郭鵬利,路云龍,李想,李麗華,任孝茹,陳利莉,張敢為,季艷偉

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌，712100)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) 是一種常見(jiàn)的食源性致病菌，由其引起的食物中毒在革蘭氏陽(yáng)性菌中高居首位，其致病能力主要取決于該菌產(chǎn)生的腸毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)[1]。SEs是由S.aureus分泌產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)相似的可溶性胞外毒素蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為 27.5～30 kDa，熱穩(wěn)定性好，經(jīng) 100 ℃煮沸 30 min而不被破壞，因此，經(jīng)S.aureus污染的食物經(jīng)過(guò)一般加熱處理后，雖然細(xì)菌菌體可被殺死，但其產(chǎn)生的SEs仍然具有活性和致病力[2-3]。SEs按血清學(xué)分類，主要有SEA、SEB、SECs、SED、SEE等血清型，其中SEB因?qū)γ庖呒?xì)胞有嚴(yán)重的毒性作用，半致死劑量?jī)H為 20 ng/kg，因此被認(rèn)定為Ⅱ類毒物，并且易以噴霧的形式用作生化武器[4]。SEB主要存在于肉類、乳及乳制品等蛋白質(zhì)含量較高的動(dòng)物性食品中，鑒于此，建立一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏且低成本的SEB檢測(cè)技術(shù)顯得尤為重要。

目前，檢測(cè)SEB的方法主要有分子生物學(xué)檢測(cè)法、免疫學(xué)檢測(cè)法以及生物傳感器法，其中，分子生物學(xué)檢測(cè)法主要是對(duì)SEB的基因進(jìn)行檢測(cè)，但并不能直接檢測(cè)蛋白本身[5-8]?；诳乖贵w特異性識(shí)別的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)是實(shí)現(xiàn)復(fù)雜食品基質(zhì)中SEB定量檢測(cè)的常用技術(shù)，酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 是其中一種相對(duì)較為成熟的檢測(cè)方法，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有很多的相關(guān)研究報(bào)道，但是真正商業(yè)化的產(chǎn)品并不多[9-10]。目前的ELISA方法多采用多克隆抗體或單克隆抗體作為識(shí)別元件，但傳統(tǒng)單克隆抗體存在制備耗時(shí)耗力、產(chǎn)量低、以及由于金黃色葡萄球菌表面存在或分泌的金黃色葡萄球菌蛋白A (Staphylococcal protein A，SpA) 會(huì)與單克隆抗體的Fc端高親和力結(jié)合而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果等問(wèn)題，進(jìn)而阻礙ELISA方法的應(yīng)用[11-12]。近年來(lái)，基因工程抗體得到了蓬勃發(fā)展，抗體的小型化是基因工程抗體的一個(gè)主要研究方向，其中單域重鏈抗體(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH) 為駱駝科(駱駝、羊駝或美洲駝)及鯊魚(yú)體內(nèi)存在的天然缺失輕鏈的單鏈抗體，由3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determining regions，CDRs) 構(gòu)成，其晶體結(jié)構(gòu)呈橢圓形，直徑為2.5 nm，長(zhǎng)為4 nm，所以又稱為納米抗體(nanobody，Nb)[13-14]。納米抗體與單克隆抗體相比，由于天然缺乏Fc端識(shí)別位點(diǎn)，因此可有效避免與SpA結(jié)合導(dǎo)致的假陽(yáng)性問(wèn)題[15]。另外，納米抗體還具有以下優(yōu)點(diǎn)：具有更長(zhǎng)的CDR3區(qū)，故具有較多的柔韌性和凸面性，使其更好地與抗原表面的裂縫和腔隙相結(jié)合，從而提高納米抗體的親和力和抗原特異性；體積小、穩(wěn)定性高、水溶性好，可在微生物系統(tǒng)中大量合成表達(dá)，為納米抗體低成本、高效率的生產(chǎn)創(chuàng)造了條件。基于以上優(yōu)點(diǎn)，納米抗體已被廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)及臨床診斷中，如黃曲霉毒素B1、Cry1Ac蛋白和赭曲霉毒素A等的檢測(cè)[16-22]。

