范佳瑩，李則靈，朱霞建，談安群，易鑫，周琦，譚祥，黃林華，王華

(西南大學(xué)柑桔研究所，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶，400712)

纖維素是自然界中含量豐富的天然聚合物。在分子水平上，不同來源的纖維素都是相同的，即通過β-1,4糖苷鍵連接在一起的D-葡萄糖單元的無支鏈聚合物，但是纖維素在其晶體結(jié)構(gòu)方面不一定相同[1]。純纖維素晶型具有幾種不同的排列結(jié)構(gòu)，分別為纖維素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型。其中，只有纖維素Ⅰ型是天然存在的，其他(Ⅱ型，Ⅲ型和Ⅳ型)均可由Ⅰ型通過化學(xué)處理制備[2]。納米纖維素(nano-crystal cellulose, NCC)是一種重量輕、密度低(約1.6 g/cm3)、強度性能優(yōu)異的可生物降解納米纖維[3]，其表面具有豐富的羥基官能團[4]，相較于微晶纖維素(microcrystalline cellulose，MCC),它具有更高的純度、結(jié)晶度、親水性、可及性、生物相容性和自組裝特性[5]，可以用來制備功能性材料[6]。因此NCC受到化工、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的青睞。制備NCC的方法主要有化學(xué)法(酸水解法等)、物理法(球磨法等)、生物法(酶法等)，以及三者兩兩結(jié)合法等。酸水解法是目前制備納米纖維素最成熟、穩(wěn)定的一種方法，其中硫酸水解法不僅能較好地分離納米纖維素，而且能使納米纖維素表面的羥基與硫酸根離子發(fā)生酯化反應(yīng)，形成分散穩(wěn)定的膠體體系[7-8]。雖然各類型纖維素的化學(xué)成分相似，但由于來源和提取方法的不同，它們在形貌、粒度、結(jié)晶度和某些性質(zhì)上有所不同[9]。因此本文旨在探究以柚皮為原料制備的納米纖維素的形態(tài)特征，為柚皮的深度開發(fā)提供新途徑。

豐都紅心柚風(fēng)味獨特，具有入口化渣、酸甜可口和果皮較厚等特點。其果皮中含有豐富的纖維素[10]、果膠[11]和以柚皮苷為主的黃酮類物質(zhì)[12]，其中果膠、黃酮類物質(zhì)的提取及利用方面的研究報道較多，而在柚皮纖維素的提取與利用方面的研究報道并不多見[13-14]。為避免生產(chǎn)加工過程中因皮渣丟棄造成的環(huán)境污染、經(jīng)濟損失和資源浪費，提高柚子副產(chǎn)物的綜合利用，本文在制備出柚皮MCC的基礎(chǔ)上，采用硫酸水解法進行柚皮NCC的制備，以單因素試驗和響應(yīng)面分析法優(yōu)化制備條件，并對制備出的NCC進行形態(tài)表征與結(jié)構(gòu)分析,以期在開發(fā)柚皮纖維素新用途的同時，為處于研究熱點的納米纖維素提供新的植物來源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豐都紅心柚，采購于重慶市豐都縣三元鎮(zhèn)。

NaOH，成都市科隆化學(xué)品有限公司；H2SO4、HCl、H2O2、無水乙醇，重慶川東化工有限公司；以上均試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

6202型高速粉碎機，北京燕山正德機械設(shè)備有限公司；HW.SY11-KP2型智能恒溫水浴鍋，北京市長風(fēng)儀器儀表公司；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；GZX-9240 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；TGL-20M臺式高速冷凍離心機，長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司；LGJ-10型真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；Nicolet/is5010400型傅里葉變換紅外光譜儀，重慶佳佰能儀器有限公司；X'Pert3 Powder10300型X射線衍射儀，荷蘭帕納特儀器有限公司；SU8020型場發(fā)射掃描電鏡，日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 柚皮纖維素的提取及柚皮微晶纖維素的制備

參考曾小峰等[15-16]優(yōu)化的超聲波輔助化學(xué)法進行柚皮纖維素的提取與微晶纖維素的制備。

將粉碎后的柚皮粉以1∶20(g∶mL)的料液比與0.1 mol/L的HCl混合，85℃水浴2 h后抽濾，取濾渣用蒸餾水洗至中性后于60℃下烘干。將除去果膠的柚皮粉以1∶20的料液比與94 g/L的NaOH溶液混合，在超聲功率200 W、溫度84℃下超聲77 min，抽濾并取濾渣，蒸餾水洗滌3次后，按1∶20的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為8%的H2O2溶液，使用NaOH調(diào)溶液pH至11左右，于30℃下反應(yīng)30 min，蒸餾水洗滌濾渣至中性，用乙醇(體積分?jǐn)?shù)為95%)洗脫色素等雜質(zhì)，60℃烘干，得到柚皮纖維素。

