成天童，何冰芳，2*

1(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京, 211816)2(南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京,211816)

低聚果糖(fructooligosaccharide,FOS)是公認(rèn)典型的益生元，具有改善腸道功能、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、降低膽固醇和血脂等多種功能，并可以調(diào)節(jié)腸道菌群、調(diào)節(jié)增殖雙歧桿菌[1]。目前低聚果糖在食品方面的產(chǎn)品已達(dá)500多種，在乳酸飲料、酸奶、蛋糕、面包等多種食品中廣泛應(yīng)用[2-3]。

目前工業(yè)上生產(chǎn)低聚果糖主要以菊芋或菊苣為原料，熱水浸提后，經(jīng)菊粉酶水解制備β-2，1糖苷鍵連接的菊粉型低聚果糖[4]。近年來，β-2，6糖苷鍵連接的低聚果糖因具有更優(yōu)的益生元特性而受到越來越多關(guān)注[5-6]。但是已報(bào)導(dǎo)的酶法催化合成β-2，6鍵型低聚果糖的轉(zhuǎn)化率都普遍較低，難以應(yīng)用于實(shí)際。本實(shí)驗(yàn)室自行篩選獲得ArthrobacterarilaitensisNJEM01來源的β-呋喃果糖苷酶(Fru6)，該酶能夠以蔗糖為底物特異性合成β-2，6鍵連接的6-蔗果三糖[7]。在此基礎(chǔ)上通過對該酶進(jìn)行分子改造提高了6-蔗果三糖的轉(zhuǎn)化率，并得到了新的產(chǎn)物6-蔗果四糖[8]。

因游離酶在反應(yīng)體系中易與水溶性的產(chǎn)物混合，導(dǎo)致難以將催化劑酶與產(chǎn)物分離。通過合適的顆粒載體將游離酶固定化后，可以易于實(shí)現(xiàn)酶的回收和多個批次的重復(fù)利用，降低酶催化劑的投入成本。多官能團(tuán)固定化是一種將共價(jià)法和吸附法相結(jié)合的固定化方案。這種固定化方法可以針對酶的敏感區(qū)域進(jìn)行多點(diǎn)共價(jià)固定化，從而產(chǎn)生更穩(wěn)定的固定化酶[9]。

因?yàn)榇罂讟渲哂休^強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度和較穩(wěn)定的孔狀結(jié)構(gòu)，本文在大孔樹脂MI-BN4表面修飾多官能團(tuán)基團(tuán)，對β-呋喃果糖苷酶Fru6進(jìn)行固定化試驗(yàn)。對固定化條件及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，并研究固定化酶Fru6催化合成低聚果糖及可重復(fù)反應(yīng)的能力。實(shí)現(xiàn)新型低聚果糖的批次制備，使其更好地應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

β-呋喃果糖苷酶(ArthrobacterarilaitensisNJEM01，本試驗(yàn)室自主篩選)；大孔樹脂MI-BN4，杭州創(chuàng)科生物科技有限公司；乙腈(色譜純)，其他試劑均為分析純。

PYX-DHS-40*50-BS恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱，江蘇太倉試驗(yàn)設(shè)備廠；ALPHA 1-2LD PLUS冷凍干燥機(jī)，德國CHRIST；SBA-40C生物傳感儀,山東科學(xué)院。Ultimate 3000高效液相色譜儀，賽墨飛公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 果糖苷酶制備

重組菌在37 ℃條件下生長2 h后，在低溫條件下(25 ℃)經(jīng)IPTG(1 mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)分泌至胞外，發(fā)酵12 h后在4 ℃、8 000 r/min條件下離心收集上清粗酶液，放置于4 ℃條件下備用。

1.2.2 大孔樹脂MI-BN4預(yù)處理及多官能團(tuán)修飾

將20 g大孔樹脂MI-BN4用過量蒸餾水沖洗3次，真空干燥后待用。

對經(jīng)過預(yù)處理后的大孔樹脂進(jìn)行羥基化處理。稱取10 g大孔樹脂置于250 mL的圓底燒瓶中，加入100 mL食人魚溶液V(H2SO4)∶V(30%H2O2)=30∶70。在90 ℃攪拌的條件下，加熱回流1 h，冷卻至室溫，棄去上清，用蒸餾水將樹脂洗滌至中性待用。

將樹脂表面的羥基反應(yīng)為環(huán)氧基團(tuán)以及乙二醇基團(tuán)[9]。稱取10 g羥基化后的大孔樹脂于250 mL的錐形瓶中。在常溫條件下，依次加入H2O 44 mL、丙酮16 mL、NaOH 3.28 g、NaBH40.2 g，環(huán)氧氯丙烷11 mL，磁力攪拌16 h后，用水沖洗除去剩余反應(yīng)液。

