姬中偉，毛健*,劉雙平,3

1(江南大學(xué)，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)3(江蘇省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,食品生物技術(shù)研究所(如皋江大食品生物技術(shù)研究所有限公司)，江蘇 南通，226500)

小米是谷子脫殼后的產(chǎn)物，又稱粟，各營養(yǎng)素比例適宜且消化率高，是良好的營養(yǎng)源[1]，具有健胃安神、降低血清甘油三酯等多種功能[2]，而且不含麩質(zhì)，在食品和飲料行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用[3]。

小米含有豐富的蛋白質(zhì)(平均含量約為9.73%(質(zhì)量分數(shù))[4])，是一種良好的植物蛋白來源。國內(nèi)外相關(guān)研究表明，以小米蛋白為原料，經(jīng)蛋白酶酶解或微生物發(fā)酵等方法可制得具有生物活性的小米蛋白肽。據(jù)目前報道，小米蛋白肽的生物活性主要有抗氧化(清除自由基等)、抗菌、調(diào)節(jié)免疫、降血壓、抑制淀粉酶活性等。

近年來，小米蛋白肽受到相關(guān)研究人員的持續(xù)關(guān)注，國內(nèi)外針對小米蛋白肽的研究內(nèi)容和方向較為多樣化。本文重點從小米蛋白肽的制備、分離純化及其生物活性等方面的研究進展進行綜述和總結(jié)，為小米蛋白肽進一步的研究、開發(fā)和應(yīng)用提供一定參考。

1 小米及小米蛋白的特點

小米，又稱粟、粱、狗尾草、黃粟、粟米等，為一年生谷類作物，隸屬于禾本科、狗尾草屬。小米中的蛋白、脂肪以及維生素等營養(yǎng)成分含量較高，除可食用外，還能作為藥物使用，具有多種功效如清熱、解渴、促進小便、治療水瀉等，長期食用后有利于滋補人體消化系統(tǒng)。

小米蛋白主要分布在小米胚和胚乳中，小米胚乳同時含有半透明(玻璃質(zhì))及不透明部分，不透明的胚乳中含有空氣間隙和球形淀粉粒，而半透明的胚乳中無空氣間隙，在蛋白質(zhì)中間充填著多邊形的淀粉粒[5]。由透射電鏡圖可見小米蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

小米蛋白中的谷氨酸含量最高，然后依次為亮氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸，賴氨酸含量較低[5-6]。必需氨基酸的組成達到42%，是一種優(yōu)良的植物蛋白來源。

小米蛋白主要有4種：清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和堿溶蛋白。其中醇溶蛋白和堿溶蛋白(又稱“谷蛋白”)為小米蛋白的兩大主要成分，尤其醇溶蛋白含量最多，占總蛋白的50%以上[7]，研究[8]發(fā)現(xiàn)，小米醇溶蛋白的二級結(jié)構(gòu)幾乎全為α螺旋結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量集中分布在11～25 kDa，而谷蛋白的二級結(jié)構(gòu)較為雜亂無序，大部分為β結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲，且分子質(zhì)量范圍分布較廣(11～180 kDa)。由此可見，小米醇溶蛋白和堿溶蛋白的結(jié)構(gòu)相差較大，可以根據(jù)2種蛋白在不同溶劑體系中的溶解度不同，分別進行提取研究。此外，利用超聲波輔助等方法能夠提升小米蛋白的提取效率[9]。

2 小米蛋白肽的制備方法

肽的制作和生產(chǎn)方法多種多樣，總體來說，大致分為酸堿水解法、酶水解法以及微生物發(fā)酵法。其中，酸堿水解法工藝最簡易，但無法避免出現(xiàn)氨基酸缺損、水解程度及產(chǎn)物肽的氨基酸序列等難以掌控的問題，現(xiàn)已被人們逐漸摒棄；相對而言，酶水解法和微生物發(fā)酵法的工藝條件較為溫和，同時產(chǎn)物中不會混入有害化學(xué)物質(zhì)，因而得到了廣泛的應(yīng)用[10]。

2.1 蛋白酶水解法

酶水解是最高效、安全且便于把控的蛋白肽制備手段，但各蛋白酶水解蛋白的作用位點不一定相同，同種蛋白質(zhì)經(jīng)不同的蛋白酶水解后，會產(chǎn)生不同氨基酸序列和不同分子質(zhì)量的多肽，表現(xiàn)出不同的生物活性[11]。另一方面，蛋白酶水解制備多肽時，還會因為某些植物蛋白中可能含有酶抑制劑而發(fā)生競爭性抑制，酶促反應(yīng)速度不僅不會提高，反而會迅速下降[12]。因此酶法制備多肽時，酶的種類、用量、底物濃度、溫度、pH、時間等參數(shù)都是酶法制備活性肽工藝的研究重點。

