吳雅露，陳琪，陳夢(mèng)濤，應(yīng)鵬飛，蔣玉蓉，陸國(guó)權(quán)

（浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州311300）

藜麥（Chenopodium quinoa Wild.），又稱南美藜、藜谷等，是一種一年生的藜科草本作物[1]。它是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）推薦的唯一的單體植物就可以滿足人體全部基本物質(zhì)需求的完美全營(yíng)養(yǎng)食品[2]，其蛋白質(zhì)含量很高，富含不飽和脂肪酸、類黃酮等多種有益化合物，被譽(yù)為“糧食之母”、“未來(lái)的超級(jí)谷物”、“營(yíng)養(yǎng)黃金”、“有機(jī)谷類之王”等[3-4]。黃酮類化合物是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物之一，是一種生理活性活潑的物質(zhì)，具有抗病毒、抗癌防癌、防治動(dòng)脈粥硬化、降血壓、血脂及膽固醇等藥理作用[5-7]，其中對(duì)糖尿病的治療效果明顯[8]。然而目前有關(guān)藜麥種子黃酮類化合物的研究報(bào)道尚少。

藜麥種子黃酮具有較強(qiáng)的清除自由基、抗氧化等功效[9]，研究與開發(fā)前景廣闊。目前關(guān)于藜麥種子黃酮的提取方法有乙醇回流提取[10-11]、超聲輔助提取[12-13]、微波輔助提取[14-16]等。響應(yīng)面方法是通過部分因子試驗(yàn)找出重要因子，然后應(yīng)用最陡爬坡路徑方法逼近最大響應(yīng)面區(qū)域，最后通過中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)找到最優(yōu)組合[17]。與傳統(tǒng)的直線回歸分析方法相比，它具有分析多因素的能力；與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法相比，它能找到試驗(yàn)設(shè)定值之間的最佳組合[18]。本研究采用響應(yīng)面分析法[19-21]，在提取時(shí)間、超聲功率、提取溫度3 個(gè)單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)超聲波輔助提取藜麥種子總黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并與乙醇熱回流工藝比較，為藜麥黃酮類物質(zhì)的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。探索最佳提取工藝條件和最佳純化工藝條件，進(jìn)而提高黃酮產(chǎn)量，為多種疾病的治療與預(yù)防提供一定的物質(zhì)保障。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

藜麥Temuco 品種干燥種子：浙江農(nóng)林大學(xué)提供，粉碎機(jī)充分粉碎，過0.5 mm 孔篩篩選，裝入干燥器皿中備用。

蘆丁對(duì)照品：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇：均為國(guó)產(chǎn)分析純，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

TP-214 電子天平：丹佛儀器有限公司；XMTD-6000恒溫水浴鍋：上海申勝生物技術(shù)有限公司；TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；752PC 紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；JAC-600 超聲波中藥處理機(jī)：山東濟(jì)寧超聲電器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃酮的提取

1.3.1.1 超聲波輔助提取

依照超聲波輔助提取黃酮的方法[12-13]，設(shè)計(jì)藜麥黃酮提取的工藝流程：稱取0.5 g 干燥粉末→超聲波輔助乙醇提取→離心分離→過濾→濃縮→定容棕色容量瓶→避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 熱回流提取

依照熱回流提取黃酮的方法[10-11]，設(shè)計(jì)藜麥黃酮提取的工藝流程：稱取0.5 g 干燥粉末→浸提劑浸泡→熱回流提取→冷卻→過濾→濃縮→定容棕色容量瓶→避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 黃酮量的測(cè)定

本研究用比色法測(cè)定藜麥總黃酮含量[22]。準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試劑5.000 mg，用60%乙醇完全溶解后定容至50 mL，搖勻的濃度為0.1 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于6只10 mL 刻度試管中，用60%乙醇補(bǔ)至5.0 mL，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min 后加入0.3 mL10 %硝酸鋁溶液，放置6 min，再加入4.0 mL 1 mol/L 氫氧化鈉溶液，混勻，再加0.4 mL 60%的乙醇，室溫（20 ℃左右）放置 15 min 后于波長(zhǎng) 501 nm 處測(cè)定其吸光度，以60%乙醇溶液為空白對(duì)照，建立測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程。蘆丁在0～50 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，以吸光值（y）為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=13.771x-0.013 6（R2=0.998 0）。該結(jié)果表明蘆丁在該濃度范圍內(nèi)吸光值與濃度之間存在良好的線性關(guān)系。測(cè)定總黃酮含量時(shí)，以不同的樣品液代替蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，其他步驟與制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)方程相同。計(jì)算公式如下：