使用濃H2SO4除去樹脂表面的環(huán)氧基團(tuán)，將乙二醇基團(tuán)反應(yīng)為乙醛基。在處理后的載體中加入100 mL的H2SO4(0.5 mol/L)，在常溫條件下攪拌反應(yīng)2 h。倒掉上清液，用大量水沖洗除去剩余濃H2SO4,加入高碘酸鈉溶液(0.1 mol/L、20 mL)和乙二醇基團(tuán)在常溫條件下攪拌反應(yīng)3 h。用水沖洗除去剩余反應(yīng)液待用。

在大孔樹脂表面修飾親核基團(tuán)，將其修飾為不同性質(zhì)的多官能團(tuán)樹脂[9]。

(1)制備陽離子載體：將帶有乙醛基基團(tuán)的樹脂用1 mol/L的三乙胺在V(H2O)∶V(丙酮)=1∶1、pH 12.0、25 ℃的條件下攪拌反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，用水沖洗除去剩余反應(yīng)液，將修飾后的載體真空干燥后待用。

(2)制備陰離子載體：將帶有乙醛基基團(tuán)的樹脂用0.5 mol/L的亞胺基二乙酸在pH 8.0、25 ℃條件下攪拌反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，用水沖洗除去剩余反應(yīng)液，將修飾后的載體真空干燥后待用。

(3)制備金屬螯合載體：將陰離子載體用30 g/L的3種不同金屬鹽(CuSO4、NiCl2和CoCl2)溶液在pH 7.0， 25 ℃下攪拌反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，用水沖洗除去剩余反應(yīng)液，將修飾后的載體真空干燥后待用。

1.2.3 果糖苷酶Fru6固定化方法

將1 mL(30U)酶液與0.2 g樹脂在25 ℃、中性條件下置于混勻儀中以200 r/min振蕩反應(yīng)4 h后，移除上清，檢測上清中殘余的酶活力和蛋白含量。

然后加入Gly-NaOH(50 mmol/L、pH 10.0)，在25 ℃條件下反應(yīng)3 h后，去除上清，用蒸餾水沖洗直至中性。將得到的固定化酶在4 ℃條件下保存在Na2HPO4-KH2PO4(50 mmol/L、pH 6.5)中待用。

1.2.4 酶活性和蛋白質(zhì)含量檢測

酶活力單位定義：一個酶活力單位即在35 ℃，pH 6.5條件下，每分鐘催化蔗糖水解產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需的酶量為1 U(U即μmol/(mL·min))。

測定酶活力的方法：將蔗糖(1 mol/L)溶解在Na2HPO4-KH2PO4(50 mmol/L、pH 6.5)緩沖液中，取50 μL酶液加入到950 μL蔗糖底物溶液中，于35 ℃混勻儀中200 r/min振蕩反應(yīng) 15 min，反應(yīng)完成后立即煮沸15 min終止反應(yīng)。將反應(yīng)液適當(dāng)稀釋后用生物傳感儀(SBA-40E) 測定反應(yīng)產(chǎn)生的葡萄糖的量。固定化酶則是將2 mg的固定化酶加入到1 mL的蔗糖底物溶液中，在相同的條件下反應(yīng)，然后檢測其酶活。

蛋白質(zhì)含量的測定參照Brad法[10]。本文中采用Brad法分別對固定化前酶液和固定化后上清與洗滌液中的蛋白含量進(jìn)行測定，計(jì)算固定化過程中蛋白質(zhì)的吸附量。

1.2.5 果糖苷酶Fru6固定化條件的優(yōu)化

1.2.5.1 固定化溫度的優(yōu)化

分別在25、30、35、40、45和50 ℃條件下加入30 U果糖苷酶進(jìn)行固定化，反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后取出MI-BN4大孔樹脂，用Na2HPO4-KH2PO4(50 mmol/L、pH 6.5)緩沖液沖洗除去殘留酶液，測定固定化酶活和吸附蛋白量，考察溫度對酶固定化效果的影響。

1.2.5.2 固定化加酶量的優(yōu)化

分別加入15、20、25、30、35、40、45、50、55和60 U的果糖苷酶在25 ℃條件下固定化4 h，固定化后取出大孔樹脂，用Na2HPO4-KH2PO4(50 mmol/L、pH6.5)緩沖液沖洗除去殘留酶液，測定固定化酶活和吸附蛋白量，考察加酶量對酶固定化效果的影響。

