李露園，王升帆，朱有貴，章銀軍，汪釗，鄭建永*

1(浙江工業(yè)大學 生物工程學院，浙江 杭州，310032)2(浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，浙江 紹興，312500)

膠原蛋白是一種重要的功能性多糖蛋白質，與細胞再生分化等有密切關系[1]。膠原蛋白肽是膠原蛋白的降解產物，由3～20個氨基酸組成[2]，具有抗菌、抗氧化、降血壓血脂、調節(jié)免疫等作用[3-5]。與膠原蛋白相比，膠原蛋白肽分子質量小、水溶性強、易消化吸收。因其顯著的生理活性，廣泛應用于食品，醫(yī)藥，化妝品等領域。與哺乳動物相比，魚類膠原蛋白在來源的廣泛性、生物安全性和產品成本等方面均具有更大的優(yōu)勢。目前國內外研究者已成功從魚皮[6]、魚骨[7]、魚鱗[8]等副產物中制備膠原蛋白肽。

中國是世界上鱘魚種類較多的國家，產量占世界總產量的80%以上[9]。鱘魚目前主要用于魚子醬的生產，在生產加工過程中魚皮、魚鱗和內臟等副產物利用率低，造成了嚴重的資源浪費和環(huán)境污染問題[10]。因此利用酶法將鱘魚皮膠原蛋白轉化為生物活性肽具有重要的經濟價值和社會意義。本文采用堿性蛋白酶水解鱘魚皮，通過單因素及正交試驗優(yōu)化鱘魚皮制備膠原蛋白肽的制備工藝，并對其抗氧化活性進行了研究，旨在為鱘魚皮的高值化加工利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西伯利亞鱘魚皮，由浙江新昌來益生態(tài)農業(yè)發(fā)展有限公司提供，除去魚肉及非膠原組織后剪成約 2 cm×2 cm的塊狀，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?；堿性蛋白酶(1.69×105U/g)，丹麥諾維信公司；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

AE323型電子分析天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；DK8S型消化爐、UDK152型定氮儀，意大利VELP公司； DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱，杭州藍天化驗儀器廠；SX2-4-10型馬沸爐，江蘇駿輝電器源頭廠；索氏抽提器，上海壘固儀器有限公司；Ultrospec 2100 pro型紫外分光光度計，美國GE公司；SYKAM S-433D型全自動氨基酸分析儀，德國Sykam公司；Waters 1525型液相色譜儀，美國Waters公司；Zenix-c SEC-80型色譜柱，蘇州賽分科技有限公司；10000/5000/1000 Da超濾膜，美國密理博公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 基本成分分析

采用直接干燥法[12]測定水分含量；采用凱氏定氮法[13]測定粗蛋白含量,氮換算系數為6.25; 采用羥脯氨酸測定法[14]測定膠原蛋白含量，膠原蛋白與羥脯氨酸的轉化系數為14.113; 采用索氏抽提法[15]測定粗脂肪含量;采用高溫馬沸爐灼燒法[16]測定灰分含量。采用石油醚回流提取法除去魚皮中的脂肪，于70℃下揮發(fā)除去石油醚。取0.2 g試樣于水解管中，向其中加入12 mL 6 mol/L的HCl擰緊水解管螺絲蓋，放入110℃烘箱中水解24 h。取出待其冷卻至室溫，將水解液經濾紙過濾至50 mL容量瓶中，用水進行多次潤洗水解管一并過濾至容量瓶中，最后定容、混勻，水解液分析前稀釋5～10倍。經氨基酸分析儀進行魚皮中蛋白質的氨基酸組成分析。

1.3.2 鱘魚皮預處理

將魚皮經絞肉機攪碎,自來水清洗，紗布過濾洗去游離的脂肪。采用英國丹尼悅公司DENIE-DEG NL-L脂肪酶對鱘魚皮進行脫脂處理，脂肪酶添加量為0.05%(質量分數)，在pH 8，溫度35℃，攪拌速度200 r/min的條件下處理3 h。利用1 mol/L NaCl溶液，在料液比1∶5(g∶mL)，低溫條件下攪拌12 h，以去除鱘魚皮中雜蛋白。

1.3.3 酶解工藝研究

1.3.3.1 單因素試驗

以水解度(degree of hydrolysis，DH)為指標進行單因素試驗，分別研究料液比(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7)(g∶mL)、酶解溫度(40、45、50、55、60℃)、pH(7、8、9、10、11)、反應時間(1、2、3、4、5、6 h)、酶添加量(質量分數1%、2%、3%、4%、5%)對水解度的影響。