本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中，已采用生物淘選策略從SEB納米抗體噬菌體展示文庫(kù)中淘選得到2株SEB的納米抗體配對(duì)組合。以其中1株納米抗體作為捕獲抗體，以另一株噬菌體展示的納米抗體作為檢測(cè)識(shí)別元件，建立一種基于納米抗體的靈敏度高、特異性強(qiáng)且適用于食品及農(nóng)產(chǎn)品樣品中SEB檢測(cè)的ELISA方法。該方法以納米抗體作為識(shí)別元件，避免了以單克隆抗體作為識(shí)別元件的傳統(tǒng)ELISA方法存在的與SpA結(jié)合導(dǎo)致的假陽(yáng)性問(wèn)題，具有較好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

SEB納米抗體噬菌體展示文庫(kù)、抗SEB B6噬菌體、抗SEB B7納米抗體、M13 KO7輔助噬菌體、金黃色葡萄球菌CATCC 29213、金黃色葡萄球菌CATCC 26111、金黃色葡萄球菌CATCC 25925、E.coliTop10 、E.coliTG1,由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

細(xì)胞裂解液(B-PERTMBacterial Protein Extraction Reagent)，Thermo Fisher公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記M13 單克隆抗體，Santa Cruz公司；Ni2+- NTA親和層析柱，GE Healthcare公司；脫脂奶粉，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker、卡那霉素(Kanamycin，Kana)、氨芐青霉素(ampicillin，Amp)，北京索萊寶公司；其他試劑均為分析純,sigma公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

Bio-Rad Gel Doc 凝膠成像系統(tǒng)、迷你型垂直凝膠電泳儀，美國(guó)伯樂(lè)公司；全溫度恒溫培養(yǎng)搖床、微量移液器，美國(guó) Thermo 公司；2K-15低溫離心機(jī)，Sigma 公司； SpectraM axM酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 噬菌體的擴(kuò)增

在含 100 μg/mL Amp的LB平板上挑取E.coliTG1接種于 5 mL含 100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中， 37 ℃，靜置培養(yǎng) 12 h；按 1% 接種量接種于含 100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600約為 0.3，按 20∶1 (感染復(fù)數(shù))加入M13 KO7輔助噬菌體，靜置 15 min后，37 ℃，220 r/min培養(yǎng) 1 h；將培養(yǎng)液在 4 ℃、5 000 r/min條件下離心5 min，去上清，用等體積的含 100 μg/mL Amp、30 μg/mL Kana的LB培養(yǎng)基重懸，30 ℃、220 r/min培養(yǎng) 5～8 h； 4 ℃、8 000 r/min離心 10 min，取上清，加入 0.2體積的PEG/NaCl溶液，4 ℃靜置過(guò)夜；4 ℃、12 000 r/min離心 20 min，棄上清，加入1 mL 50%(體積分?jǐn)?shù))甘油重懸噬菌體沉淀，即得到抗SEB B6噬菌體，并于-80 ℃條件下保存。

1.2.2 納米抗體的表達(dá)與條件優(yōu)化

將納米抗體B7的載體轉(zhuǎn)入E.coliTOP10 感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含 100 μg/mL Amp的LB平板上，37 ℃、250 r/min培養(yǎng) 12 h；在該平板上挑取一個(gè)單菌落接種于 5 mL含 100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)過(guò)夜；按 1% 接種量接種于含 100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)至OD600約為 0.6，加入終濃度為 1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；4 ℃、5 000 r/min離心 8 min，棄上清，按每克菌體加入 5 mL B-PER細(xì)胞裂解液，靜置 15 min；4 ℃、10 000 r/min離心 10 min，收集上清，用 0.22 μm濾器過(guò)濾上清，再經(jīng)Ni2+-NTA柱純化，具體步驟參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，而后透析得到納米抗體B7，SDS-PAGE分析純化后的納米抗體純度，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定納米抗體B7濃度。此外，并對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的溫度(20、24、28、32、37 ℃) 和時(shí)間(2、4、6、8、10 h) 2個(gè)關(guān)鍵條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.3 棋盤(pán)滴定

