楊文麗，楊波，楊光

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海, 200093)

納豆中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也具有較高的藥用價(jià)值，不僅氨基酸組成與液態(tài)奶類(lèi)似[1]，其中含有的低聚糖和粗多糖對(duì)腫瘤、肝炎、心血管、抗衰老等也有獨(dú)特的生物活性。多糖特殊的生物活性源自于其復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，例如糖醛酸是體現(xiàn)多糖活性的重要部分[2]，也是構(gòu)成肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等高活性物質(zhì)的成分；而硫酸根含量不同的多糖其抗病毒和抗凝活性也有區(qū)別[3]。近年來(lái)關(guān)于納豆的研究主要集中在納豆激酶等蛋白質(zhì)方面，而納豆多糖的抗氧化、改善免疫學(xué)機(jī)制以及提高免疫力的作用雖然已經(jīng)被證實(shí)[4-6]，但其組成成分及分子結(jié)構(gòu)卻尚未被研究。即使多糖具有較高的生理活性及功能作用，若沒(méi)有對(duì)其結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理及毒理作用進(jìn)行探究，便不能被加工利用。本研究對(duì)納豆中提取的納豆多糖的結(jié)構(gòu)類(lèi)型進(jìn)行分析，既可以避免納豆的不良風(fēng)味，還能保留其對(duì)人體有益的功能性成分，旨在為制作保健品或藥品原料的篩選供給多種結(jié)構(gòu)類(lèi)型的化合物，也為植物多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供一定的實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

納豆多糖：本實(shí)驗(yàn)室提取[4]；

NH4HCO3、CuSO4、K2SO4，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；咔唑，上海展云化工有限公司；半乳糖醛酸、三氯乙酸，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；BaCl2、甲醇，宜興市第化學(xué)試劑廠；Sephadex G-75凝膠，上海維塔；KBr(光譜純)，天津天光光學(xué)儀器有限公司；剛果紅,Macklin；HCl、四硼酸鈉、明膠等,均為分析純。

1.2 儀器

WFJ 7200可見(jiàn)分光光度計(jì),優(yōu)尼柯儀器有限公司；KDN-1凱氏定氮儀,上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司；DHG-9203A鼓風(fēng)干燥機(jī),上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Waters 2659高效液相凝膠色譜儀,ThermFisher；LCQDECAXPMAX型質(zhì)譜儀,美國(guó)Thermo Finigan；I3X酶標(biāo)儀,美谷分子儀器有限公司；NICOLET5700紅外光譜儀,美國(guó)熱電公司。

1.3 方法

1.3.1 總糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[7]。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用凱氏定氮法[8]。

1.3.3 糖醛酸含量測(cè)定

參照趙鶴鵬等[9]的方法：

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：分別取質(zhì)量濃度為1×10-4g/L的半乳糖醛酸溶液(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL)加入洗凈并烘干的試管中，補(bǔ)蒸餾水至1 mL。將各試管在冰水浴中加入四硼酸鈉-硫酸溶液(0.717 g四硼酸鈉溶解于150 mL濃H2SO4)5 mL，搖勻，沸水浴10 min，冷卻后加入0.2 mL的0.15%的咔唑溶液，繼續(xù)沸水浴10 min并冷卻，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以半乳糖醛酸濃度為縱坐標(biāo)，吸光度值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定同標(biāo)曲。

最大吸收波長(zhǎng)的確定：以上述不加半乳糖醛酸溶液的試管做空白，并利用加入0.5 mL半乳糖醛酸溶液的試管在340～700 nm進(jìn)行紫外掃描，繪制其吸光度值曲線，其中吸光度值最大者為糖醛酸的最大吸收波長(zhǎng)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[11]：分別取不同體積的K2SO4-HCl溶液于試管中，并補(bǔ)充HCl溶液至200 μL。向各試管中加入3.8 mL 30 g/L的三氯乙酸溶液及1 mL氯化鋇-明膠溶液。搖勻后靜置15～20 min，在360 nm處測(cè)定吸光值。對(duì)照組中為明膠溶液替換為氯化鋇-明膠溶液。以K2SO4質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 納豆多糖的凝膠過(guò)濾層析

