高灑灑， 崔曉萍

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院2016級(jí)中醫(yī)婦科碩士研究生，陜西咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，陜西咸陽 712046）

在臨床上，我們經(jīng)常可以看到許多月經(jīng)量少、月經(jīng)后期，甚至閉經(jīng)的患者均處于過度消瘦的狀態(tài)，詢問病史之后，發(fā)現(xiàn)其中絕大多數(shù)女性經(jīng)常性進(jìn)行節(jié)食、運(yùn)動(dòng)，甚或服用藥物以追求減肥。給予相關(guān)檢查，亦發(fā)現(xiàn)這些女性往往都處于卵巢功能下降甚至卵巢早衰的狀態(tài)，在本該生育的年齡卻沒有該有的生殖功能，從而引起月經(jīng)異常，不能生育?，F(xiàn)代研究[1]顯示，70%的人群處于亞健康狀態(tài)，其中偏瘦人群占到80%。女性體質(zhì)量的變化對(duì)生殖功能的影響呈現(xiàn)兩極化的分布狀態(tài)，即體質(zhì)量極高或極低都會(huì)使生殖能力下降[2]。臨床上大多數(shù)消瘦女性月經(jīng)稀發(fā)、月經(jīng)后期、閉經(jīng)，甚則不孕[3]，一般有2方面原因：一方面，因雌激素受體表達(dá)于正常成人的脂肪細(xì)胞[4]，雌激素與脂肪細(xì)胞中的特異性受體結(jié)合發(fā)生作用[5]。脂肪分為類脂和中性脂肪，類脂分為磷脂和膽固醇，膽固醇是合成甾體激素的前體。過度消耗脂肪使雌激素合成減少，同時(shí)導(dǎo)致雌激素與雌激素受體（ER）結(jié)合減少，可以導(dǎo)致女性月經(jīng)量少、月經(jīng)后期、閉經(jīng)甚至不孕等癥[6]。另一方面，西醫(yī)學(xué)認(rèn)為女性發(fā)育成熟階段，身高與體質(zhì)量有一定的比例，若在短期內(nèi)體質(zhì)量下降超過正常范圍，則會(huì)使促性腺激素釋放激素（GnRH）的合成與分泌減少，抑制促性腺激素，使性腺功能退減，導(dǎo)致閉經(jīng)等[7]，最終使下丘腦—垂體—卵巢性腺軸（HPOA）失調(diào)，導(dǎo)致女性生殖內(nèi)分泌功能水平下降[7，8]。

目前關(guān)于過度瘦身對(duì)女性生殖危害的機(jī)理尚缺乏具體研究。本研究擬通過運(yùn)用“半量飲食+過度運(yùn)動(dòng)+左旋肉堿”的綜合方法造成大鼠過度瘦身模型，將不同時(shí)段大鼠下丘腦人吻素1（Kiss1）、G蛋白偶聯(lián)受體54（GPR54）mRNA表達(dá)及血清性激素水平等為切入點(diǎn)，論證過度瘦身對(duì)生殖功能的影響，揭示女性盲目追求“骨感美”的錯(cuò)誤傾向。同時(shí)，對(duì)造成過度瘦身狀態(tài)的大鼠用左歸丸進(jìn)行干預(yù)，觀察以上各項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)的差異，以闡明中醫(yī)“精血同源”“腎主生殖”“腎生髓充腦”的科學(xué)內(nèi)涵，為中醫(yī)“補(bǔ)腎促生殖”提供科學(xué)依據(jù)，為恢復(fù)和提升生殖功能提供有效的中醫(yī)藥療法方案，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用SPF級(jí)健康雌性12周齡SD大鼠150只，體質(zhì)量（250±20）g，購于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（陜）2018-001。單籠飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，室溫20～25℃，相對(duì)濕度40%～55%，光照12 h，通風(fēng)良好，自來水供飲。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周期間，每日上午用電子天平給予定量標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂食，測(cè)量每只大鼠的正常飲食量（精確到0.1 g），隔日更換墊料并清洗鼠籠。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物左歸丸，由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：Z11020735；左旋肉堿，由上海麥克林公司生產(chǎn)，批號(hào)：L804703。每種藥物用量根據(jù)人和大鼠體表面積換算的等效劑量比率表計(jì)算。左歸丸給藥劑量為1.62 g·kg-1·d-1，用去離子水配成混懸液。左旋肉堿給藥劑量為600 mg·kg-1·d-1，采用等容積不等濃度藥液給藥，灌胃容積6 mL/kg，用去離子水配左旋肉堿水溶液質(zhì)量濃度0.1 g/mL。每周末測(cè)量大鼠體質(zhì)量1次，均根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整大鼠給藥量。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑與儀器大鼠促卵泡激素（FSH）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測(cè)試劑盒（上海優(yōu)選生物科技有限公司，批號(hào)：YX-061908R）；大鼠促黃體激素（LH）ELISA檢測(cè)試劑盒（上海優(yōu)選生物科技有限公司，批號(hào)：YX-120800R）；大鼠雌二醇（E2）ELISA檢測(cè)試劑盒（上海優(yōu)選生物科技有限公司，批號(hào)：YX-050000R）；First Strand cDNA synthesis Kit（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：K1622）；Quantity Nova SYBR Green PCR Kit（德國(guó)Qiagen公司，批號(hào)：208052）；隨機(jī)引物（美國(guó)Invitrogen公司）。CX21光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；LDZ4-1.2離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；MP-120-2電子天平（上海第二天平儀器廠）；低溫冰箱（日本Sanyo公司）；熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）。