由于酶反應(yīng)的專一性，單酶作用范圍局限，水解效率較低，如果使用多酶進行水解，利用不同酶對蛋白質(zhì)的酶解特異性，可起到協(xié)同增效作用。已有研究[15-17]表明，蛋白質(zhì)經(jīng)多酶復(fù)合水解的產(chǎn)物活性明顯高于相對應(yīng)的單酶水解產(chǎn)物，而目前國內(nèi)外多以單酶水解小米蛋白進行研究，關(guān)于復(fù)合酶水解小米蛋白制備活性肽還有待進一步研究。

2.2 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法制備生物活性肽，是指某些能夠代謝產(chǎn)生蛋白酶的微生物來生產(chǎn)活性肽的方法。某些微生物具有非常高效的蛋白酶表達功能，它們能夠利用這些酶系水解蛋白原料生產(chǎn)各種活性肽，然后在發(fā)酵階段將這些肽持續(xù)排放到體系中，具有這種功效的微生物有枯草芽孢桿菌、保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌等，例如，郭麗娜等[18]利用枯草芽孢桿菌(NattoD-3)發(fā)酵小米糠(最佳發(fā)酵時間72 h)，成功制備了抗氧化活性肽。這些微生物擁有高效的蛋白質(zhì)水解體系且有助于生物活性肽的釋放，此外，微生物發(fā)酵法所生產(chǎn)的活性肽能夠直接進入人體內(nèi)消化系統(tǒng)，更容易被人體吸收，因此更加安全，應(yīng)用潛力巨大[19]。李慧娟等[20]以枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisJ3) 和植物乳桿菌(LactobacillusplantarumJNX) 組成混合菌株固態(tài)發(fā)酵豆粕制備了具有ABTS自由基較強清除活性的大豆肽。

關(guān)于采用微生物發(fā)酵法制備小米活性肽的研究較少，何署劍[21]利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵小米蛋白，獲得了具有較強自由基清除能力的活性肽。AMADOU等[22]利用副干酪乳桿菌Fn032發(fā)酵小米粉制備活性肽產(chǎn)物具有較強的抗氧化及抑制大腸桿菌的活性，CHEN等[23]利用根霉菌R.oryzae發(fā)酵制備的小米肽具有降低大鼠血壓等功效。以上研究僅為單一菌種發(fā)酵，而利用混合菌種發(fā)酵制備小米活性肽有待研究。但是微生物發(fā)酵法也存在某些不足之處，如微生物發(fā)酵及代謝過程復(fù)雜，產(chǎn)物難以控制，另外，發(fā)酵體系中的原輔料成分較多(必須為微生物提供氮源、碳源等條件)，造成產(chǎn)物的分離純化較為困難等問題，未來可考慮研發(fā)精確發(fā)酵控制技術(shù)，精簡發(fā)酵過程，從而實現(xiàn)目標(biāo)肽的高效、精確制備。

3 小米活性肽的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

肽的分離純化技術(shù)主要有超濾和色譜分離技術(shù)等，根據(jù)分離原理的不同，分離方法也不同。如超濾、凝膠色譜是根據(jù)肽的分子質(zhì)量大小分別進行粗分離和精分離，而離子交換色譜和高效逆流色譜等則分別利用樣品帶電性以及在兩相中分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)分離。經(jīng)過分離純化得到的多肽通常可由質(zhì)譜方法來測定氨基酸序列。

生物活性肽常見的分離純化方法有以下幾種：反相高效液相色譜(reverse phase high-performance liquid chromatograp，RP-HPLC)、親和色譜法、離子交換色譜法(ion exchange chromatography,IEC)、等電聚焦電泳(isoelectric focusing,IEF)、分子排阻色譜(molecular exclusion chromatography,SEC)、超高壓液相色譜(ultra performance high liquid chromatography,UHPLC)、親水作用色譜(hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)等，以上方法的分離純化機理各不相同，同時也存在不同的優(yōu)缺點[24]，在實際操作過程中，應(yīng)根據(jù)待分離活性肽的物理、化學(xué)特性來選擇最合適的分離純化手段，從而實現(xiàn)活性肽的高效分離。