用PBS將納米抗體B7稀釋至 16、8、4、2、1、0.5、0 μg/mL，加入 96 孔酶標(biāo)板中，100 μL/孔，4 ℃包被過(guò)夜；PBST洗板 3次，加入體積分?jǐn)?shù)3% 的脫脂牛奶，300 μL/孔，37 ℃封閉 2 h；PBST洗板 3次，加入 100 ng/mL的SEB，100 μL/孔，37 ℃孵育45 min；PBST洗板 3次，用PBS稀釋抗SEB B6噬菌體至滴度為 1010、109、108、107PFU/mL，100 μL/孔，37 ℃孵育 45 min；PBST洗板 6次，加入HRP標(biāo)記的抗M13 噬菌體的單克隆抗體，100 μL/孔，37 ℃孵育 45 min；PBST洗板 3次，加入TMB顯色液，100 μL/孔，37 ℃孵育 10 min；加入 2 mmol/L的H2SO4，50 μL/孔，終止反應(yīng)，立即用酶標(biāo)儀讀取OD450值。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將納米抗體B7稀釋至8 μg/mL，加入96孔酶標(biāo)板中，100 μL/孔，4 ℃包被過(guò)夜；PBST洗板3次，加入 3% 的脫脂牛奶，300 μL/孔，37 ℃封閉 2 h；PBST洗板體積分?jǐn)?shù)3次，加入用PBS溶液稀釋至終濃度為 0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1 024 ng/mL的SEB標(biāo)準(zhǔn)品，100 μL/孔，37 ℃孵育 45 min；PBST洗板 3次，加入滴度為 109PFU/mL的抗SEB B6噬菌體，100 μL/孔，37 ℃孵育 45 min；PBST洗板 6次，加入HRP標(biāo)記的抗M13 噬菌體的單克隆抗體，100 μL/孔，37 ℃孵育 45 min；PBST洗板 3次，加入TMB顯色液，100 μL/孔，37 ℃孵育 10 min；加入 2 mmol/L的H2SO4，50 μL/孔，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取OD450值。

1.2.5 最低檢出限的測(cè)定

隨機(jī)選取 20 份經(jīng)商業(yè)化試劑盒確證為SEB陰性的牛奶、牛肉以及西瓜汁樣品，用本研究建立的ELISA方法檢測(cè)上述陰性樣品(每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定 5次)，根據(jù)所構(gòu)建的定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每個(gè)陰性樣品中SEB的濃度，以 20 個(gè)陰性樣品計(jì)算獲得的SEB平均濃度加上3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差即為該方法檢測(cè)牛奶中SEB的最低檢出限。

1.2.6 特異性分析

配制終質(zhì)量濃度為 0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1 024 ng/mL的SEA、SEB、SEC，并將金黃色葡萄球菌CATCC 29213、金黃色葡萄球菌CATCC 26111、金黃色葡萄球菌CATCC 25925 稀釋至終濃度為 107、106、105、104、103、102CFU/mL，用本研究建立的ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，記錄OD450值，以評(píng)價(jià)該方法的特異性。

計(jì)算交叉反應(yīng)率，如公式(1)所示：

(1)

式中：Cr，交叉反應(yīng)率，%；SC50analog，類似物半飽和信息值濃度；SC50SEB，SEB半飽和信息值濃度。

1.2.7 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取經(jīng)商業(yè)化試劑盒確證為SEB陰性的樣品提取液，分別添加SEB標(biāo)準(zhǔn)品至終質(zhì)量濃度為 1 600、800、400、200 ng/mL，稀釋 10 倍后分別用本研究建立的ELISA方法檢測(cè)其中的SEB濃度，每個(gè)樣品測(cè)定 6次，得出每個(gè)加標(biāo)濃度的平均回收率，以評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米抗體表達(dá)條件優(yōu)化