1.4動(dòng)物分組為了探討不同瘦身程度對(duì)生殖功能損害的差異，分為A組和B組兩大組，具體分組如下：150只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，每日08:00時(shí)應(yīng)用陰道脫落細(xì)胞涂片連續(xù)觀察10 d，建立大鼠動(dòng)情周期檔案。將動(dòng)情周期規(guī)律的大鼠納入實(shí)驗(yàn)，從中隨機(jī)抽取10只作為空白A組，10只作為空白B組。剩余大鼠進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，跑臺(tái)坡度為0°，每天20 min，第1天跑速為18 m/min，其后跑速每天增加2 m/min，共訓(xùn)練6 d（最終跑速為28 m/min），休息1 d。運(yùn)動(dòng)中采用聲音刺激或毛刷機(jī)械刺激鼠尾部，以使鼠保持持續(xù)性運(yùn)動(dòng)，在整個(gè)運(yùn)動(dòng)過程中，未使用電刺激。連續(xù)刺激或休息時(shí)間過長(zhǎng)仍不能維持原強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的大鼠不納入實(shí)驗(yàn)。選擇能夠適應(yīng)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的60只大鼠隨機(jī)分為模型A組、模型B組，恢復(fù)飲食A組、恢復(fù)飲食B組，恢復(fù)飲食+左歸丸A組、恢復(fù)飲食+左歸丸B組。

1.5動(dòng)物造模瘦身方案選擇“半量飲食+過度運(yùn)動(dòng)+左旋肉堿”的方法。（1）A組分為空白A組、模型A組、恢復(fù)飲食A組、恢復(fù)飲食+左歸丸A組，每組各10只大鼠。第1～4周，除空白A組外其余各組需執(zhí)行左旋肉堿灌胃、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)（跑臺(tái)坡度為0°，跑速為28 m/min，20 min/d，運(yùn)動(dòng)6 d，休息1 d）、50%日常攝食量。第5～8周恢復(fù)飲食A組、恢復(fù)飲食+左歸丸A組恢復(fù)飲食，停止左旋肉堿及跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，同時(shí)恢復(fù)飲食+左歸丸A組給予左歸丸干預(yù)。（2）B組分為空白B組、模型B組、恢復(fù)飲食B組、恢復(fù)飲食+左歸丸B組，每組各10只大鼠。第1～8周，除空白B組外其余各組需執(zhí)行左旋肉堿灌胃、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)（同造模A組）、50%日常攝食量。第9～12周恢復(fù)飲食B組、恢復(fù)飲食+左歸丸B組恢復(fù)飲食，停止左旋肉堿及跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，同時(shí)恢復(fù)飲食+左歸丸B組給予左歸丸干預(yù)。