式中：C 為測(cè)定樣液的濃度，mg/mL；V0為測(cè)定吸光度所用樣液的體積，mL；V1為測(cè)定時(shí)稀釋體積，mL；V2為樣液定容后體積，mL；W 為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量提取的影響

在提取溫度為60 ℃，超聲波功率為60 W 條件下，分別提取 25、35、45、55 min，進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定，分析提取時(shí)間對(duì)提取藜麥種子總黃酮含量的影響。

1.3.3.2 超聲波功率對(duì)總黃酮含量提取的影響

在提取溫度為60 ℃的條件下，超聲功率分別為30、40、50、60 W 時(shí)，提取 35 min，進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定，分析超聲功率對(duì)提取藜麥種子總黃酮含量的影響。

1.3.3.3 提取溫度對(duì)總黃酮含量提取的影響

在超聲波功率為60 W 的條件下，提取溫度分別為 50、60、70、80 ℃時(shí)，提取 35 min，進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定，提取溫度對(duì)提取藜麥種子總黃酮含量的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取時(shí)間（X1）、超聲波功率（X2）、提取溫度（X3）3 個(gè)因素為自變量，將各自最優(yōu)條件的范圍編碼為-1、0、1，并以總黃酮含量為指標(biāo)設(shè)計(jì)出17 組響應(yīng)面試驗(yàn)。通過Design Expert8.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到藜麥種子總黃酮提取的最優(yōu)工藝參數(shù)。中心組合試驗(yàn)的因子及編碼值見表1。

表1 中心組合試驗(yàn)的因子及編碼值Table 1 Factors and encoding values of central composite test

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007 軟件分析整理數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差并制圖分析；采用Design Expert8.0 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案，建立模型并進(jìn)行多元回歸分析。每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮含量的單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響

在溫度為60 ℃，超聲波功率為60 W 的條件下，考察不同提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響，見圖1。

圖1 提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響Fig.1 Effect of extraction time on total flavonoids content

結(jié)果表明，總黃酮含量隨提取時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，提取時(shí)間在35 min 時(shí)總黃酮含量達(dá)到最大值。推測(cè)原因在于隨著提取時(shí)間的增加，到達(dá)35 min 時(shí)，藜麥種子內(nèi)的黃酮已被全部提取出，但隨著提取時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，黃酮類物質(zhì)可能發(fā)生降解[23]，反而導(dǎo)致總黃酮含量下降。故確定提取時(shí)間最佳為35 min。

2.1.2 超聲波功率對(duì)總黃酮含量的影響

在溫度為60 ℃，提取時(shí)間為35 min 的條件下，考察不同超聲波功率對(duì)總黃酮含量的影響，見圖2。

圖2 超聲波功率對(duì)總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on total flavonoids content

結(jié)果表明，總黃酮含量隨著功率的提高而逐漸增大，在超聲波功率為40 W 時(shí)總黃酮含量達(dá)到最高值。而隨著超聲波功率進(jìn)一步增加，總黃酮含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。超聲波輔助乙醇提取的方法依賴于液體的空化作用，超聲波功率的增加可導(dǎo)致其空化效應(yīng)的增強(qiáng)[24]，加速溶劑進(jìn)入藜麥種子粉末的內(nèi)部，促進(jìn)黃酮物質(zhì)的浸出。但當(dāng)超聲波功率過大時(shí)，超聲瞬時(shí)熱效應(yīng)明顯，過高的溫度可能導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)分解或者被氧化，總黃酮含量降低。故確定超聲波功率最佳為40 W。

2.1.3 溫度對(duì)總黃酮含量的影響

在提取時(shí)間為35 min，超聲波功率為60 W 的條件下，考察不同溫度對(duì)總黃酮含量的影響，見圖3。

圖3 溫度對(duì)總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of temperature on the content of total flavonoids