通過(guò)改良王龍艷[12]的層析方法，采用Sephadex G-75凝膠層析柱(1.5 cm×90 cm)對(duì)納豆多糖進(jìn)行分離純化。連接蠕動(dòng)泵和收集器，將凝膠進(jìn)行溶脹、裝柱、平衡24 h，以0.2 mol/L NH4HCO3為洗脫液[13]，納豆多糖濃度為10 g/L，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后上樣。洗脫條件為上樣體積5 mL，流速0.3 mL/min，每10 min收集1管。洗脫結(jié)束后，將收集到的多糖溶液進(jìn)行濃縮、透析、凍干可得純品納豆多糖。

1.3.6 納豆多糖分子質(zhì)量的測(cè)定

采用高效液相色譜法[14]測(cè)定納豆多糖的重均分子量，檢測(cè)器為示差折光儀。不同分子質(zhì)量的右旋糖酐(5.3、9.8、13.1、36.8、64.7 kDa)為標(biāo)準(zhǔn)品，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，以lgMw為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。

色譜條件：Shodex OHpak SB-804HQ色譜柱；以0.1 mol/L NaNO3，含0.03% NaN3溶液為流動(dòng)相，樣品濃度為1 g/L；流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)時(shí)間為60 min，柱溫為室溫。

1.3.7 單糖組成的測(cè)定

采用氣-質(zhì)聯(lián)用色譜法檢測(cè)納豆多糖單糖組成。

多糖的水解[16]：精密稱(chēng)取納豆多糖0.003 0 g置于梨形瓶中，加入0.7 mL蒸餾水和0.3 mL TFA溶液，密封梨形瓶口并劇烈振蕩使溶液充分混勻，120 ℃下水解6 h，冷卻后加入1 mL甲醇在60 ℃下減壓旋干，并反復(fù)3次。

水解物的衍生：向水解后的樣品中加入30 mg鹽酸羥胺和0.5 mL吡啶，振蕩溶解后90 ℃氧化30 min，冷卻后再加入1 mL乙酸酐，再次90 ℃氧化30 min。向溶液中加入1 mL的二氯甲烷和3 mL蒸餾水并劇烈振蕩。離心分層除去上層水相，反復(fù)3次。除去溶液中水分，吸取上層清液，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后待測(cè)。以7種純品單糖作為對(duì)照。

1.3.8 紅外光譜

參考馬小雙等[17]的測(cè)定方法，取2 mg納豆多糖樣品及200 mg干燥的KBr放入瑪瑙研缽中，在高溫干燥條件下將其混勻并研細(xì)。將混合物壓成0.3～0.5 mm的透明薄片，在400～4 000 cm-1紅外波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，觀察并分析譜峰情況。

1.3.9 剛果紅實(shí)驗(yàn)

采用改良后曾婷等[18]的實(shí)驗(yàn)方法，稱(chēng)取納豆多糖樣品20 mg于試管中，再加入1 mL蒸餾水和80 μmol/L剛果紅溶液1 mL，充分混勻后加入NaOH，使各管中NaOH終濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L，并用紫外全波段掃描，記錄在不同NaOH濃度下的最大吸收波長(zhǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆多糖理化性質(zhì)的分析

2.1.1 總糖

以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值(490 nm)為縱坐標(biāo)回執(zhí)標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程為Y=5.009 8X+0.016 3，且相關(guān)系數(shù)R2=0.998 8，表明葡萄糖含量與其吸光度值有良好的線性關(guān)系，可用于納豆多糖樣品總糖含量的計(jì)算。納豆多糖溶液所得吸光度值平均值為0.347，代入回歸方程并計(jì)算得納豆多糖總糖含量約為66.01%。李宏睿等[19]利用超聲波輔助提取大豆多糖，所提取的大豆多糖純度為96.58%，與此相比較，實(shí)驗(yàn)所得納豆總糖的含量較低，原因可能是超聲波的空化作用及高振動(dòng)頻率會(huì)加速植物多糖的溶出以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的伸展，提高了蛋白質(zhì)的去除率及大豆多糖的提取率；另一方面是因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程中納豆菌的生長(zhǎng)繁殖對(duì)總糖的消耗，降低了納豆多糖的含量。