1.6給藥方法（1）A組：空白A組（第1～4周，每日08:00時(shí)生理鹽水灌胃6 mL）；模型A組、恢復(fù)飲食A組、恢復(fù)飲食+左歸丸A組（第1～4周，半量飲食+每日運(yùn)動(dòng)前半小時(shí)左旋肉堿灌胃600 mg/kg，1次/d）；恢復(fù)飲食A組、恢復(fù)飲食+左歸丸A組（第5～8周，停止半量飲食、左旋肉堿、過度運(yùn)動(dòng)，恢復(fù)飲食A組生理鹽水灌胃5 mL，恢復(fù)飲食+左歸丸A組給予左歸丸灌胃1.62 g·kg-1·d-1）。（2）B組：空白B組（第1～8周，每日08：00時(shí)生理鹽水灌胃6 mL）；模型B組、恢復(fù)飲食B組、恢復(fù)飲食+左歸丸B組（第1～8周，半量飲食+每日運(yùn)動(dòng)前半小時(shí)左旋肉堿灌胃600 mg/kg，1次/d）；恢復(fù)飲食B組、恢復(fù)飲食+左歸丸B組（第9～12周，停止半量飲食、左旋肉堿、過度運(yùn)動(dòng)，恢復(fù)飲食B組生理鹽水灌胃5 mL，恢復(fù)飲食+左歸丸B組左歸丸灌胃1.62 g·kg-1·d-1）。

1.7觀察指標(biāo)與方法

1.7.1 大鼠一般狀態(tài)及體質(zhì)量觀察 每日08：00、12：00、18：00時(shí)詳細(xì)觀察并記錄每只大鼠造模及用藥前后飲食狀況、毛色光澤、精神狀態(tài)、活動(dòng)度、大小便等情況。于大鼠運(yùn)動(dòng)休息日08：00時(shí)用電子天平稱取并記錄大鼠空腹體質(zhì)量，對(duì)比瘦身前后、瘦身后恢復(fù)飲食以及藥物干預(yù)后大鼠的空腹體質(zhì)量變化。

1.7.2 大鼠陰道上皮脫落細(xì)胞涂片觀察 固定大鼠，暴露其下腹部，將制作的纖細(xì)棉簽用生理鹽水濕潤(rùn)后輕輕插入大鼠陰道約0.5 cm，順時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)1周后取出陰道脫落細(xì)胞。將取出的帶有大鼠陰道脫落細(xì)胞的棉簽在載玻片上逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)1周，制成涂片，編號(hào)并自然晾干。晾干的涂片于95%乙醇固定10 min→蘇木素染色5 min→自來水沖洗→1%鹽酸分化5 s→自來水沖洗→1%伊紅染色2 min→自來水沖洗。經(jīng)70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇→100%乙醇梯度脫水→二甲苯Ⅰ透明5 min→二甲苯Ⅱ透明5 min→自然晾干，光鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)期間每日08：00時(shí)行大鼠陰道上皮脫落細(xì)胞涂片觀察，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察各細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目以確定大鼠所處的動(dòng)情周期階段。光鏡下觀察成熟角化細(xì)胞百分比，以每200個(gè)脫落細(xì)胞中成熟角化細(xì)胞的數(shù)目所占百分比計(jì)算角化細(xì)胞指數(shù)，比較同一動(dòng)情時(shí)期的角化指數(shù)。

1.7.3 大鼠血清FSH、LH、E2含量測(cè)定 大鼠禁食禁飲12 h，電子天平測(cè)量并記錄體質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)器材高溫消毒干燥，10%水合氯醛（劑量0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠。麻醉生效后，首先固定頭部以及四肢，下腹部剃毛并常規(guī)消毒，立即腹主動(dòng)脈取血約5 mL，靜置30 min后，以轉(zhuǎn)速為3 000 r/min離心20 min后，用槍頭吸取上清液，置于-20℃以下冰箱保存，送陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)中心進(jìn)行各項(xiàng)性激素的檢測(cè)。

