚武昌魚（WCY）、彩鯽(CJ)、草魚(Cao)、鰱魚(BL)各4條均采自于甘肅省臨夏回族自治州永靖縣劉家峽鎮(zhèn)。采集新鮮的肌肉組織在-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.1 選擇的其他實(shí)驗(yàn)魚類 魚類信息見表1。

表 1 17種魚類信息

1.2 主要儀器與試劑

高速低溫離心機(jī)、微量移液器（0.1～2.5μl、0.5 ～ 10μl、10 ～ 100μl、20 ～ 200μl、100～1000μl）、梯度PCR擴(kuò)增儀、微型旋渦混合儀（上海）、水平電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)（法國VILBER凝膠成像系統(tǒng)）；DNA提取及PCR擴(kuò)增相關(guān)試劑。

1.3 DNA的提取與檢測

通過常規(guī)的酚-氯仿抽提法提取基因組總DNA（參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》提取基因組DNA）[5]，使用超微量分光光度計(jì)檢測后于-20℃下保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank已經(jīng)公布的草魚線粒體全基因組序列（Genbank Number： HQ891005），使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。上游引物(atp6u)：5′ -AGC CCT GAG ACT GAC CAT G-3′，下游引物 (atp6d )： 5′ - GGC TAA TTG TTT CGA TAA T-3′,引物由天津金維智生物工程有限公司合成。

1.5 atp6部分序列PCR擴(kuò)增及測定

采用50μL的PCR擴(kuò)增體系：1μl基因組DNA，25μl TaqDNA聚合酶，上下游引物各0.5μl，加入滅菌水補(bǔ)足至50μL。

最適PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min ；94℃變性20 s，51.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸10 min；4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)檢測后由天津金維智生物工程有限公司測序。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用Chromas version對測序結(jié)果進(jìn)行編輯，人工校對；使用MEGA5.0軟件進(jìn)行比對并建立數(shù)據(jù)庫，通過數(shù)據(jù)庫建立系統(tǒng)發(fā)育樹，同時(shí)確定A、T、G、C的含量與比例。最后用DANsp軟件對核苷酸多樣度、平均核苷酸差異度、保守度、單一信息位點(diǎn)、簡單信息位點(diǎn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果分析

通過對濃度與OD值的測定（表2），說明濃度與OD值在正常范圍內(nèi)，可用所提取的DNA進(jìn)行后續(xù)的PCR擴(kuò)增（1.8≤OD≤2.1）。

表2 4種鯉科魚類的DNA提取結(jié)果分析

表3 4種鯉科魚類線粒體atp6基因與17種魚類的差異性分析

2.2 引物退火溫度篩選及PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

2.2.1 退火溫度篩選 從圖 1的檢測圖片種可以看出，引物的六個(gè)溫度梯度下檢測的電泳條帶其中五個(gè)較亮，第二個(gè)溫度51.5 ℃的條帶完整并且光亮，所以選擇了在51.5℃下進(jìn)行4個(gè)魚種mtDNA的atp6基因的部分片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

圖1 PCR擴(kuò)增引物的退火溫度篩選

2.2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 已知該引物片段大小為436 bp，利用2 000 bp marker做模板，預(yù)測結(jié)果與實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果相一致。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，在約500 bp處呈現(xiàn)1條特異性條帶(圖2)，與預(yù)期的片段大小吻合，且無非特異性條帶，說明本研究設(shè)計(jì)的PCR引物及反應(yīng)條件具有較好的特異性，符合目的基因。同時(shí)可以看到一條明亮的條帶，說明PCR擴(kuò)增成功，將所得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行編號，4℃保存。

圖 2 4種鯉科魚類線粒體atp6基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 測序結(jié)果分析

通過Chromas version軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析（圖3），結(jié)果顯示對于鯉形目的4種魚所測定的序列波峰信號單一，無其他雜亂信號的干擾，測序結(jié)果可用于進(jìn)行之后的序列分析。