對于小米活性肽的分離純化主要有以下研究。王帥等[25]利用Sephadex G-25凝膠色譜和DEAE-32離子交換層析對小米多肽進行純化，純度達到了電泳純。2016年，HIMANI等[14]首先利用Sephadex G-25凝膠色譜分離了小米堿溶蛋白酶解產(chǎn)物，然后針對具有最強抗氧化活性的組分利用反相超流液相色譜法(RP-UFLC)進一步分離純化，最后應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF/TOF MS)測定了活性肽的氨基酸序列，其氨基酸序列為SDRDLLGPNNQYLPK，分子質(zhì)量為1 729.2 Da，擁有16個氨基酸。該多肽含有多個疏水性氨基酸如Gly、Leu及Pro，能夠提升在脂肪體系中的溶解性，更好地與自由基結(jié)合并進行反應(yīng)，發(fā)揮其抗氧化作用。有報道[26]稱，含有重復(fù)氨基酸殘基的肽(如結(jié)構(gòu)式中的Leu-Leu和Asn-Asn結(jié)構(gòu))相比游離氨基酸的生理活性更強，且能更快速地被吸收。2019年，AGRAWAL等[27]從小米蛋白酶解產(chǎn)物中分離純化得到了2種抗氧化肽：TSSSLNMAVRGGLTR和STTVGLGISMRSASVR，通過分子對接模擬的方法發(fā)現(xiàn)，這2種肽的抗氧化活性與其中的絲氨酸和蘇氨酸殘基密切相關(guān)。AMADOU等[22]利用類似方法從小米粉發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化出3種具有抗氧化活性的多肽，并鑒定其氨基酸序列，分別為SGYYMH，LGTFQN，LHALLL。以上3種肽含有自由基清除能力較強的氨基酸如Gly、His、Leu等。

4 小米蛋白肽的生物活性

目前，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)小米蛋白肽具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抑菌、降血壓等多種生物活性，如表1所示。

表1 小米蛋白肽的生物活性Table 1 Bioactivities of millet peptides

4.1 抗氧化活性

4.1.1 清除自由基能力

目前，已有研究報道表明小米蛋白肽具有較強的自由基清除能力。HIMANI等[14]研究發(fā)現(xiàn)小米肽在1 g/L 時，DPPH自由基和ABTS自由基清除率分別為67.66%，78.81%。另外，同樣在1 g/L下，小米肽的Fe2+螯合能力(51.20 %)要遠高于BHT(10.59%)，表明其含有能有效結(jié)合金屬離子的氨基酸殘基。相比而言，采用微生物發(fā)酵法制備的小米肽的自由基清除能力較弱，在5 g/L下DPPH自由基清除率不到50%[22]。王帥等[25]利用堿性蛋白酶制備的小米多肽對超氧陰離子自由基、羥基自由基和DPPH自由基都可以實現(xiàn)高效清除，清除率與小米多肽濃度呈正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)小米多肽質(zhì)量濃度為50 μg/mL時對以上自由基的清除率分別為(62.71±3.86)%，(73.56±4.51)%和(82.62±5.25)%。通過對比發(fā)現(xiàn)，其自由基清除活性相比AGRAWAL等[14]所制備的肽更強，由此，不同制備方法及分離純化條件所得到小米肽的抗氧化活性差別較大。

4.1.2 抑制H2O2誘導(dǎo)的胰島細胞氧化應(yīng)激作用

研究發(fā)現(xiàn)[24]，小米多肽對H2O2誘導(dǎo)的紅細胞氧化溶血能夠起到顯著抑制作用(P<0.01，最低質(zhì)量濃度水平20 g/L)，有效地保護了紅細胞結(jié)構(gòu)的完整性，能有效抑制H2O2誘導(dǎo)損傷的大鼠胰島素瘤細胞(INS-1)損傷和凋亡，增加INS-1細胞的存活率；用50 μg/mL小米多肽處理時，細胞的存活率達到(96.30±5.21)%，且細胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生明顯減少，緩解了INS-1細胞氧化應(yīng)激。以上小米多肽的作用機制據(jù)推測或與超氧化物歧化酶Ⅰ、過氧化氫酶、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶、醌氧化還原酶Ⅰ等抗氧化酶系的過表達相關(guān)，從而減輕了H2O2引起的細胞損傷[30-31]。但小米肽在動物機體內(nèi)的抗氧化功效和作用機理有待進一步探究。

4.2 免疫調(diào)節(jié)作用

研究表明，某些生物活性肽或蛋白酶解物能夠起到免疫調(diào)節(jié)作用(細胞免疫為主)，包括淋巴細胞增殖、抗體合成及細胞因子調(diào)節(jié)作用。這些免疫調(diào)節(jié)肽具有調(diào)節(jié)人類淋巴細胞的增殖、刺激巨噬細胞的吞噬活性、抑制某些細胞因子產(chǎn)生的作用[31-33]。

劉劍利等[34]將小米多肽分為高、中、低劑量組喂飼小鼠，通過淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗、半數(shù)溶血值(HC50)等指標(biāo)研究小米多肽對小鼠免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，不同劑量的小米多肽有明顯的刺激淋巴細胞轉(zhuǎn)化作用，對小鼠淋巴細胞有明顯的增殖作用，增強了細胞免疫作用，小鼠巨噬細胞的吞噬功能及脾臟指數(shù)顯著提升(P<0.05)，小米活性肽可通過非特異性免疫來增強動物機體的免疫功能。

