李則靈，朱霞建，范佳瑩，談安群，易鑫，周琦，郭莉，黃林華，王華

(西南大學(xué)柑桔研究所，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶，400712)

柚皮素(4′，5，7-三羥基二氫黃酮)是柚皮苷的苷元，廣泛存在于蕓香科植物中，在降血脂、鎮(zhèn)靜、抗氧化、抗真菌、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等方面具有較強的藥理活性[1-4]。黃酮類化合物之所以一直受到廣泛的關(guān)注，是因為其代謝后能夠改變藥物的生物活性和細(xì)胞透過能力[5]。因此認(rèn)為黃酮類天然藥物是以前藥的形式存在，真正起作用的是其代謝產(chǎn)物[6]。研究表明，柚皮苷通過口服或灌胃給藥后在動物體內(nèi)主要水解生成柚皮素，且相比口服柚皮苷，直接口服柚皮素具有更好的藥動學(xué)效應(yīng)[7-8]。

柚皮素雖在天然植物中來源廣泛，但含量極低，通過提取法得率較低[9]，且需要使用大量有機溶劑，易造成環(huán)境污染。基于這些問題，目前工業(yè)上主要通過水解柚皮苷來大量制備柚皮素。豐都紅心柚是中國十大名柚之一，以其深紅鮮艷的汁胞和豐富的營養(yǎng)而深受消費者喜愛。柚子生長過程中，由于疏果處理及生理原因常造成果園大量的落果，種植者一般任其腐爛。但研究表明[10]，掉落的幼果果皮中柚皮苷含量遠(yuǎn)高于成熟果，是制備柚皮素的理想原料。因此，本文以紅心柚落果為原料提取柚皮苷進而水解制備柚皮素，能夠極大程度地實現(xiàn)資源綜合利用、減輕落果丟棄造成的環(huán)境問題。

柚皮素的水解制備方法包括酶法、微生物法及酸解法。酶解法在實際生產(chǎn)應(yīng)用中成本高，且存在柚皮苷溶解度小、反應(yīng)時間過長的問題，經(jīng)濟效益較低[11-12]。有研究者為了避免酶的復(fù)雜的分離純化步驟，采用產(chǎn)柚苷酶霉菌與柚皮苷混合，通過霉菌直接水解柚皮苷[13-14]。該法雖反應(yīng)條件溫和、專一性強，但仍存在操作繁瑣、耗時長的問題。酸解法是指將柚皮苷與酸的水溶液混合，在高溫或高溫高壓情況下催化反應(yīng)，將柚皮苷水解掉一分子葡萄糖和鼠李糖得到最終產(chǎn)物柚皮素的過程，高溫條件下柚皮苷能在溶劑中較好地溶解，與酸充分反應(yīng)，產(chǎn)物得率高[15-16]。目前很少有研究者從柚子果園落果中提取柚皮苷，并以其制備苷元柚皮素，而關(guān)于不同酸解條件對柚皮素得率和柚皮苷水解率影響的文獻鮮見報道。本文以豐都紅心柚落果為原料，提取柚皮苷并運用酸解法制備柚皮素，通過單因素試驗探究各反應(yīng)條件對柚皮素得率及柚皮苷水解率的影響，并通過正交設(shè)計優(yōu)化，確定了最佳的工藝條件，為豐都紅心柚落果高價值利用，開發(fā)簡便、低成本的柚皮素制備工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豐都紅心柚落果,采購于重慶市豐都縣;柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥95%，Sigma公司)、柚皮素標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥97%，Sigma公司)、濃HCl(分析純)、NaOH(分析純)甲醇(分析純)、乙醇(分析純)，成都科龍化工試劑廠；甲醇(色譜純)，Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BT224S 電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DF-101S 集熱式恒溫磁力攪拌器，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；UltiMate3000 高效液相色譜儀，戴安中國有限公司；恒溫水浴鍋，上海雙舜實業(yè)發(fā)展有限公司；LGJ-10 臺式真空冷凍干燥機，長沙市恒和科技儀器有限公司；6202 型高速粉碎機，北京燕山正德機械設(shè)備有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI公司；真空泵，南京真空泵廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 柚皮苷的提取及純化

參考孫勝亮[17]的方法并稍作修改，將豐都紅心柚落果切塊后于60 ℃烘箱中干燥24 h，經(jīng)粉碎機粉碎，過60目篩，得落果粗粉。取一定量落果粉于圓底燒瓶中，按液料比20∶1(mL∶g)加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，在70 ℃水浴條件下回流提取1 h，過濾得提取液；過濾后的濾渣再按液料比10∶1(mL∶g)加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，在70 ℃水浴下繼續(xù)回流提取1 h，過濾得第2次提取液。合并2次濾液，50 ℃下真空濃縮至原體積1/10，室溫下冷卻后于4 ℃冰箱靜置24 h，過濾得沉淀，即為柚皮苷粗品。