圖 3 4種鯉科魚類線粒體atp6基因測序結(jié)果

2.4 12種鯉科魚類atp6基因差異性對比結(jié)果分析

數(shù)據(jù)結(jié)果顯示（表3），利用MEGA5.0程序?qū)Ρ狙芯恐猩婕暗降?2種鯉科魚類的atp6基因序列進(jìn)行單核甘酸多態(tài)性（SNP）分析，結(jié)果顯示12種鯉科魚類的atp6基因436bp的核苷酸序列中T、C、A和G平均含量分別為29%、28%、30%和13%。Dnasp程序分析顯示：12種鯉科魚類堿基變異數(shù)（S）分布及核苷酸多樣度（Pi：序列間每個(gè)位點(diǎn)的平均核苷酸差異數(shù)）分析結(jié)果見圖 4和圖 5。在第1到第53個(gè)堿基之間和第380到第436個(gè)堿基之間均沒有發(fā)現(xiàn)堿基變異，說明這是相對保守的兩個(gè)區(qū)域，變異區(qū)在第53個(gè)堿基與380個(gè)堿基之間，第53與104個(gè)堿基之間發(fā)生變異的頻率最高，均在40次以上。核苷酸多樣度Pi變化趨勢與堿基變異位置分布趨勢整體上相似，在第1個(gè)到第53個(gè)堿基和第380到第436個(gè)堿基之間沒有多樣性可言，其余部分均存在不同程度的核苷酸變異，核苷酸多樣度的最高值出現(xiàn)在第104個(gè)堿基左右。

圖4 12個(gè)鯉科魚種atp6基因序列堿基變異位置及分布頻率

圖5 12個(gè)魚種atp6基因序列核苷酸多樣度（Pi）

2.5 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析

利用MEGA5.0軟件，采用NJ (Neighborjoining)算法構(gòu)建試驗(yàn)所用4種鯉形目魚與GenBank中下載得到的17種其他魚類（表 1）的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖 6），結(jié)果表明該進(jìn)化樹將21種魚大致分為了四個(gè)分支，試驗(yàn)中的12種鯉形目魚，其中第一個(gè)分支中包含了11種鯉形目的魚，親緣關(guān)系為45；而鯉形目的胭脂魚和燈籠魚目的雜斑狗母魚被分為第二分支，親緣關(guān)系為52；在第三個(gè)分支中鮭形目的兩種魚和鱸形目的三種魚親緣關(guān)系為47;第四個(gè)分支中達(dá)氏深水尾魟與莫桑比克羅非魚（AY597335）、羅非魚（NC007231），親緣關(guān)系較近為69。鯉形目的11種魚與其余10種魚的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖6 4種鯉形目魚類與其他17種魚類的系統(tǒng)進(jìn)化樹（NJ法）

3 討論

3.1 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，而核苷酸多樣度是衡量群體遺傳變異程度的重要指標(biāo)[6]。核苷酸多樣度越大，群體遺傳變異程度越高[7]。分析線粒體基因組4種堿基百分含量可以發(fā)現(xiàn)魚類粒體基因組的堿基組成與其他脊椎動物相同均具有A+T%堿基偏向性[8]。從遺傳和進(jìn)化角度看,一個(gè)物種的遺傳多樣性與其適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化潛力等密切相關(guān)[9]。

分析線粒體基因組4種堿基百分含量可以發(fā)現(xiàn)，4種鯉科魚類武昌魚（又稱團(tuán)頭魴）、彩鯽、草魚、鰱魚線粒體基因組的堿基組成與其他脊椎動物相同均具有A+T堿基偏向性。4種魚的線粒體atp6基因中A+T%含量為59%，G+C%含量為41%。

3.2 系統(tǒng)發(fā)育特點(diǎn)

Liu等利用mtDNA控制區(qū)序列變異探討了鯉科魚的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。本文通過構(gòu)建4種鯉科魚類武昌魚（又稱團(tuán)頭魴）、彩鯽、草魚、鰱魚與GenBank中其他17種魚類mtDNA基因組進(jìn)化樹并分析，發(fā)現(xiàn)武昌魚（又稱團(tuán)頭魴）、彩鯽、草魚、鰱魚與同屬魚類的遺傳距離高達(dá)99以上。但下載中的鯉形目胭脂魚（AY526869）與燈籠魚目的雜斑狗母魚（AY524977）的親緣關(guān)系相近（52）。通過對17種魚類比較發(fā)現(xiàn)，其中美洲紅點(diǎn)鮭與北極紅點(diǎn)鮭之間的遺傳距離近且與馬鮫屬、半線馬鮫、澳洲馬鮫之間的遺傳距離為47。就進(jìn)化樹親緣關(guān)系遠(yuǎn)近來看，4種鯉科魚類武昌魚（又稱團(tuán)頭魴）、彩鯽、草魚、鰱魚的線粒體atp6基因在堿基組成、變異位點(diǎn)和核苷酸多樣性等方面非常相似，表明它們有較近的親緣關(guān)系。通過對四種鯉科魚類線粒體atp6基因差異分析，可進(jìn)行物種的識別、物種鑒定和描述進(jìn)化趨勢、解釋物種間差異、分析進(jìn)化關(guān)系等方面的研究分析。