1.3.3.2 正交試驗

在單因素的基礎上，選擇對水解度影響較強的4個因素(溫度、pH、反應時間、酶添加量)進行正交試驗。

1.3.4 鱘魚皮膠原蛋白肽分子質量分析

基于多肽分子質量與自身的體積具有正相關性，利用高效凝膠排阻色譜法對酶解制備的多肽進行凝膠排阻分離測定其分子質量分布情況。色譜條件如下，凝膠色譜柱：Zenix-c SEC-80(7.8 mm×300 mm)，流動相：V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=40∶60∶0.05；進樣量：10 μL；檢測波長：220 nm。

標準品分別為抑肽酶(6 512 Da)、VB12(1 355 Da)、醋酸血管緊張素(1 091 Da)、谷胱甘肽(307 Da)、甲硫氨酸(149 Da)。在液相色譜條件相同的條件下，以相對分子質量對數對色譜保留時間作線性回歸曲線，并對該曲線進行校正計算出線性回歸方程。將樣品的色譜數據代入校正后的線性回歸方程計算出樣品中多肽的分子質量大小及分布情況。

1.3.5 超濾分離

酶解液通過截留分子質量分別10 000、5 000、1 000 Da的超濾膜進行超濾分離?？刂莆锪线M口壓力<0.4 MPa,收集各截留組分，分別命名為酶解分子質量組分(分子質量>10 000 Da) SSCP-I、(分子質量=5 000～10 000 Da) SSCP-II、(分子質量=1～5 000 Da) SSCP-III、(分子質量<1 000 Da) SSCP-Ⅳ，將4個不同分子質量的組分進行冷凍干燥制備。

1.3.6 抗氧化活性研究

1.3.6.1 超氧陰離子自由基清除試驗

將上述4個組分的鱘魚皮膠原蛋白肽凍干粉分別配制成質量濃度為1、3、5、10、15、20、25 g/L的溶液。采用鄰苯三酚法[17]，取上述樣品溶液0.1 mL(對照組用水代替)置于2.0 mL的EP管中,加入1.3 mL的50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.20)振蕩混合，于 25℃水浴保溫 10 min；加入0.1 mL已預熱10 min的3 mmol/L鄰苯三酚溶液(鄰苯三酚用10 mmmol/L HCl配制)快速搖勻后于320 nm處每隔30 s測定1次OD值，總時間為3 min，每個試驗重復3次。超氧陰離子自由基清除率計算如公式(1):

(1)

式中：S，超氧陰離子自由基清除率；V0，對照組鄰苯三酚自氧化速率；V1，樣品組鄰苯三酚自氧化速率。

1.3.6.2 DPPH自由基的清除試驗

將4個組分的鱘魚皮膠原蛋白肽凍干粉用體積分數為50%的乙醇分別配制成質量濃度為1、3、5、10、15、20 g/L的樣品溶液。另外用50%的乙醇溶液配制質量濃度為1、3、5、10、15、20、25、30 μg/mL的BHT溶液。按照文獻所述方法進行DPPH自由基清除試驗[18]。試驗結果用清除率CR來表示,如公式(2)：

(2)

式中：A1，樣品組；A0，對照組。

1.3.7 數據分析

數據結果以平均值±標準偏差的形式表示，數據分析采用SPSS 24.0軟件，圖形數據采用Origin Pro 8.5軟件制作。

2 結果與分析

2.1 鱘魚皮的基本成分分析

鱘魚皮的主要組成成分(濕重計)如表1所示。鱘魚皮中水分含量較高，為 56.5%(質量分數)左右。其粗蛋白含量較高，為36.3%(質量分數)左右。膠原蛋白含量高達29.4%(質量分數)，占總蛋白含量約81%，因此可以作為膠原蛋白肽的制備原料。而鱘魚皮脂肪含量較高，約為4.2%(質量分數)左右。另外魚皮中含灰分質量分數為3.4%。

表1 鱘魚皮的基本成分Table 1 The basic components of sturgeon skin

鱘魚皮經6 mol/L HCl徹底水解后，產物進行氨基酸分析儀分析，結果如表2所示。由表2可知，鱘魚皮蛋白被檢測出19種氨基酸，其中含量最多的氨基酸按順序依次為Gly、Ala、Pro，而Gly含量最高為34.0%(質量分數)，占膠原蛋白含量約1/3。這完全符合膠原蛋白Gly-x-y的結構組成特點[19]。