在柚皮苷粗品中按液料比3∶1(mL∶g)加入無水乙醇，充分溶解后過濾，濾液于4 ℃放置24 h，過濾得結(jié)晶物；結(jié)晶物中按液料比2∶1(mL∶g)加入蒸餾水，70 ℃水浴充分溶解30 min，趁熱過濾，濾液放冷后于4 ℃靜置24 h，過濾，結(jié)晶物冷凍干燥得柚皮苷純品。取適量柚皮苷純品溶解于甲醇中，測得其純度為88.23%。

1.3.2 柚皮苷和柚皮素含量測定方法的建立

1.3.2.1 色譜條件

Venusil MP C18色譜柱(4. 6 mm×250 mm，5μm)；柱溫30 ℃；檢測波長：283 nm；檢測器：紫外檢測器；流動相;1% 冰乙酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～25 min，38% B; 25～55 min，38%～45% B; 55～60 min，45%～38% B)；進樣量：20 μL；流速：1 mL/min。

1.3.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品柚皮素5.00 mg于10 mL容量瓶中，對照品柚皮苷1.00 mg于100 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解并定容至刻度，配制得質(zhì)量濃度分別為500 mg/L和10 mg/L的對照品溶液。

1.3.2.3 供試品溶液的制備

取1.0 g柚皮苷純品于100 mL圓底燒瓶中，加入25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%的HCl，110 ℃油浴條件下攪拌(200 r/min)回流酸解1.5 h。酸解液冷卻至室溫，用2 mol/L NaOH將其pH調(diào)至7，將液體轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度線，稀釋40倍，在1.3.2.1的方法進行含量測定。

1.3.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別準(zhǔn)確吸取柚皮素和柚皮苷對照品溶液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mL；0.4、1.0、1.6、2.2、2.8 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，使其質(zhì)量濃度分別為10、30、50、70、90 mg/L；0.4、1.0、1.6、2.2、2.8 mg/L。以對照品質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得到回歸方程。

1.3.2.5 精密度試驗

分別取柚皮素和柚皮苷對照品溶液1 mL，按1.3.2.1色譜條件進樣分析，重復(fù)進樣6次，記錄柚皮素和柚皮苷峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.2.6 重復(fù)性試驗

分別精密稱取柚皮苷純品6份，按1.3.2.3的方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄柚皮素和柚皮苷峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.2.7 穩(wěn)定性試驗

精密稱取柚皮苷純品1份，按1.3.2.3的方法制備，將供試品溶液在室溫下放置，分別在0、2、4、8、12、24 h時測定，記錄柚皮素和柚皮苷峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.2.8 加樣回收率試驗

取已測含量的酸解液10 mL 9份，每3份中分別準(zhǔn)確加入柚皮苷對照品溶液0.4、0.6、0.8 mL；柚皮素對照品溶液0.4、0.6、0.8 mL，稀釋40倍后進樣，測定柚皮苷和柚皮素的平均回收率。

1.3.3 柚皮素得率及柚皮苷水解率計算

柚皮素及柚皮苷水解率計算如公式(1)和公式(2)。

(1)

式中：ρ,柚皮素的質(zhì)量濃度，mg/L；40,稀釋倍數(shù)；V,容量瓶體積，L；m,柚皮苷純品質(zhì)量，mg；R,柚皮苷純品純度, %。

(2)

式中：A2，反應(yīng)后柚皮苷峰面積，mAU·min；A1，反應(yīng)前柚皮苷峰面積，mAU·min。

1.3.4 單因素試驗

通過單因素試驗對柚皮素制備過程中影響柚皮素得率和柚皮苷水解率的各因素進行分析，確定最佳工藝參數(shù)。

1.3.4.1 酸解溫度的影響

取5份1.0 g柚皮苷，分別置于100 mL圓底燒瓶中，并分別加入20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%的HCl，酸解時間為1 h，研究酸解溫度分別為90、100、110、120、130 ℃時對柚皮素得率、柚皮苷水解率的影響。

1.3.4.2 酸解時間的影響

取5份1.0 g柚皮苷，分別置于100 mL圓底燒瓶中，并分別加入20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%的HCl，酸解溫度為110 ℃，研究酸解時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h時對柚皮素得率、柚皮苷水解率的影響。

1.3.4.3 HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

取5份1.0 g柚皮苷，分別置于100 mL圓底燒瓶中，并分別加入20 mL不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的HCl，固定酸解時間為1 h，酸解溫度為110 ℃，研究HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%時對柚皮素得率、柚皮苷水解率的影響。