1.7.4 下丘腦Kiss1及GPR54 mRNA測(cè)定 大鼠采血后，迅速分離并摘取下丘腦組織，將其置入RNA保存液中，于-80℃冰箱凍存，用于熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）法進(jìn)行mRNA的檢測(cè)。具體方法：（1）抽提總RNA，測(cè)吸光度[D（260）]，并定量。（2）逆轉(zhuǎn)錄：①按下列順序在200μL PCR管中加入下列反應(yīng)物（體積為12μL）：DEPC水（10-x）μL；隨機(jī)引物/Oligo dT（50 pM/μL）2μL；RNA xμL（2μg）；②放置于PCR儀中，65℃處理5 min；③立即冰浴，高速（高于5 000 g）離心5 s；④按下列順序在PCR管加入下列反應(yīng)物（加入之后總體積為20μL）：RNA酶抑制劑（50 U/μL）1μL；5×buffer 4μL；dNTP MIX（10 mmol/L）2μL；RevertAid M-MuLV RT（200 U/μL）1μL；⑤混勻后，25℃，5 min，42℃，60 min（對(duì)于GC含量比較高的樣本，可以將溫度提高到45℃）；⑥70℃，處理5 min；⑦高速（高于5 000 g）離心5 s。-20℃保存。（3）熒光定量PCR擴(kuò)增：①序列與引物，序列參照Gene Bank數(shù)據(jù)庫中各目的基因的序列。見表1。②PCR反應(yīng)體系（10μL）：H2O 1.5μL；2×SYBGEEN PCR mix-5μL；Primer（10 pM/μL）/Primer（10 pM/μL）1μL；Template（反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，也即cDNA）2.5μL。③反應(yīng)條件：95℃，2 min；95℃，5 s；60℃，10 s。45個(gè)循環(huán)。熔解曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：所有的數(shù)值先與內(nèi)參做了△Ct，然后用第1個(gè)樣品做相對(duì)含量（p）=2-△△Ct分析。

1.8統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。造模以及后期干預(yù)后動(dòng)情周期觀察數(shù)據(jù)多組的比較采用卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

2 結(jié)果

2.1各組大鼠一般狀態(tài)觀察空白A、B組大鼠體態(tài)適中，毛發(fā)稠密，色澤正常，行動(dòng)靈活，反應(yīng)靈敏，大小便正常。模型A、B組大鼠體質(zhì)量下降，眼窩凹陷，精神不振，活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍，煩躁不安，豎毛，拱背，易驚，怕人，體毛粗糙無光澤，心率加快，體溫升高，對(duì)疼痛敏感等，且造模8周較造模4周大鼠一般狀態(tài)更差?；謴?fù)飲食A、B組與恢復(fù)飲食+左歸丸A、B組大鼠的一般狀態(tài)較同組模型組改善，且造模8周大鼠一般狀態(tài)恢復(fù)情況較造模4周大鼠恢復(fù)情況差。

2.2過度瘦身對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響及左歸丸干預(yù)作用表2結(jié)果顯示：造模前各組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)后，與同組空白組比較，模型A、B組大鼠體質(zhì)量明顯下降（P＜0.01）；與同組模型組比較，恢復(fù)飲食A、B組大鼠體質(zhì)量均明顯升高（P＜0.01）；與同組恢復(fù)飲食組比較，恢復(fù)飲食+左歸丸A組大鼠體質(zhì)量升高（P＜0.05），恢復(fù)飲食+左歸丸B組大鼠體質(zhì)量無明顯變化。

研究結(jié)果分析：通過“半量飲食+跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)+左旋肉堿”的方法可以導(dǎo)致大鼠體質(zhì)量逐漸下降。造模4周時(shí)，大鼠體質(zhì)量較原始值下降了17%，較空白組下降了26%。造模8周時(shí)，大鼠體質(zhì)量較原始值下降了23%，較空白組下降了35%。即造模8周大鼠體質(zhì)量較造模4周更低。給予恢復(fù)飲食后，造模4周大鼠體質(zhì)量恢復(fù)至空白組的98%，左歸丸干預(yù)后體質(zhì)量恢復(fù)更明顯；造模8周大鼠體質(zhì)量恢復(fù)為空白組的83%，左歸丸干預(yù)后體質(zhì)量恢復(fù)不明顯。造模8周大鼠體質(zhì)量比造模4周恢復(fù)情況差，可能與生殖功能損害程度有關(guān)，亦可能與恢復(fù)飲食及恢復(fù)飲食+左歸丸干預(yù)時(shí)長(zhǎng)有關(guān)。

表2 過度瘦身對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響及左歸丸干預(yù)作用Table 2 The effect of excessive weight loss on reproductive function of rats and the intervention actions of Pills （s，m/g）

表2 過度瘦身對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響及左歸丸干預(yù)作用Table 2 The effect of excessive weight loss on reproductive function of rats and the intervention actions of Pills （s，m/g）