1.2.5.3 固定化時間的優(yōu)化

在25 ℃條件下加入40 U果糖苷酶進(jìn)行固定化，固定化時間為 2、4、6、8、10和12 h，結(jié)束后取出大孔樹脂，用Na2HPO4-KH2PO4(50 mmol/L、pH 6.5)緩沖液沖洗除去殘留酶液，測定固定化酶活和吸附蛋白量，考察固定化時間對酶固定化效果的影響。

1.2.6 固定化果糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)

通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化后的固定化條件制備固定化果糖苷酶，經(jīng)真空干燥后，對其酶學(xué)性質(zhì)，包括最適pH及pH穩(wěn)定性、最適溫度及溫度穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

1.2.6.1 最適溫度及溫度穩(wěn)定性

為了研究比較固定化酶和游離酶的最適反應(yīng)溫度，將50 μL的游離酶和10 mg的固定化酶分別加入到950 μL和1 mL蔗糖(1 mol/L、pH 6.5)底物溶液中，兩者的加酶量一致，分別在25、30、35、40、45、50、55、60 ℃下反應(yīng)15 min，反應(yīng)結(jié)束后立即煮沸15 min和取出固定化酶來終止反應(yīng)，測定酶活。以最高酶活力作為對照，計(jì)算相對酶活力，繪制酶活隨著溫度變化而變化的曲線。

為了研究比較固定化酶和游離酶的溫度穩(wěn)定性，分別將游離酶和固定化酶放入 25、30、35、40、45、50、55、60 ℃水浴12 h后，檢測殘余酶活，并計(jì)算殘余酶活與初始酶活的比值。

1.2.6.2 最適pH及pH穩(wěn)定性

為了研究比較固定化酶和游離酶的最適反應(yīng)pH，配制不同濃度pH的緩沖溶液，分別為檸檬酸緩沖液(0.1 mol/L、pH 4.0～6.0)、Na2HPO4-KH2PO4緩沖液(50 mmol/L、pH 5.0～8.5)、Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L、pH 8.5～9.0)和Gly-NaOH緩沖液(50 mmol/L、pH 9.0～10.0)。將50 μL游離酶及2 mg固定化酶分別加入到 950 μL和1 mL用特定pH值緩沖液配制的1 mol/L蔗糖底物溶液中，兩者的加酶量一致。45 ℃反應(yīng)15 min，反應(yīng)結(jié)束后立即煮沸 15 min和取出固定化酶來終止反應(yīng)，測定酶活。以最高酶活力作為對照，計(jì)算相對酶活力。

為了測定游離酶和固定化酶的pH穩(wěn)定性，將游離酶與不同pH值的緩沖液(pH 4.0～10.0)以體積比1∶1混合，固定化酶則是將其加入到不同緩沖中，在25 ℃條件下放置12 h，檢測殘余酶活，并計(jì)算殘余酶活與初始酶活的比值。

1.2.7 產(chǎn)物低聚果糖的液相色譜分析

樣品預(yù)處理：將滅活后的反應(yīng)液用 25%乙腈稀釋4倍，用0.22 μm的有機(jī)微孔濾膜過濾后上樣。色譜條件為：色譜柱(Kromasil)，氨基柱(250 mm×4.6 mm)；流動相V(乙腈)∶V(水)=88∶12；流速為0.7 mL/min；柱溫為30 ℃。

1.2.8 固定化酶和游離酶催化合成低聚果糖反應(yīng)進(jìn)程比較

將游離酶和固定化酶在pH 8.0、35 ℃、1.5 mol/L蔗糖、2 U/g蔗糖加酶量的條件下催化合成低聚果糖[8]，反應(yīng)時間72 h，每12 h取樣1次，樣品取出后立即取出固定化酶終止反應(yīng)，再用25%乙腈稀釋4倍，HPLC檢測產(chǎn)物。

1.2.9 固定化酶重復(fù)使用性研究

固定化酶以2 U/g蔗糖的加酶量進(jìn)行連續(xù)催化合成低聚果糖的反應(yīng)，反應(yīng)時間72 h，反應(yīng)條件為pH 8.0，35 ℃，1.5 mol/L蔗糖。每12 h取樣1次，樣品取出后再用25%乙腈適當(dāng)稀釋，HPLC檢測產(chǎn)物。一次反應(yīng)結(jié)束后用Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液(50 mmol/L，pH 6.5)沖洗除去殘留產(chǎn)物后再投入到下一次反應(yīng)中。