將柚皮纖維素以1∶20的料液比置于體積分?jǐn)?shù)為8 %的HCl中60℃下酸解80 min后過濾，蒸餾水將濾渣洗至中性，60℃烘干，即得柚皮微晶纖維素。

1.3.2 柚皮納米纖維素的制備

將柚皮MCC與一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的H2SO4以1∶10(g∶mL)的比例混合，在一定溫度下反應(yīng)一定時間，升溫過程不超過5 min，反應(yīng)期間不斷攪拌。到達反應(yīng)時間后立即用10倍蒸餾水終止反應(yīng)，即得NCC懸浮液。用等量蒸餾水在8 000 r/min，10 min的條件下離心洗滌4～5次，即得下層乳白色的NCC懸浮液。將其置于透析袋中透析至pH不再變化。對透析后的懸浮液進行超聲分散20 min，通過冷凍干燥得到NCC固體粉末[17]。

1.3.3 納米纖維素得率的測定

測量柚皮納米纖維素膠體的總體積，移取20 mL懸浮液置于稱量瓶中，60℃烘至恒重，將其放入干燥器中冷卻30 min后稱重[18],納米纖維素得率計算如公式(1)：

(1)

式中：m，原料的質(zhì)量，g；m1，稱量瓶與烘干后樣品的總質(zhì)量，g；m2，稱量瓶的質(zhì)量，g；V1，納米纖維素膠體的總體積，mL；V2，移取的體積，mL。

1.3.4 NCC單因素試驗設(shè)計

以柚皮納米纖維素的得率作為評價指標(biāo)，按照1.3.2中的制備工藝，依據(jù)表1列出的因素條件進行單因素試驗分析。在進行單因素試驗中，除選擇的因素外，其余因素均選用水平3的條件進行試驗。

表1 單因素水平設(shè)計表Table 1 Levels design of single factor experiment

1.3.5 響應(yīng)面試驗優(yōu)化制備條件

基于單因素試驗結(jié)果，選取對試驗結(jié)果影響較大的H2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間3個因素作為自變量，采用Box-Behnken設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面試驗，因素與水平設(shè)計如表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 2 Factors and levels used in response surface experiments

1.3.6 場發(fā)射掃描電鏡分析(SEM)

將超聲分散后的納米纖維素懸浮液滴在硅片上自然干燥后，將樣品進行噴金處理后放在場發(fā)射掃描電子顯微鏡下，觀察柚皮納米纖維素的大小和形態(tài)。

1.3.7 傅立葉紅外光譜分析(FT-IR)

以1∶200(g∶g)將樣品與KBr混合壓片，將壓片的樣品放在紅外光譜儀上進行4 000～400 cm-1檢測。

1.3.8 結(jié)晶度分析(XRD)

將樣品粉末放入X射線衍射儀的衍射槽內(nèi)進行掃描范圍2θ=5～40°，步長0.02°，掃描速率2°/min的測試。采用經(jīng)驗公式-Segal公式(2)計算樣品的相對結(jié)晶度(crystallinity index, CI)[19]：

(2)

式中:I002，002面(2θ=22.18°) 晶格衍射峰強度；Iam，纖維素?zé)o定形區(qū)衍射峰強度(2θ=18°)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果分析

2.1.1 H2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對NCC得率的影響

由圖1可知，NCC得率隨H2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)含量的逐漸增加，呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為62%時，得率最高為57.40%。當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為58%、60%時，得率不高的原因可能是H2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的降低不足以在特定的時間內(nèi)水解無定形區(qū)，從而導(dǎo)致水解不充分；同時，由于纖維素在濃酸中存在溶脹反應(yīng)[20]，在酸含量較低的情況下，纖維素不能充分進行溶脹反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物粒徑過大達不到納米級尺寸，影響了得率。當(dāng)H2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為62%時，酸濃度較適宜，纖維素水解反應(yīng)充分，溶脹率高，產(chǎn)物粒徑小，得率最高。隨著酸含量的繼續(xù)增大，試驗發(fā)現(xiàn)反應(yīng)制得的纖維素懸浮液不再呈現(xiàn)乳白色，而是趨近黃色，這可能是由于H2SO4含量過大，將纖維素的糖苷鍵水解成葡萄糖[21]，進而呈現(xiàn)黃色半透明溶液，得率下降。當(dāng)H2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到70%時，纖維素呈現(xiàn)焦黑色，無法制備出納米纖維素。