表2 鱘魚皮蛋白氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of sturgeon skin protein

注：Asx表示天冬酰胺(Asu)、天冬氨酸(Asn)；Glx表示谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)。

從氨基酸種類分析，由表3可知，鱘魚皮蛋白中疏水氨基酸含量較高，約31.7%(質量分數)，CHEN等[20]與MENDIS等[21]研究表明疏水性氨基酸對抗氧化活性起著重要作用。此外，魚皮中8種必須氨基酸總(質量分數)達15.7%，這可為人體提供豐富的營養(yǎng)，也進一步說明鱘魚皮膠原蛋白具有較高的開發(fā)利用價值。

表3 鱘魚皮氨基酸組成分類Table 3 Classification amino acid composition in sturgeon skin protein

2.2 堿性蛋白酶酶解鱘魚皮制備膠原蛋白肽單因素試驗

在1∶2至1∶7考察料液比對水解度的影響，結果如圖1-a所示。隨著料液比的變化，水解度在18%左右，基本沒有變化。這表明料液比在一定的比例范圍內對水解度的影響不大。圖1-b表明，pH值為 9.0時，水解度最大。這與SUTTIWICHAIPORN等[22]的試驗結果一致，當使用堿性蛋白酶水解鱘魚的pH為9.0時，水解度最大。這可能是由于酶具有最適pH，pH過高或過低都會使蛋白質結構變性，降低酶的活力。如圖1-c所示，隨著反應溫度的升高，水解度呈先上升后下降的趨勢。過高的溫度會引起酶的變性失活，因此最佳反應溫度為55℃。這與MAHMOUDREZA[23]研究結果一致，堿性蛋白酶的最適溫度為55℃。較長的反應時間有利于酶對魚皮起更廣泛的作用。由圖1-d可知，隨著反應時間的延長，水解度越來越高。然而，超過4 h后水解度沒有顯著增加?；谒媒Y果，最佳反應時間為4h。蛋白酶添加量對水解度的影響如圖1-e所示。水解度隨酶添加量的增加呈先升高后降低的趨勢。這可能是由于酶量的增加抑制了底物擴散，反而使反應速率降低。因此，該堿性蛋白酶酶解鱘魚皮的最佳添加量為3%(質量分數)。

2.3 堿性蛋白酶酶解鱘魚皮制備膠原蛋白肽正交試驗

在單因素的基礎上設計正交試驗分析各個因素之間的相互關系，最終確立堿性蛋白酶水解鱘魚皮的最佳酶解條件。由于在單因素試驗中發(fā)現，料液比在一定的比值范圍內使堿性蛋白酶對鱘魚皮的水解程度并沒有產生明顯的影響，所以在設計正交試驗時只考慮酶解pH、溫度、時間、酶添加量這4個因素。以水解度為分析指標，正交試驗的結果如表4所示。由極差R得知，各因素對魚皮水解度的影響程度順序依次為：pH>溫度>酶添加量>時間，所選的因素中pH對水解度的影響較為顯著。由正交試驗得出最佳酶解條件：pH 9，溫度55℃，時間5 h，酶添加量3%。根據正交試驗得到的最佳酶解工藝條件進行驗證試驗，3組平行試驗3次計算出水解度為22.0%。

2.4 鱘魚皮膠原蛋白肽的分子質量分布

酶解反應結束后，進行高效凝膠排阻色譜檢測鱘魚皮膠原蛋白肽分子質分布情況。由圖2可知，在最佳酶解工藝條件下，水解液中多肽的分子質量基本在5 000 Da以下，分子質量分布在500～3 000 Da的多肽含量高，并且分子質量在1 000 Da以下的含量高達67%。研究表明分子質量越小的短肽具有更好的水溶性，易于被人體腸胃吸收并直接利用，分子質量越小的多肽尤其是二肽、三肽等寡肽根據氨基酸組成以及排列順序的不同，具有非常重要的生物活性[24]。

a-料液比對水解度的影響;b-pH對水解度的影響;c-溫度對水解度的影響;d-反應時間對水解度的影響;e-酶添加量對水解度的影響圖1 料液比、pH、溫度、反應時間和酶添加量對水解度的影響Fig.1 Effect of liquid-to-solid ratio, pH, temperature, reaction time and enzyme concentration on the degree of hydrolysis