2.1.2 蛋白質(zhì)含量

稱(chēng)取納豆多糖樣品1.00 g，經(jīng)消化和蒸餾后，滴定消耗0.1 mol/L HCl體積的平均值為1.67 mL，計(jì)算得蛋白質(zhì)含量為1.12%。

2.1.3 糖醛酸含量

半乳糖醛酸與咔唑試劑在H2SO4中的反應(yīng)物呈紫紅色，顏色深淺與半乳糖醛酸的含量成正比，可通過(guò)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行比色定量。用不同的儀器與試劑測(cè)定半乳糖醛酸時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致最大吸光值的不同。由圖1可知，咔唑-硫酸法檢測(cè)半乳糖醛酸吸光度值的最大波長(zhǎng)為510 nm。以半乳糖醛酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值(510 nm)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，所得回歸方程為Y=4.926 4X-0.007 7，且相關(guān)系數(shù)R2=0.998 8。納豆多糖樣品經(jīng)平行測(cè)定得吸光度值平均值為0.451，計(jì)算納豆多糖中糖醛酸的含量約為2.79%。夏永剛等[20]探究麻黃多糖中的糖醛酸含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，咔唑-硫酸法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，可用于多糖的構(gòu)效關(guān)系和生物學(xué)活性研究。

圖1 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定曲線Fig.1 The maximum absorption wavelength ofGalacturonic acid standard

不同濃度梯度的半乳糖醛酸所測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。

2.2 納豆多糖的純化

納豆多糖經(jīng)緩沖液的溶解后進(jìn)入層析柱，在流動(dòng)相0.2 mol/L NH4HCO3的帶動(dòng)下根據(jù)分子質(zhì)量的大小依次流出色譜柱來(lái)進(jìn)行分級(jí)分離。洗脫液經(jīng)收集器收集后，用苯酚-硫酸法檢測(cè)其吸光度值，并繪出洗脫曲線。當(dāng)洗脫曲線峰形較好且對(duì)稱(chēng)時(shí)，說(shuō)明多糖經(jīng)洗脫分離后純度較高。由圖2可知，納豆多糖在凝膠柱的分離中呈現(xiàn)一個(gè)較對(duì)稱(chēng)的峰，說(shuō)明納豆多糖為單組分。收集出峰管中的多糖溶液進(jìn)行濃縮、透析、凍干，可得純品納豆多糖。石浩等[24]用DEAE-纖維素對(duì)水溶性大豆多糖進(jìn)行梯度洗脫，得出水溶性大豆多糖有3個(gè)主要組分，說(shuō)明大豆多糖中較大分子的糖類(lèi)經(jīng)納豆菌發(fā)酵后成為了分子質(zhì)量較小且單一的組分。采用Sephadex G-75凝膠柱純化的納豆多糖洗脫曲線如圖2所示。

圖2 納豆多糖在Sephadex G-75凝膠柱上的洗脫曲線Fig.2 The elution curve of natto polysaccharideson Sephadex G-75 column

2.3 納豆多糖的分子質(zhì)量分析

根據(jù)凝膠色譜柱的尺寸排阻特性，多糖經(jīng)色譜柱洗脫時(shí)的保留時(shí)間與分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)。用已知分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)多糖在合適的色譜條件下測(cè)出對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間，并做出其與分子質(zhì)量對(duì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同條件下測(cè)出多糖的保留時(shí)間，則可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出多糖的分子質(zhì)量。右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-0.025 42X+12.836，且相關(guān)系數(shù)為R2=0.993 5，保留時(shí)間與分子質(zhì)量對(duì)數(shù)有良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。由圖3可知，納豆多糖檢測(cè)到了3個(gè)對(duì)稱(chēng)峰，中間是一個(gè)很好的對(duì)稱(chēng)峰形，保留時(shí)間為34.516 7 min。主峰前后2個(gè)峰形強(qiáng)度較弱，說(shuō)明2種分子質(zhì)量的多糖濃度較低。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，代入納豆多糖的保留時(shí)間計(jì)算得納豆多糖主要組分分子質(zhì)量量為11.53 kDa。何喜珍等[25]在對(duì)大豆多糖不同的降解條件下得到分子質(zhì)量在21～550 kDa的大豆多糖，納豆多糖組分單一且分子質(zhì)量較小，是因?yàn)榧{豆菌在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)大豆多糖的分解轉(zhuǎn)化，使多糖部分糖苷鍵斷裂，發(fā)生降解，導(dǎo)致分子質(zhì)量變小。