圖1 硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對NCC得率的影響Fig.1 Effects of sulfuric acid mass fraction onthe yield of nanocellulose from pomelo’s mesocarp注：不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)。下同。

2.1.2 反應(yīng)溫度對NCC得率的影響

由圖2可知，當(dāng)溫度為40℃時，NCC得率很低，僅有7.44%，說明溫度過低，不足以使纖維素水解完全，水解產(chǎn)物粒徑過大，導(dǎo)致得率很低。隨著反應(yīng)溫度的逐漸升高，酸催化劑中的質(zhì)子運動愈發(fā)活躍，其與纖維素中糖苷鍵的反應(yīng)速率加快[22]，酸解反應(yīng)進行的更加充分，NCC得率逐漸提高。當(dāng)溫度達到50℃時，得率達到最高值60.49%，隨后開始下降，可能是由于溫度過高，纖維素分解速率過快，在相同的時間內(nèi)，反應(yīng)生成的納米纖維素也被部分水解成了糖類物質(zhì)，導(dǎo)致得率減少。

圖2 反應(yīng)溫度對NCC得率的影響Fig.2 Effects of reaction temperature on theyield of nanocellulose from pomelo’s mesocarp

2.1.3 反應(yīng)時間對NCC得率的影響

由圖3可知，隨著反應(yīng)時間的增加，得率呈現(xiàn)出先增大后迅速減小的趨勢，當(dāng)反應(yīng)時間為75 min時，得率達到最大值64.39%，出現(xiàn)這種變化趨勢的原因是時間過短，不足以使酸與糖苷鍵充分作用，酸解不完全，得率較低；隨著時間的不斷延長，酸繼續(xù)與纖維素作用生成葡萄糖等糖類物質(zhì)，水解過度，懸浮液開始變黃，產(chǎn)率下降。

圖3 反應(yīng)時間對NCC得率的影響Fig.3 Effects of reaction time on the yield ofnanocellulose from pomelo’s mesocarp

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計方案與實驗結(jié)果

以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，選取H2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間3個因素，以NCC得率為指標(biāo)，采用Design-Expert8.0.6軟件進行3因素3水平的響應(yīng)面試驗設(shè)計與分析。試驗設(shè)計及結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Box-Behnken design with experimental results

2.2.2 模型的建立與顯著性檢驗

表4 回歸模型方差分析表Table 4 Analysis of variances for the developed regression equation

注：*,P< 0.05，差異顯著；**,P< 0.01，差異極顯著。

2.2.3 響應(yīng)面分析與尋優(yōu)

根據(jù)回歸方程，得到各因素交互作用對NCC得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖(圖4)。由圖4-a中等高線圖可以看出，等高線呈微橢圓形，說明A(H2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù))、B(反應(yīng)溫度)兩因素存在交互作用且對得率的影響較顯著(P< 0.05)；由3D曲面圖可看出，當(dāng)反應(yīng)時間不變時，隨著H2SO4含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的增大和反應(yīng)溫度的升高，納米纖維素得率均呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢，曲面在H2SO4含量的-0.50～0.50水平和反應(yīng)溫度的-0.50～0.00水平出現(xiàn)極值，即為最大值。由圖4-b中曲面圖可以看出，當(dāng)固定反應(yīng)溫度時，NCC得率隨著H2SO4含量的增大呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，而隨著反應(yīng)時間的延長，NCC得率呈現(xiàn)先逐漸上升而后略微下降的趨勢，圖中可明顯看出H2SO4含量變化曲面較反應(yīng)時間更陡，說明H2SO4含量對NCC得率的影響比反應(yīng)時間對其的影響更為顯著；等高線圖中發(fā)現(xiàn)等高線呈現(xiàn)橢圓形，說明A(H2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù))、C(反應(yīng)時間)兩因素的交互作用對得率影響顯著(P<0.01)，這與方差分析的結(jié)果一致。圖4-c中曲線圖呈現(xiàn)出當(dāng)H2SO4含量一定時，NCC得率受反應(yīng)溫度的影響較反應(yīng)時間更顯著，在反應(yīng)溫度的-0.50～0.50水平和反應(yīng)時間的-1.00～0.00水平，曲面出現(xiàn)最高點，即為得率最高的反應(yīng)時間、溫度條件；等高線圖顯示B(反應(yīng)溫度)、C(反應(yīng)時間)兩因素交互作用明顯且對得率結(jié)果影響顯著(P<0.01)。

圖4 各因素交互作用對納米纖維素得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots showing theeffect of various factors on nanocellulose yield