表4 鱘魚皮膠原蛋白肽制備工藝的L9(34)正交試驗結果Table 4 Result of L9 (34) orthogonal experiment for preparation of collagen polypeptide from sturgeon skin

圖2 鱘魚皮膠原蛋白肽的分子質量分布Fig.2 Molecular weight distribution of collagenpeptide in the skin of sturgeon

2.5 鱘魚皮膠原蛋白肽的抗氧化活性試驗

2.5.1 超氧陰離子自由基清除試驗

超氧陰離子是由人體內線粒體的電子傳遞而產生的人體第一個氧化自由基，過量的超氧陰離子將導致細胞的損傷[25]。本文對超濾分離得到的4種組分在不同濃度下，通過鄰苯三酚自氧化進行超氧陰離子自由基的清除試驗，試驗結果見圖3。

圖3 不同分子質量SSCP對超氧陰離子自由基清除效果Fig.3 Superoxide anion radical scavenging activityof different molecular weight of SSCP

由圖3可知，4種不同分子質量范圍的魚皮膠原蛋白肽都具有一定的超氧陰離子自由基的清除能力，并且隨著各自濃度的升高，清除超氧陰離子的能力也隨之增強，當質量濃度超過20 g/L時，對超氧陰離子自由基的清除能力增強趨勢開始趨緩；通過OriginPro8.5軟件數據擬合4種組分的半抑制濃度(IC50)分別為8.918 g/L(SSCP-Ⅰ)、7.051 g/L(SSCP-Ⅱ)、5.938 g/L(SSCP-Ⅲ)、7.050 g/L (SSCP-Ⅳ)。所以SSCP-Ⅲ(分子質量=1 000～5 000 Da)對超氧陰離子自由基的清除能力最強。這與KIM等[26]對阿拉斯加鱈魚皮明膠酶解液進行超濾膜反應器分離,最終與確定相對分子質量分布在1 500～4 500 Da的多肽具有較高的超氧陰離子自由基清除活性的結論相符合。

2.5.2 DPPH自由基清除試驗

由于DPPH自由基有單電子，在517 nm處有一強吸收，其醇溶液呈紫色。當有自由基清除劑存在時，能與其單電子配對而使其吸收逐漸消失。DPPH醇溶液的褪色程度與自由基清除劑自身提供的電子數量成定量關系。經超濾分離的4種鱘魚皮膠原蛋白肽組分分別在不同濃度下對DPPH自由基的清除效果如圖4所示。

圖4 不同分子質量SSCP對DPPH自由基清除效果Fig.4 DPPH radical scavenging activity of differentmolecular weight of SSCP

由圖4可知，4種不同分子質量的酶解液SSCP對DPPH自由基的清除能力隨著各自濃度的升高而增強。在質量濃度為20 g/L時，4種不同分子質量的SSCP對DPPH的清除能力大小順序為SSCP-Ⅳ(分子質量<1 000 Da)>SSCP-Ⅲ(分子質量=1 000～5 000 Da)>SSCP-Ⅱ(分子質量=5 000～10 000 Da)>SSCP-Ⅰ(分子質量>10 000 Da)。這表明分子質量越小的多肽對DPPH自由基的清除效果越好[27]。此外，由圖5可知，BHT在質量濃度為25 μg/mL時對DPPH自由基的清除率達65.1%，而對DPPH自由基清除活性最佳的SSCP-Ⅳ(分子質量<1 000 Da)在濃度為20 g/L時清除率只有32.8%，明顯低于BHT陽性對照。

圖5 BHT對DPPH自由基清除效果Fig.5 DPPH radical scavenging activity of BHT

3 結論

本研究在單因素試驗的基礎上，利用正交試驗得到堿性蛋白酶酶解鱘魚皮膠原蛋白的最佳酶解工藝：酶解溫度55℃，pH 9，酶添加量3%，酶解時間5 h。對最佳酶解工藝條件進行驗證試驗，該酶解條件下水解度為22.0%。酶解液的不同分子質量組分抗氧化活性研究發(fā)現，SSCP-Ⅲ(分子質量=1 000～5 000 Da)組分對超氧陰離子具有最強的清除能力，半抑制清除濃度IC50為5.938 g/L。本研究為鱘魚皮及其相關資源的加工和高值化利用提供了理論依據，對膠原蛋白肽的抗氧化活性進行初步分析，其抗菌、改善皮膚、增強免疫力和降血壓等生物活性有待進一步研究。