在相同條件下，納豆多糖所測(cè)得的保留時(shí)間曲線如圖3所示。

圖3 納豆多糖的保留時(shí)間曲線Fig.3 Retention time curve of natto polysaccharide

2.4 單糖組成分析

氣相色譜法可以對(duì)化合物進(jìn)行有效的定性分析，但不適用于復(fù)雜的有機(jī)物，而質(zhì)譜法可以對(duì)有機(jī)化合物進(jìn)行定量分析，兩者結(jié)合則能對(duì)復(fù)雜有機(jī)化合物進(jìn)行高效的定量和定性分析。單糖標(biāo)準(zhǔn)品圖譜如圖4所示，納豆多糖單糖組成的氣-質(zhì)聯(lián)用色譜分析圖見(jiàn)圖5。由圖5可知，納豆多糖中單糖已完全分開(kāi)。相比于標(biāo)準(zhǔn)品圖譜，納豆多糖中已知單糖為巖藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，編號(hào)為h的單糖出峰時(shí)間在木糖與甘露糖之間，為木糖醇[26]，各單糖摩爾比為巖藻糖∶木糖醇∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=1.04∶ 1.53∶ 1.57∶ 1.19∶ 4.68。賴(lài)富饒等[27]采用糖醇乙酸酯衍生法測(cè)定豆皮多糖和豆渣多糖的單糖組成發(fā)現(xiàn)，豆皮多糖以甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖為主，豆渣多糖以半乳糖和阿拉伯糖為主，其他種類(lèi)的單糖皆有，但含量較低。由此可知，納豆菌可能會(huì)作用于單糖官能團(tuán)，使其結(jié)構(gòu)改變。

a-鼠李糖；b-巖藻糖；c-阿拉伯糖；d-木糖；e-甘露糖；f-葡萄糖；g-半乳糖圖4 單糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.4 The GC-MS chromatogram of monosaccharide standard

圖5 納豆多糖中單糖組成色譜圖Fig.5 Chromatogram of monosaccharide compositionin natto polysaccharide

2.5 紅外光譜分析

圖6 納豆多糖紅外光譜圖Fig.6 IR speetra of the natto polysaeeharid

2.6 空間結(jié)構(gòu)的分析

剛果紅是一種生物染色劑，能夠與多糖中的單股螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)合，結(jié)合成的復(fù)合物的最大吸收波長(zhǎng)將隨著單股螺旋結(jié)構(gòu)濃度的升高而變大。在一定的堿性體系中，多糖中的三股螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解聚，使單股螺旋結(jié)構(gòu)的濃度增大，反應(yīng)溶液的最大吸收波長(zhǎng)也會(huì)發(fā)生變化[29]。由圖7可知，相比于剛果紅本身平緩的變化趨勢(shì)而言，納豆多糖絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)隨著NaOH濃度的增大而降低，并且在NaOH濃度為0.3 mol/L時(shí)急劇下降，說(shuō)明納豆多糖中的單股螺旋結(jié)構(gòu)增多，與剛果紅形成的絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)的特殊變化證明納豆多糖具有三股螺旋結(jié)構(gòu)。

圖7 納豆多糖與剛果紅混合堿溶液最大吸收波長(zhǎng)的變化Fig.7 Changes in absorption wavelength maximum of mixtureof Congo red and natto polysaeeharid

3 結(jié)論