誘導(dǎo)溫度不僅會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)，同時(shí)也影響著重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)水平和蛋白的可溶性[23]。本研究在培養(yǎng)基中加入 1 mmol/L IPTG，分別在不同的溫度下(20、24、28、32、37 ℃) 誘導(dǎo)表達(dá) 8 h后，通過(guò)全菌體的SDS-PAGE圖譜對(duì)納米抗體B7表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果如圖1所示，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為 32 ℃時(shí)，表達(dá)量最大，因此確定 32 ℃為最佳表達(dá)溫度。

M-蛋白質(zhì)Marker; 1～5- 20、24、28、32，37 ℃下的全菌體圖1 不同誘導(dǎo)溫度下納米抗體B7表達(dá)量的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of nanobody B7 expressionat different induction temperatures

隨著誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的延長(zhǎng)，納米抗體的表達(dá)量趨于平穩(wěn)，為了使納米抗體的表達(dá)量達(dá)到最大且耗時(shí)最短，本研究在培養(yǎng)基中加入 1 mmol/L的IPTG、于最優(yōu)誘導(dǎo)溫度 32 ℃的條件下分別誘導(dǎo)表達(dá)不同時(shí)間(2、4、6、8、10 h)，通過(guò)全菌體的SDS-PAGE圖譜分析納米抗體表達(dá)量。結(jié)果如圖2所示，當(dāng)誘導(dǎo)表達(dá) 8 h時(shí)納米抗體表達(dá)量達(dá)到最大，因此在后續(xù)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)表達(dá)最佳時(shí)間為 8 h。

M-蛋白質(zhì)Marker; 1～5-誘導(dǎo)時(shí)間為 2、4、6、8、10 h下的全菌體圖2 不同誘導(dǎo)時(shí)間納米抗體B7表達(dá)量的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of nanobody B7 expression indifferent induction time

2.2 納米抗體的純化

將宿主菌E.coliTop10 于最優(yōu)的條件下進(jìn)行表達(dá)，1 mmol/L的IPTG，32 ℃誘導(dǎo)表達(dá) 8 h，離心收集菌體經(jīng)細(xì)胞裂解液裂解后，收集上清進(jìn)行鎳柱純化，純化后的納米抗體進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3所示，蛋白分子質(zhì)量約為 17 kDa，與理論分子質(zhì)量大小相符，純化后條帶單一、無(wú)雜帶，說(shuō)明具有較高的純度，并且對(duì)納米抗體濃度進(jìn)行檢測(cè)，得出納米抗體B7的表達(dá)量為 6.2 mg/L。

M-蛋白質(zhì)Marker; 1-純化后的納米抗體圖3 納米抗體純化的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of nanobody B7 after purification

2.3 棋盤(pán)滴定

要實(shí)現(xiàn)ELISA方法的高靈敏檢測(cè)，抗原抗體的結(jié)合部位應(yīng)以充分暴露在抗原表面且配對(duì)抗體抗原識(shí)別位點(diǎn)相對(duì)較遠(yuǎn)為宜，在此基礎(chǔ)上，摸索出抗體的最佳使用濃度。本研究在前期研究中已確定了SEB的納米抗體配對(duì)組合，現(xiàn)通過(guò)棋盤(pán)滴定法確定納米抗體B7和抗SEB B6噬菌體的最佳用量。結(jié)果如圖4所示，最佳納米抗體的濃度為 8 μg/mL，最佳抗SEB B6噬菌體的滴度為 109PFU/mL。

圖4 棋盤(pán)滴定法確定納米抗體和噬菌體的最優(yōu)工作條件Fig.4 Checking the optimal working conditions ofnanobody and phage by checkerboard titration