2 結(jié)果與分析

2.1 多官能團(tuán)樹脂固定化結(jié)果

表1 多官能團(tuán)固定化效果比較Table 1 Comparison of multi-functional immobilization effects

2.2 固定化條件優(yōu)化

2.2.1 溫度

溫度對于載體吸附酶蛋白有重要影響，結(jié)果如圖1所示，在25～50 ℃，溫度對蛋白吸附量影響不大，但50 ℃時固定化酶酶活力有了明顯的降低，這可能是高溫引起了果糖苷酶的構(gòu)象變化，并影響了果糖苷酶分子的活性中心，導(dǎo)致酶活力下降。考慮到試驗(yàn)操作和經(jīng)濟(jì)效益選擇25 ℃作為最適溫度，此時固定化酶酶活力為163 U/g。

圖1 溫度對固定化效果的影響Fig.1 The effect of temperature on the immobilization effect

2.2.2 加酶量

在固定化體系中，加酶量是影響固定化效率的重要因素之一。如圖2所示，在加酶量從15 U增加到40 U時，固定化酶酶活力和蛋白吸附量隨著加酶量的增加而逐漸增加，在40 U到60 U時，固定化酶酶活力和蛋白吸附量幾乎趨于平衡，這表明該載體已達(dá)到飽和狀態(tài)。所以選擇40 U作為加酶量條件，此時固定化酶酶活力為182.5 U/g。

圖2 加酶量對固定化效果的影響Fig.2 Effect of enzyme amount on immobilization effect

2.2.3 時間

時間對于多官能團(tuán)樹脂固定化Fru6的影響如圖3所示，可以發(fā)現(xiàn)蛋白的吸附量隨著時間的增加而增加，當(dāng)時間超過6 h后，蛋白吸附量趨于穩(wěn)定，不再有明顯的增加。固定化果糖苷酶在6 h時的酶活力約為 205.2 U/g，之后固定化果糖苷酶酶活力也沒有明顯的改變。因此考慮到制備效率，選擇6 h作為吸附條件。

圖3 固定化時間對固定化效果的影響Fig.3 Effect of immobilization time on immobilization effect

2.3 固定化酶酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 固定化酶和游離酶最適溫度

如圖4所示，固定化酶與游離酶在低于45 ℃條件下，酶活力隨著溫度的升高而升高。當(dāng)反應(yīng)溫度超過45 ℃時，酶活力開始出現(xiàn)了快速下降的趨勢，到50 ℃時，固定化酶與游離酶的酶活均只有最大活力的50%左右。所以固定化酶和游離酶的催化蔗糖水解的最適反應(yīng)溫度一致，均為45 ℃。這說明固定化酶對溫度的敏感性與游離酶基本一致。

圖4 固定化酶與游離酶的最適溫度比較Fig.4 Comparison of optimum temperaturebetween immobilized enzyme and free enzyme

2.3.2 固定化酶和游離酶最適pH

結(jié)果如圖5所示，固定化酶和游離酶的最適pH均為6.5，在pH 8.0～9.0，固定化酶和游離酶的酶活力均開始下降，但固定化酶的酶活力的下降速度要慢許多，其可以保持最適活力的90%以上，而游離酶則下降到了80%以下。固定化酶在堿性條件下比游離酶表現(xiàn)出更好的活力，這說明固定化酶的pH適應(yīng)性相比游離酶變得更寬。

圖5 固定化酶與游離酶最適pH比較Fig.5 Comparison of the optimum pH of immobilizedenzyme and free enzyme

2.3.3 固定化酶和游離酶溫度穩(wěn)定性

固定化酶和游離酶在不同溫度條件下保留12 h后的活力保留結(jié)果如圖6所示。游離酶的活力自40 ℃開始下降，到45 ℃時就已經(jīng)損失了50%的酶活力，而固定化酶在低于45 ℃時酶活力保持在90%以上，45 ℃后開始呈現(xiàn)下降趨勢，固定化酶在55 ℃時酶活力下降到了50%。這表明固定化酶相對于游離酶有著更好的溫度穩(wěn)定性。這可能是因?yàn)樵诙帱c(diǎn)共價(jià)連接的情況下，酶的固定化可以使得酶的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。GUERRERO等[11]使用經(jīng)多官能團(tuán)修飾后的瓊脂糖為載體，對β-半乳糖苷酶進(jìn)行固定化試驗(yàn)后，該固定化酶在50 ℃的半衰期達(dá)到了100 h。

圖6 固定化酶與游離酶溫度穩(wěn)定性比較Fig.6 Comparison of temperature stabilitybetween immobilized enzyme and free enzyme