①P＜0.01，與同組空白組比較；②P＜0.01，與同組模型組比較；③P＜0.05，與同組恢復(fù)飲食組比較

造模后及干預(yù)后300.0±5.58 223.0±5.49①293.0±6.58②301.0±7.15③324.0±4.52 211.0±8.29①268.0±6.53②270.0±5.68組別A組N 10 9 8 9 B組亞組空白A組模型A組恢復(fù)飲食A組恢復(fù)飲食+左歸丸A組空白B組模型B組恢復(fù)飲食B組恢復(fù)飲食+左歸丸B組10 10 9 9造模前268.0±4.62 269.0±5.31 270.0±6.67 271.0±5.44 270.0±5.66 274.0±4.45 272.0±5.65 271.0±4.96

2.3過度瘦身對(duì)大鼠動(dòng)情周期的影響及左歸丸干預(yù)作用大鼠動(dòng)情周期各期陰道上皮脫落細(xì)胞形態(tài)如圖1所示。動(dòng)情前期：大量上皮細(xì)胞，胞漿呈粒狀，少量角化（無核）細(xì)胞，無白細(xì)胞；動(dòng)情期：大量角化細(xì)胞，形狀大而不規(guī)則，尚有少量上皮細(xì)胞；動(dòng)情后期：大量多核白細(xì)胞，尚有融合的角化細(xì)胞；動(dòng)情間期：大量多核白細(xì)胞，少量上皮細(xì)胞。

表3結(jié)果顯示：恢復(fù)飲食A組動(dòng)情周期規(guī)律的大鼠數(shù)量較模型A組升高（P＜0.05）；恢復(fù)飲食+左歸丸A組動(dòng)情周期規(guī)律的大鼠數(shù)量較模型A組明顯升高（P＜0.01）。其余各組之間動(dòng)情周期規(guī)律比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4過度瘦身對(duì)大鼠血清FSH、LH、E2水平的影響及左歸丸干預(yù)作用表4結(jié)果顯示：與同組空白組比較，模型A、B組FSH、LH水平均明顯升高，E2水平均明顯下降（P＜0.01）。與同組模型組比較，恢復(fù)飲食A、B組FSH、LH水平均明顯下降，E2水平明顯升高（P＜0.01）。與同組恢復(fù)飲食組比較，恢復(fù)飲食+左歸丸A組的FSH、LH明顯下降（P＜0.01），E2水平升高（P＜0.05），恢復(fù)飲食+左歸丸B組FSH、LH較前稍有降低，E2水平稍有提高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。A、B組對(duì)應(yīng)組別之間比較，A組FSH、LH水平明顯低于B組（P＜0.01）。模型B組E2水平較模型A組降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其余A、B組對(duì)應(yīng)組別之間比較，B組E2水平明顯低于A組（P＜0.01）。

圖1 大鼠陰道上皮脫落細(xì)胞涂片觀察結(jié)果（×20）Figure 1 The smear result of exfoliative cells in vaginal epithelium（×20）

表3 過度瘦身對(duì)大鼠動(dòng)情周期的影響及左歸丸干預(yù)作用Table 3 The effect of excessive weight loss on regular estrus cycle of the rats and the intervention actions of Zuogui Pills

表4 過度瘦身對(duì)大鼠血清FSH、LH、E2水平的影響及左歸丸干預(yù)作用Table 4 The effect of excessive weight loss on rat serum contents of FSH，LH and E2 and the intervention actions of Zuogui Pills

表4 過度瘦身對(duì)大鼠血清FSH、LH、E2水平的影響及左歸丸干預(yù)作用Table 4 The effect of excessive weight loss on rat serum contents of FSH，LH and E2 and the intervention actions of Zuogui Pills

①P＜0.01，與同組空白組比較；②P＜0.01，與同組模型組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與同組恢復(fù)飲食組比較

組別A組N 10 9 8 9 B組E2[ρ/（pg·mL-1）]93.02±6.77 40.94±5.38①75.21±4.92②85.79±5.29③98.68±2.64 38.51±5.16①52.88±6.15②55.91±5.90亞組空白A組模型A組恢復(fù)飲食A組恢復(fù)飲食+左歸丸A組空白B組模型B組恢復(fù)飲食B組恢復(fù)飲食+左歸丸B組10 10 9 9 FSH[J/（mIU·mL-1）]16.14±1.54 30.34±1.29①24.06±1.68②20.27±1.05④15.94±1.13 41.23±1.27①39.45±1.44②39.12±1.39 LH[J/（mIU·mL-1）]13.01±1.08 20.25±1.67①17.02±1.74②15.21±1.13④13.37±1.25 23.09±1.56①19.89±1.66②19.73±1.41