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在最適條件下，利用ELISA方法檢測(cè) 16 個(gè)不同SEB加標(biāo)質(zhì)量濃度的陰性樣品，結(jié)果顯示隨著SEB質(zhì)量濃度的增加，OD450值逐漸增加，并且以SEB質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，OD450值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，該ELISA方法的定量線性范圍為 16～1 024 ng/mL。線性回歸方程為y=0.239 4 lnx-0.490 1，線性相關(guān)系數(shù)(R2) 為 0.99。隨機(jī)檢測(cè) 20 個(gè)陰性樣品，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得該方法檢測(cè)實(shí)際食品樣品中SEB的最低檢出限為(9.58±0.07) ng/mL，以上結(jié)果表明，該方法在食品樣品中加標(biāo)SEB具有較高的檢測(cè)靈敏度。

2.5 特異性實(shí)驗(yàn)

為評(píng)估該方法的特異性，本研究選取3株金黃色葡萄球菌(CATCC 29213、CATCC 26111和CATCC 25925)、SEA及SEC作為檢測(cè)對(duì)象，用已確證為陰性的樣品提取液配制系列加標(biāo)溶液，采用本研究建立的ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，并依據(jù)交叉反應(yīng)率公式評(píng)價(jià)ELISA的特異性。

結(jié)果如表1所示，該方法與SEC有 42.18% 的交叉，與SEA及3株金黃色葡萄球菌無(wú)明顯交叉。目前，基于ELISA的腸毒素檢測(cè)方法已經(jīng)較為成熟，但是始終無(wú)法避免與SpA結(jié)合導(dǎo)致的假陽(yáng)性問(wèn)題[24]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1763. 2-2006(2010) 規(guī)定采用ELISA方法檢測(cè)進(jìn)出口食品中的SEB，但該方法是以單克隆抗體作為識(shí)別元件，可導(dǎo)致與金黃色球菌SpA高親和性結(jié)合出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果[25]，使得檢測(cè)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。該方法因納米抗體無(wú)Fc端可有效避免與spA結(jié)合導(dǎo)致的假陽(yáng)性問(wèn)題，可用于特異性檢測(cè)食品樣品中的SEB污染，且不受其他物質(zhì)干擾。

表1 ELISA與其他結(jié)構(gòu)類似物及其產(chǎn)生菌的交叉反應(yīng)率Table 1 The cross-reactivity of ELISA with other agonists and SAs

2.6 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

采用SEB加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)所建立的ELISA方法的準(zhǔn)確度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，分別在陰性的牛奶、牛肉和果汁中添加終質(zhì)量濃度為 200、400、800、1 600 ng/mL的SEB標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)樣品前處理后，用本研究建立的ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示該方法在牛奶、牛肉和西瓜汁樣品的回收率分別為 87.26%～108.43%，79.36%～106.56% 和 83.81%～99.43%，變異系數(shù)為2.77%～16.15%，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性。

3 結(jié)論

SEB是牛乳等食品中常見(jiàn)的生物毒素之一，半致死劑量?jī)H為 20 ng/kg，實(shí)現(xiàn)在食品基質(zhì)中的SEB高靈敏檢測(cè)對(duì)于維護(hù)食品安全具有重要意義?；诳乖贵w特異性反應(yīng)原理的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，本身就具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，加之納米抗體的低免疫原性、高水溶性、低成本以及天然缺失Fc端的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)SEB的準(zhǔn)確定量，使得該方法具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

表2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of sample spiked recovery experiment

本研究建立的納米抗體-噬菌體夾心ELISA方法，在 16～1 024 ng/mL具有良好的線性關(guān)系，最低檢出限為(9.58±0.07)ng/mL。由于SEB和SEC同源性較強(qiáng)，而與SEA同源性弱，故該方法表現(xiàn)出與SEC存在一定的交叉，而與SEA無(wú)明顯交叉。該方法可用于食品中SEB的初步定量及高通量篩查，為檢測(cè)食品中的SEB污染及篩選SEB陽(yáng)性菌株提供了有效方法，也為準(zhǔn)確檢測(cè)食品中SEB的含量提供了新思路。隨著基因工程抗體技術(shù)的發(fā)展，有望通過(guò)定向突變的方法進(jìn)一步提高2株納米抗體的親和力及特異性，以期實(shí)現(xiàn)食品中SEB的高靈敏檢測(cè)。