2.3.4 固定化酶和游離酶pH穩(wěn)定性

如圖7所示，在不同pH緩沖液中保存12 h后，固定化酶和游離酶在pH 4.0～5.0時，酶活力損失很多。固定化酶在pH 6.0～8.0時較為穩(wěn)定，而游離酶的酶活力自pH 6.0之后就開始下降，至pH 9.0時，僅有50%的活力保留，固定化酶在pH 9.0～10.0仍保留了80%以上的活力。這說明相對游離酶，固定化酶在堿性條件下有著更好的pH穩(wěn)定性。在很多情況下，固定化載體可以充當(dāng)一個離子交換劑，對于酶的活力保留可以起到很大的保護(hù)作用[12]。

圖7 固定化酶及游離酶pH穩(wěn)定性比較Fig.7 Comparison of pH stability betweenimmobilized enzyme and free enzyme

2.4 固定化酶和游離酶催化進(jìn)程比較

固定化對于果糖苷酶催化合成低聚果糖的影響是衡量該固定化試驗(yàn)效果的重要標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果如圖8所示，固定化酶和游離酶的反應(yīng)趨勢總體一致，固定化酶催化合成低聚果糖轉(zhuǎn)化率在24 h達(dá)到了最高，合成的低聚果糖轉(zhuǎn)化率約為72%，總低聚果糖約 360 g/L，其中蔗果四糖約為37 g/L。而游離酶同樣在24 h達(dá)到了最高，合成的低聚果糖轉(zhuǎn)化率約62%，其中 6-蔗果三糖約 323 g/L，蔗果四糖約23 g/L。固定化酶合成的蔗果四糖在72 h時最大約為 71 g/L，而游離酶最大為60 g/L。GUERRERO等[11]使用表面修飾多官能團(tuán)的載體對β-半乳糖苷酶進(jìn)行固定化后，使其催化能力得到提高。

a-固定化酶催化合成低聚果糖反應(yīng)進(jìn)程;b-游離酶催化合成低聚果糖反映進(jìn)程圖8 固定化酶與游離酶催化合成低聚果糖反應(yīng)進(jìn)程比較Fig.8 Comparison of the reaction process between immobilizedenzyme and free enzyme catalyzed synthesis of oligofructose

2.5 固定化酶Fru6可重復(fù)利用次數(shù)

固定化酶重復(fù)催化合成低聚果糖的能力如圖9所示，在重復(fù)催化12個批次后，低聚果糖的轉(zhuǎn)化率略有降低，這表明固定化酶在重復(fù)使用的過程中，酶活沒有明顯的損失，依然具有較高的低聚果糖轉(zhuǎn)化能力。說明該固定化果糖苷酶具有較好的穩(wěn)定性，可以進(jìn)行多批次催化合成低聚果糖。

圖9 固定化酶重復(fù)催化合成低聚果糖Fig.9 Repeated catalytic synthesis ofoligofructose by immobilized enzyme

3 結(jié)論

使用來源于Arthrobacterarilaitensis的β-呋喃果糖苷酶，以大孔樹脂MI-BN4為載體，研究了多官能團(tuán)大孔樹脂對果糖苷酶的固定化效果。對固定化條件進(jìn)行優(yōu)化，并研究了固定化酶酶學(xué)性質(zhì)、催化合成低聚果糖能力以及可重復(fù)使用次數(shù)?？偨Y(jié)如下：

(1)使用將吸附法和共價(jià)法結(jié)合的多官能團(tuán)固定化后，經(jīng)分析比較，發(fā)現(xiàn)Amino-glyoxyl-MI-BN4對酶活的回收率可以達(dá)到86.3%。對固定化過程進(jìn)行優(yōu)化后，在吸附時間6 h，溫度25 ℃，加酶量40 U的條件下進(jìn)行固定化，得到了酶活力205.7 U/g，酶活回收率95.2%，蛋白吸附量0.6 mg/g的固定化果糖苷酶。

(2)比較固定化酶和游離酶催化合成低聚果糖的反應(yīng)進(jìn)程曲線后發(fā)現(xiàn)，它們的催化進(jìn)程并無明顯區(qū)別。固定化酶低聚果糖的產(chǎn)量要高于游離酶的產(chǎn)量，達(dá)到了360 g/L，轉(zhuǎn)化率為72%，游離酶為323 g/L，轉(zhuǎn)化率為62%。經(jīng)過12次的重復(fù)試驗(yàn)后，固定化酶的低聚果糖轉(zhuǎn)化率略有下降，說明其具備了較好的操作穩(wěn)定性。