1.3.4.4 液料比的影響

取5份1.0 g柚皮苷，分別置于100 mL圓底燒瓶中，并分別加入不同體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%的HCl，固定酸解時間為1 h，酸解溫度為110 ℃，研究液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1(mL∶g)時對柚皮素得率、柚皮苷水解率的影響。

1.3.5 正交試驗優(yōu)化酸解制備柚皮素工藝參數(shù)

通過單因素試驗，選擇酸解溫度、酸解時間、HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、液料比4個因素作為優(yōu)化的單因素，以柚皮素得率為指標(biāo)，進行4因素3水平正交試驗設(shè)計，優(yōu)化柚皮素的制備工藝。用SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，確定最佳工藝參數(shù)。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2016進行數(shù)據(jù)處理和表的繪制，使用Origin 2018軟件制圖，采用SPSS 17.0軟件進行多因素方差分析(Duncan法，P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

實驗得到的柚皮素和柚皮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為Y=0.906 5X-3.716 8，R2=0.999 2；Y=0.565 3X-0.0118,R2=0.999 7,由此可知柚皮素和柚皮苷分別在10～90 mg/L、0.4～2.8 mg/L有良好的線性關(guān)系，可做為含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗

對照品溶液進樣6次，柚皮素和柚皮苷峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.81%和1.12%，表明本測定方法具有較好的精密度。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗

放置不同時間測得柚皮素和柚皮苷峰面積RSD分別為0.94%和0.87%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3 重復(fù)性試驗

重復(fù)制備并測定供試品溶液6次，柚皮素和柚皮苷含量RSD分別為1.85%和2.13%，表明本方法重現(xiàn)性好。

2.2.4 加標(biāo)回收率試驗

如表2所示，經(jīng)加入不同體積對照品溶液，測得柚皮素和柚皮苷平均回收率分別為99.63%(RSD為1.05%)和98.87%(RSD為1.21%)。

表2 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 2 Results of recovery test

2.3 酸解前后樣品的HLPC圖

由圖1、圖2比較可見，最優(yōu)條件下反應(yīng)后，酸解液中柚皮苷(峰1)含量極低，僅為最初含量的0.69%，這表明在此條件下原料得到充分利用，水解效率高。圖2中峰2保留時間與圖3柚皮素標(biāo)品峰保留時間基本相同，可以初步判斷其即為柚皮素。

圖1 樣品酸解前高效液相色譜圖Fig.1 HPLC diagram of the sample before acidic hydrolysis

圖2 樣品酸解后高效液相色譜圖Fig.2 HPLC diagram of the sample after acidic hydrolysis

圖3 柚皮素標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.3 HPLC diagram of naringenin standard

2.4 單因素實驗結(jié)果

2.4.1 酸解溫度的選擇

由圖4可知，隨著溫度的升高，柚皮素得率和柚皮苷水解率也逐漸升高。當(dāng)溫度從100 ℃升至110 ℃時，柚皮素得率的升高程度明顯大于柚皮苷水解率，這說明溫度的升高不僅增加了柚皮苷水解的質(zhì)量，還大大提高了柚皮苷的水解程度。當(dāng)溫度達到110 ℃時柚皮素得率最高，溫度繼續(xù)上升時，柚皮素得率開始逐漸下降，柚皮苷水解率變化較為平緩，因此選擇110 ℃較為適宜。

圖4 酸解溫度對柚皮苷水解率及柚皮素得率的影響Fig.4 Effect of temperature on the yield of naringeninand hydrolysis percent of naringin

2.4.2 酸解時間的選擇

如圖5所示，酸解時間對柚皮苷水解率和柚皮素得率有一定影響。當(dāng)酸解時間為1.5 h時柚皮素得率和柚皮苷水解率均達到最大值，分別為99.16%和40.58%。繼續(xù)延長反應(yīng)時間時，柚皮苷水解率幾乎保持不變而柚皮素得率開始下降，這可能是由于時間的延長柚皮素被破壞所致[18]。但因1.0 h時兩指標(biāo)與1.5 h時相差并不大，考慮到時間成本，酸解時間選擇1.0 h較為適宜。

圖5 酸解時間對柚皮苷水解率及柚皮素得率的影響Fig.5 Effect of time on the yield of naringenin andhydrolysis percent of naringin

2.4.3 HCl濃度的選擇

由圖6可知，當(dāng)HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于2.5%時，柚皮苷的水解數(shù)量和程度均不高，這可能與缺少反應(yīng)底物有關(guān)[19]。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)到達3.5%時，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，柚皮素和柚皮苷含量的變化并不明顯，說明此時反應(yīng)物充足。故選擇3.5%為最佳HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖6 HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對柚皮苷水解率及柚皮素得率的影響Fig.6 Effect of concentration of hydrochloric acid onthe yield of naringenin and hydrolysis percent of naringin