研究結(jié)果表明：①過度瘦身模型可顯著提高大鼠血清FSH、LH水平，同時(shí)降低E2水平，與臨床上瘦身致卵巢功能下降患者出現(xiàn)高促性腺激素和低雌激素一致；②通過各期實(shí)驗(yàn)組內(nèi)比較：給予恢復(fù)飲食、左歸丸干預(yù)后，可在一定程度上使FSH、LH下降，E2升高；恢復(fù)飲食+左歸丸干預(yù)較單純恢復(fù)飲食對(duì)生殖功能恢復(fù)有明顯優(yōu)勢(shì)；③通過兩部分實(shí)驗(yàn)組間比較：給予恢復(fù)飲食、左歸丸干預(yù)后，4周生殖功能恢復(fù)情況較8周有顯著優(yōu)勢(shì)。

2.5過度瘦身對(duì)大鼠下丘腦Kiss1及GPR54 mRNA表達(dá)的影響及左歸丸干預(yù)作用圖2、3 Kiss1、GPR54 mRNA熔解曲線、擴(kuò)增曲線表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好。表5結(jié)果顯示：模型A、B組大鼠Kiss1的表達(dá)水平較同組空白組顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；恢復(fù)飲食A組大鼠Kiss1的表達(dá)水平較模型A組顯著上升（P＜0.01）；與恢復(fù)飲食A組比較，恢復(fù)飲食+左歸丸A組大鼠Kiss1表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；恢復(fù)飲食B組大鼠Kiss1表達(dá)與模型B組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；恢復(fù)飲食+左歸丸B組大鼠Kiss1表達(dá)水平與恢復(fù)飲食B組大鼠比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模8周各對(duì)應(yīng)組與造模4周比較，Kiss1的表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.01）。

圖2 下丘腦Kiss1的熒光定量PCR熔解曲線（A）及擴(kuò)增曲線（B）Figure 2 Fluorescence quantitative PCR melt curve and amplifying curve of Kiss1 in rat hypothalamus

圖3 下丘腦GPR54 mRNA的熒光定量PCR熔解曲線（A）及擴(kuò)增曲線（B）Figure 3 Fluorescence quantitative PCR melt curve and amplifying curve of GPR54 in rat hypothalamus

模型A、B組較同組空白組大鼠GPR54 mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；恢復(fù)飲食A組較模型A組大鼠GPR54 mRNA表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01）；與恢復(fù)飲食A組比較，恢復(fù)飲食+左歸丸A組大鼠GPR54 mRNA的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；恢復(fù)飲食B組大鼠GPR54 mRNA表達(dá)水平與模型B組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與恢復(fù)飲食B組比較，恢復(fù)飲食+左歸丸B組GPR54 mRNA的表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05）。B組各對(duì)應(yīng)組大鼠GPR54 mRNA表達(dá)水平較A組明顯下降（P＜0.01）。

結(jié)果分析：①通過各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)比較：A、B模型組大鼠下丘腦Kiss1及GPR54 mRNA表達(dá)均較空白組明顯下降，恢復(fù)飲食及恢復(fù)飲食+左歸丸都可提高大鼠下丘腦Kiss1及GPR54 mRNA的表達(dá)量，尤以結(jié)合左歸丸效果更佳。②通過兩部分實(shí)驗(yàn)組間比較：造模8周Kiss1及GPR54 mRNA降低情況較造模4周顯著；給予恢復(fù)飲食、左歸丸干預(yù)后，造模8周Kiss1及GPR54mRNA升高情況較造模4周緩慢。恢復(fù)飲食+左歸丸干預(yù)較單純恢復(fù)飲食效果好。

表5 過度瘦身對(duì)大鼠下丘腦Kiss1、GPR54 mRNA表達(dá)的影響及左歸丸干預(yù)作用Table 5 The effect of excessive weight loss on the mRNA expression levels of Kiss1 and GPR54 in rat hypothalamus and the intervention actions of Zuogui Pills （s，p）

表5 過度瘦身對(duì)大鼠下丘腦Kiss1、GPR54 mRNA表達(dá)的影響及左歸丸干預(yù)作用Table 5 The effect of excessive weight loss on the mRNA expression levels of Kiss1 and GPR54 in rat hypothalamus and the intervention actions of Zuogui Pills （s，p）

①P＜0.05，②P＜0.01，與同組空白組比較；③P＜0.01，與模型A組比較；④P＜0.01，與恢復(fù)飲食A組比較；⑤P＜0.01，與恢復(fù)飲食+左歸丸A組比較