2.2.4 驗證試驗

通過響應(yīng)面回歸方程計算與分析預(yù)測出的最優(yōu)制備條件為：H2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)62.11%，反應(yīng)溫度50.42℃，反應(yīng)時間78.31 min，此條件下計算出的最高NCC得率為63.86%?？紤]到實際操作情況，將條件調(diào)整為H2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)62%，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時間78 min。為驗證該模型的可靠性，采用最優(yōu)條件進行驗證試驗，得NCC得率為63.27%，與理論值接近，說明分析結(jié)果可靠，可以較好地預(yù)測實際值。

2.3 SEM分析結(jié)果

圖5為2種不同放大倍數(shù)下的柚皮納米纖維素場發(fā)射掃描電鏡圖。由圖5可以看出柚皮NCC呈類球狀，粒徑在100～200 nm，大小一致且分布均勻，部分粒子之間存在團聚的現(xiàn)象，這是由于NCC表面具有大量的羥基，經(jīng)水解處理后，纖維素尺寸變小，比表面積增大，其表面的羥基更易相互結(jié)合形成氫鍵[23]，從而產(chǎn)生團聚的現(xiàn)象。與之前研究制備出的MCC[15]相比，硫酸水解反應(yīng)使MCC原本不規(guī)則且表面粗糙的結(jié)構(gòu)減小為納米級且大小均勻的類球狀結(jié)構(gòu)，比表面積進一步增大，使MCC的物化性能進一步提高。

a-柚皮納米纖維素1萬倍電鏡放大圖；b-柚皮納米纖維素10萬倍電鏡放大圖圖5 柚皮納米纖維素的場發(fā)射掃描電鏡圖Fig.5 SEM of NCC from pomelo’s mesocarp

2.4 紅外光譜分析結(jié)果

圖6 紅心柚皮微晶纖維素與納米纖維素的紅外光譜圖Fig.6 FTIR spectra of MCC and NCC from pomelo’smesocarp

2.5 X射線衍射分析

圖7為紅心柚皮微晶纖維素(MCC)與納米纖維素(NCC)的XRD圖，由圖7可以看出，MCC與NCC的衍射峰位置基本一致，均在衍射角2θ為15.08°、22.18°、34.62°處出現(xiàn)衍射峰，說明樣品晶型沒有發(fā)生改變，同時根據(jù)衍射峰存在的位置表明樣品的結(jié)晶類型屬于典型的纖維素Ⅰ型[28]，說明酸解反應(yīng)沒有改變纖維素的結(jié)構(gòu)，這與FTIR的結(jié)果一致。由Segal公式計算得出MCC與NCC的結(jié)晶度分別為44.72%和53.75%，NCC的結(jié)晶度增大，說明酸水解過程主要發(fā)生在MCC的無定形區(qū)，而結(jié)構(gòu)致密的結(jié)晶區(qū)沒有受到較大程度的破壞，所以結(jié)晶區(qū)域的相對百分比增加，結(jié)晶度上升。

圖7 紅心柚皮微晶纖維素與納米纖維素的XRD圖Fig.7 XRD analysis of MCC and NCC in mesocarpof pomelo

3 結(jié)論

通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗分析，在料液比1∶10的條件下，篩選出制備柚皮納米纖維素的最優(yōu)條件：H2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)62%，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時間78 min，此條件下預(yù)測出的得率為63.86%，通過驗證試驗得到此條件下實際得率為63.27%，與預(yù)測值接近，說明建立的回歸模型良好可靠。由于單因素實驗中，反應(yīng)時間為60 min與75 min時的得率無顯著性差異，考慮到實際生產(chǎn)的成本問題，可將反應(yīng)時間縮短至60 min，以作為工業(yè)化生產(chǎn)的最適條件。由掃描電鏡結(jié)果得出，由MCC制備出的NCC粒徑減小至納米級(100～200 nm)，呈類球狀，大小分布均勻。紅外光譜和X射線衍射結(jié)果表明，制備出的NCC結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變，仍保持纖維素I型結(jié)構(gòu)，結(jié)晶度53.75%，相較于MCC有明顯提高。綜上所述，在沒有破壞纖維素結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，制備出的NCC比原料MCC具有更規(guī)則的結(jié)構(gòu)、更大的比表面積和更高的結(jié)晶度，使柚皮纖維素具有更高的應(yīng)用價值。同時NCC作為一種可生物降解的環(huán)保型材料，在食品包裝、增強復(fù)合材料、構(gòu)建藥物載運體系等方面有巨大的潛力。較高的得率和穩(wěn)定的晶型說明柚皮可以作為制備納米纖維素的良好來源，這不僅提高了柚皮的綜合利用，拓寬了柚皮纖維素的用途，也為納米纖維素的生產(chǎn)提供了新的來源。