2.4.4 液料比的選擇

由圖7可以看出，液料比對柚皮素得率和柚皮苷水解率有較大影響。酸解過程中隨著稀HCl體積的增加,柚皮素得率和柚皮苷水解率逐漸增高。當(dāng)液料比為20∶1(mL∶g)時，柚皮素得率達到最大值，為41.02%，但若繼續(xù)增加液料比,柚皮素得率有所下降，同時柚皮苷水解率升高緩慢。因此本實驗選用最佳液料比為20∶1(mL∶g)。

2.5 正交實驗優(yōu)化酸解制備柚皮素工藝的結(jié)果

由酸解制備柚皮素優(yōu)化正交試驗極差分析結(jié)果可知，對柚皮素得率的影響大小依次為：酸解溫度>酸解時間>HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)>液料比，優(yōu)化的最佳酸解條件為A1B2C2D2，即在酸解溫度為110 ℃、酸解時間為1.5 h、HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%、液料比為25∶1(mL∶g)時柚皮素得率最高，為42.39%，此時柚皮苷水解率為99.31%。由表中方差分析可知，對柚皮素得率的影響大小為酸解溫度、酸解時間、液料比對柚皮素得率影響極顯著，而HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對柚皮素得率有顯著影響(表3、表4)。

圖7 液料比對柚皮苷水解率及柚皮素得率的影響Fig.7 Effect of liquid-solid ratio on the yield ofnaringenin and hydrolysis percent of naringin

表3 正交試驗結(jié)果Table 3 Result of orthogonal test

表5 正交實驗方差分析表Table 5 Variance analysis of orthogonal test

注：*為差異顯著，P<0.05;**為差異極顯著，P<0.01。

3 討論

在天然活性物質(zhì)的利用過程中，往往將其中的低效成分轉(zhuǎn)化為高效成分[20]。目前，將柚皮苷轉(zhuǎn)化為柚皮素的方法主要包括酸水解法和酶水解法。酶水解法的反應(yīng)條件較為溫和，可以較好地保持產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。由于酶對化學(xué)鍵的專一性強，酶水解法能夠達到較高的水解率和產(chǎn)物得率。但在酶的作用溫度下(<60℃)柚皮苷的溶解度較低，酶解速率慢，導(dǎo)致較長的反應(yīng)時間(24～48 h)[21]。崔莉等[22]通過在酶解液中添加聚山梨酯80，將柚皮苷的溶解度提高了21倍，反應(yīng)時間縮短到了12 h，大大提高了酶解法的效率。與酶解法相比，酸水解法工藝簡單，時間短，成本低，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。伍毅[23]在70℃下，HCl的80%甲醇溶液中將銀杏黃酮水解4 h制備其苷元，在此條件下黃酮水解率為93.8%。本實驗在達到更高水解率的前提下，水解時間更短，原因可能是在更高的溫度下，分子運動加快，有利于水解反應(yīng)進行[24]。目前國內(nèi)外關(guān)于柚皮素的酸水解制備方法的研究非常有限，以各種酶催化水解制備的研究較多，這可能與HCl和H2SO4等無機酸屬于高危險管制藥品有關(guān)，因此使用蘋果酸、酒石酸等食品級有機酸作為替代品可能會成為今后發(fā)展的方向。

落果是樹體生長過程中的正常生理現(xiàn)象，果實之間的養(yǎng)分競爭易導(dǎo)致落果現(xiàn)象發(fā)生，農(nóng)民也常通過疏果來提高果實品質(zhì)、避免果實遭受病蟲害[25]。早期落地幼果果皮中黃酮含量遠(yuǎn)高于成熟果，其中柚皮苷的含量大于總黃酮含量的70%[26]。然而處理大量落果的方式通常為深埋或堆積漚肥，這不僅造成巨大的資源浪費，同時導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染。因此，以田間廢棄物豐都紅心柚落果為原料提取柚皮苷、制備柚皮素具有較高的實際應(yīng)用價值，同時為柚皮苷、柚皮素工業(yè)化量產(chǎn)的原料來源提供思路。

4 結(jié)論

本試驗研究了不同因素對柚皮素得率及柚皮苷水解率的影響，并以柚皮素得率為指標(biāo)，選取酸解溫度、酸解時間、HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、液料比進行工藝優(yōu)化，得出對柚皮素得率的影響大小為：酸解溫度>酸解時間>HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)>液料比，優(yōu)化的工藝條件為:酸解溫度110 ℃、酸解時間1.5 h、HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%、液料比為25∶1(mL∶g)，柚皮素得率為42.39%，柚皮苷水解率為99.31%。在此條件下，原料得到充分利用、殘余量較低，柚皮素的得率高。該方法操作簡便、酸用量少，較為經(jīng)濟環(huán)保，以期對柚皮素低成本產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。