4.3 抑菌活性

目前，具有抑菌功效的生物活性肽成為人們的研究熱點之一?？咕氖侵妇哂幸志πУ纳锘钚噪模蠖鄮д姾?，且為兩親性，由于分子質(zhì)量小，故能夠快速進入到感染的區(qū)域[35]，從而有效地抑制菌體的生長。以富含蛋白質(zhì)的動植物原料(如花生、鯽魚魚鱗、辣椒籽等)制備的抗菌肽對于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、黃曲霉菌、沙門氏菌等均具有較好的抑菌活性[36-38]。此外，某些微生物在自身代謝過程中會產(chǎn)生特定的抗菌肽，例如，白杰等[39]在枯草芽孢桿菌B3菌株(BacillussubtilisB3) 液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了具有抑制大腸桿菌和沙門氏菌活性的抗菌肽，且經(jīng)進一步研究發(fā)現(xiàn)，該抗菌肽具有較強的耐熱性、耐酸堿性和光照穩(wěn)定性。故抗菌肽在食品或醫(yī)藥產(chǎn)品開發(fā)方面具有廣闊的應(yīng)用前景[40-42]。

研究[20]發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵法制備的小米多肽在40 μg/mL下對大腸桿菌E.coliATCC 8099表現(xiàn)出較強抑制作用，此結(jié)果也驗證了含有Gly和Leu殘基的多肽能夠有效抑制革蘭氏陰性菌的生長的結(jié)論[43]。而小米多肽對于其他細菌的抑制活性及其抑菌機理尚缺乏深入全面研究。雖然國外已有研究[44]認為生物活性肽的抑菌作用與凈正電荷和疏水性密切相關(guān)，但確切機制還有待于進一步驗證。

4.4 抑制ACE、α-淀粉酶和α-葡萄糖酶活性

CHEN等[23]研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)4周喂食自發(fā)高血壓大鼠(劑量為200 mg肽/kg體重)小米蛋白酶解物、擠壓小米蛋白酶解物及發(fā)酵小米蛋白酶解物，均能有效抑制血清ACE活性，并降低血管緊張素Ⅱ水平，從而降低大鼠血壓，同時未發(fā)現(xiàn)有其他不良反應(yīng)。但其中的定量構(gòu)效關(guān)系(quantitative structure-activity relationship,QSAR)需進一步研究。

KARAS等[45]研究分子質(zhì)量低于3 kDa的小米蛋白酶解物對不同溫度熱處理后的抑制ACE、α-淀粉酶和α-葡萄糖酶的活性的影響，發(fā)現(xiàn)醇溶蛋白水解物抑制ACE及α-淀粉酶的IC50值分別為0.42，0.11 mg/mL，經(jīng)100 ℃處理后的ACE及α-葡萄糖酶的IC50值分別為0.33、0.12 g/L；經(jīng)65 ℃處理后的11s球蛋白酶解產(chǎn)物的ACE及α-葡萄糖酶的IC50值分別為0.38、0.05 g/L。由此可見，以上幾種酶解產(chǎn)物的活性較高，質(zhì)譜分析結(jié)果表明其氨基酸序列分別為GEHGGAGMGGGQFQPV、EQG-FLPGPEESGR、RLARAGLAQ、YGNPVGGVGH、GNPVGGVGHGTTGT。

5 結(jié)論及展望

由于所具備的特殊功能，生物活性肽可以被用作某些藥物替代品或者食品添加劑[46-47]。生物活性肽的來源頗為廣泛，可從自然界的各種動植物、微生物蛋白中制備獲取。目前，針對植物來源的生物活性肽制備、純化及生物活性等方面的研究已經(jīng)取得了較多進展，但主要集中于大豆、花生、大米、玉米、小麥等農(nóng)作物，而對于小米這一重要雜糧作物中蛋白肽的研究仍然較少，且主要局限于利用小米中的堿溶蛋白制備活性肽，對于小米中其他蛋白如含量最高的醇溶蛋白的研究卻尚未見報道，可能是由于醇溶蛋白不溶于水相，因而限制了相關(guān)研究的開展，未來可考慮采用微波、超聲波、熱處理等技術(shù)手段對其改性，改變其結(jié)構(gòu)(二級結(jié)構(gòu))和基本特性(如溶解性、起泡性等)，然后再進一步采用合適的技術(shù)方法制備活性肽。另一方面，有關(guān)小米蛋白肽在動物機體中的某些生物活性評價(如抗氧化活性等)、活性肽的穩(wěn)定性及風(fēng)味特征等方面有待進一步明確。

小米蛋白是一種營養(yǎng)價值較高的植物蛋白，具有成本低、安全性好等優(yōu)勢，未來充分利用這一蛋白資源，開發(fā)制備具有特定生理活性的小米蛋白肽，對于提升小米精深加工利用水平和功能食品開發(fā)等具有重要意義。