GPR54 mRNA 0.993 0.307②0.499③0.632④0.902 0.181②③0.182④0.183⑤組別A組N 10 9 8 9 B組亞組空白A組模型A組恢復(fù)飲食A組恢復(fù)飲食+左歸丸A組空白B組模型B組恢復(fù)飲食B組恢復(fù)飲食+左歸丸B組10 10 9 9 Kiss1 mRNA 1.002 0.42①0.55③0.58④0.955 0.278②③0.282④0.283⑤

3 討論

3.1半量飲食+跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)+左旋肉堿灌胃造成大鼠過度消瘦狀態(tài)左旋肉堿[9]是食物的組成成分，主要作用是參與體內(nèi)脂肪代謝，作為載體來促進(jìn)脂肪酸的β氧化，從而調(diào)節(jié)脂肪生物代謝[10]。20世紀(jì)70年代已有左旋肉堿用于治療肥胖癥的報(bào)道[11]。研究[12]說明，左旋肉堿能夠提高運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖和超重者的促脂肪代謝作用，有效地增加運(yùn)動(dòng)的降重減脂效果。目前國(guó)內(nèi)減肥藥大多以左旋肉堿為主要成分，本研究選用“半量飲食+跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)+左旋肉堿”綜合方法造成大鼠消瘦狀態(tài)。結(jié)果顯示，大鼠瘦身前后體質(zhì)量變化明顯，造模8周較造模4周體質(zhì)量下降程度更大，且恢復(fù)飲食及藥物干預(yù)后，造模8周較造模4周大鼠體質(zhì)量恢復(fù)情況差。

3.2過度瘦身可導(dǎo)致生殖功能下降下丘腦、垂體與卵巢之間相互調(diào)節(jié)、相互影響，形成完整而又協(xié)調(diào)的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，即HPOA[13]，直接影響女性的生殖功能，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生功能失調(diào)或病變時(shí)都有可能導(dǎo)致女性排卵障礙、性激素分泌異常。當(dāng)體內(nèi)脂肪比重降至17%時(shí)，就會(huì)發(fā)生月經(jīng)周期紊亂、性欲明顯減退、不孕[14]。生活中越來越多的女性采用控制飲食或服用減肥藥達(dá)到瘦身目的，通過影響神經(jīng)內(nèi)分泌通路和改變生殖激素代謝率導(dǎo)致HPOA功能紊亂，從而影響女性生殖功能[15]。系列研究[16-19]表明，過度瘦身導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)不良嚴(yán)重影響了HPOA功能。臨床上常見神經(jīng)性厭食癥女性隨著體質(zhì)量的下降出現(xiàn)月經(jīng)紊亂、不孕等疾病，體質(zhì)量降至正常體質(zhì)量70%以下時(shí)會(huì)出現(xiàn)下丘腦性閉經(jīng)。下丘腦是HPOA的啟動(dòng)中心，由下丘腦弓狀核神經(jīng)細(xì)胞分泌的GnRH通過調(diào)節(jié)垂體釋放促性腺激素，促性腺激素細(xì)胞分泌FSH和LH，進(jìn)而作用于卵巢，促使卵巢卵泡生長(zhǎng)和成熟，產(chǎn)生雌、孕激素，維持女性生理功能。Kisspeptin是由Kiss1基因編碼[20]在2001年被發(fā)現(xiàn)的一種肽類激素。GPR54屬G蛋白歐聯(lián)受體[21]，是Kisspeptin的受體。免疫組織化學(xué)檢測(cè)證實(shí)Kisspeptin主要分布于大鼠下丘腦弓狀核等部位[22]。研究[23]發(fā)現(xiàn)Kisspeptin與GPR54結(jié)合后能促進(jìn)GnRH釋放，同時(shí)Kisspeptin可以介導(dǎo)E2的正負(fù)反饋，調(diào)節(jié)GnRH的分泌及HPOA，最終達(dá)到調(diào)節(jié)女性生殖功能的作用。

本研究通過造成大鼠過度瘦身模型，模擬人的消瘦狀態(tài)，通過觀察大鼠一般狀態(tài)、體質(zhì)量、血清性激素含量、下丘腦Kiss1及GPR54 mRNA表達(dá)水平來評(píng)價(jià)大鼠實(shí)驗(yàn)前后的生殖功能變化，后期給予恢復(fù)飲食及左歸丸干預(yù)，檢測(cè)大鼠生殖功能有無變化。結(jié)果顯示：當(dāng)體質(zhì)量較原始值下降17%，較空白組下降26%時(shí)，大鼠生殖功能已損害。當(dāng)體質(zhì)量較原始值下降23%，較空白組下降35%時(shí)，大鼠生殖功能損害程度更大，甚至呈卵巢早衰狀態(tài)；模型大鼠血清FSH、LH水平顯著升高，同時(shí)E2水平降低；模型組大鼠下丘腦Kiss1及GPR54 mRNA表達(dá)均明顯下降。說明過度瘦身可以導(dǎo)致下丘腦功能明顯下降，Kiss1及GPR54 mRNA表達(dá)水平下調(diào)，從而抑制垂體分泌及釋放FSH、LH，進(jìn)而導(dǎo)致卵巢功能降低。臨床上我們常見到過度消瘦的女性月經(jīng)異常，甚至閉經(jīng)，其生殖功能低于本年齡階段該有的水平。因此，本研究目的之一即是告誡女性不要盲目追求“骨感美”，從而影響自身健康，特別是對(duì)生殖功能的危害。

左歸丸為補(bǔ)益腎精的經(jīng)典方劑。有研究證實(shí)左歸丸可以通過增加大鼠卵巢、子宮肌層血管數(shù)目及卵巢、子宮肌層血管密度和管腔內(nèi)徑，來提高卵巢局部血循和子宮血運(yùn)[24]。朱玲等[25，26]發(fā)現(xiàn)，左歸丸可以從免疫平衡調(diào)節(jié)、性腺軸調(diào)節(jié)、卵泡凋亡等方面改善生殖功能。本研究選用左歸丸為干預(yù)中藥，觀察其對(duì)過度瘦身造成的陰血虧虛狀態(tài)的影響。結(jié)果顯示：給予恢復(fù)飲食后，造模4周大鼠體質(zhì)量恢復(fù)為空白組的98%，卵巢功能恢復(fù)明顯，且結(jié)合左歸丸效果更佳；造模8周大鼠體質(zhì)量恢復(fù)為空白組的83%，生殖功能恢復(fù)不明顯，且結(jié)合左歸丸效果不明顯；恢復(fù)飲食可使模型大鼠體內(nèi)FSH、LH水平下降，E2水平升高；恢復(fù)飲食及恢復(fù)飲食+左歸丸都可提高模型大鼠下丘腦Kiss1及GPR54 mRNA的表達(dá)量，尤以結(jié)合左歸丸效果更佳。給予恢復(fù)飲食及左歸丸干預(yù)后，造模4周較造模8周大鼠卵巢功能恢復(fù)更明顯，且結(jié)合左歸丸效果更佳；造模8周大鼠卵巢功能恢復(fù)不明顯，可能與卵巢受損程度有關(guān)，亦或與恢復(fù)飲食及藥物干預(yù)時(shí)長(zhǎng)有關(guān)。說明左歸丸可以通過補(bǔ)腎填精逆轉(zhuǎn)下降的生殖功能，證明了中醫(yī)“精血同源、腎主生殖、腎生髓充腦”的科學(xué)內(nèi)涵，可為中醫(yī)逆轉(zhuǎn)卵巢早衰的作用機(jī)制和恢復(fù)卵巢功能提供物質(zhì)基礎(chǔ)，為臨床防治卵巢早衰提供有效方案，為中藥抗卵巢早衰提供科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，當(dāng)體質(zhì)量較原始值下降17%時(shí)，大鼠生殖功能已明顯損害。當(dāng)體質(zhì)量較原始值下降23%時(shí)，大鼠生殖功能損害程度更大，甚至呈卵巢早衰狀態(tài)。早期階段，給予恢復(fù)飲食及左歸丸可以一定程度逆轉(zhuǎn)卵巢功能。造模時(shí)間越長(zhǎng)，大鼠卵巢功能越低下，干預(yù)后恢復(fù)程度越小。說明如果過度瘦身，即體質(zhì)量喪失越多，卵巢功能則越低下。因此，強(qiáng)烈呼吁廣大女性在愛美的同時(shí)，注意保護(hù)身體健康，尤其是要保護(hù)女性生殖功能，不要盲目地瘦身，追求骨感形體，最終導(dǎo)致生殖功能的損害。