結(jié)果表明，總黃酮含量隨溫度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，溫度在60 ℃時(shí)總黃酮含量達(dá)到最大值。是因?yàn)橐欢ǔ潭鹊臏囟仍黾?，可以使物質(zhì)的溶解度增大，增加黃酮類物質(zhì)分子和溶劑分子的碰撞機(jī)會(huì)，提高其溶出率。但是溫度過高會(huì)導(dǎo)致溶劑汽化，破壞黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，反而降低總黃酮含量。故確定最佳提取溫度為60 ℃。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取條件結(jié)果分析

2.2.1 工藝參數(shù)優(yōu)化

采用Box-Benhnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)單因素結(jié)果，以提取時(shí)間35 min（X1）、超聲波功率40 W（X2）和提取溫度 60 ℃（X3）為中心點(diǎn)，用響應(yīng)面分析方法進(jìn)行三因素三水平優(yōu)化試驗(yàn)，中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Center test design and test results

以總黃酮含量Y 為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行回歸擬合，得到總黃酮含量預(yù)測(cè)值對(duì)編碼自變量的回歸方程：

總黃酮含量 Y=0.31-3.750×10-3X1+1.125×10-2X2-7.5×10-3X3-2.5×10-2X1X2+7.5×10-3X2X3+2.5×10-3X1X3-7×10-2X12-2×10-2X22-4.25×10-2X32

對(duì)該模型進(jìn)行顯著性方差分析，分析結(jié)果見表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance Analysis of regression model

從表3 可以看出，該模型決定系數(shù)為R2=99.39%，調(diào)整后系數(shù)R2Adj=98.61%，說(shuō)明模型能解釋98.61%響應(yīng)值的變化[25]，模型的P 值為＜0.000 1，說(shuō)明模型的回歸極顯著；失擬項(xiàng)的P 值為0.913 6，不顯著，說(shuō)明該模型與實(shí)際情況擬合極好，試驗(yàn)誤差小。因素一次項(xiàng)X2、X3，交互項(xiàng) X1X2和二次項(xiàng) X12、X22、X32對(duì)總黃酮含量的影響是極顯著（P＜0.01）的，交互項(xiàng)X2X3對(duì)總黃酮含量有顯著影響（0.01＜P＜0.05），因素一次項(xiàng)X1和交互項(xiàng)X1X3對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）?？梢杂?F 值推測(cè)得出各因素的主效關(guān)系：超聲波功率（X2）＞提取溫度（X3）＞提取時(shí)間（X1）。

2.2.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果分析

為了更直觀地表現(xiàn)兩因素間的交互作用對(duì)總黃酮含量提取的影響，根據(jù)提取時(shí)間、超聲波功率和提取溫度影響的藜麥種子總黃酮含量，控制某一因素不變，改變另外兩個(gè)因素，繪制響應(yīng)面圖和等高線圖，見圖4～圖 6。

圖4 超聲波功率、提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour map of total flavonoids content by ultrasonic power and extraction time

圖5 溫度、超聲波功率對(duì)總黃酮含量的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour map of total flavonoids content of temperature and ultrasonic power

圖6 溫度、提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour map of total flavonoids content in temperature and extraction time

兩兩因素間的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響水平可由等高線的形狀來(lái)確定，橢圓形表明兩因素交互作用顯著，圓形則為交互作用不顯著[26]。由圖4 和圖5 可知，提取時(shí)間和超聲波功率兩因素之間，提取溫度和超聲波功率之間交互作用顯著；由圖6 可知，提取溫度和提取時(shí)間之間交互作用不明顯。由圖4～圖6 可知，響應(yīng)面開口向下。隨著每個(gè)因素的增大，響應(yīng)值增大，當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后，隨著因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小。該模型有穩(wěn)定點(diǎn)，且穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。等高線圖中的曲線都是隨著響應(yīng)面的增加而形成一個(gè)頂點(diǎn)，也就是最佳提取量。

為確定最佳提取量，將回歸方程求偏導(dǎo)，取值為零，得到如下三元一次方程組：

求解得 X1=-0.086；X2=0.323；X3=-0.062，分析該模型得到總黃酮含量最佳條件為提取時(shí)間34.57 min，超聲波功率41.62 W 和提取溫度59.37 ℃，在此條件下藜麥種子總黃酮含量的理論值可達(dá)0.3122%。由于實(shí)際操作的局限性，修正理論值為提取時(shí)間35 min，超聲波功率42 W，提取溫度59 ℃。在修正后的條件下進(jìn)行3次重復(fù)的驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果總黃酮含量為0.31 %，與理論值相近，證明該模型能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)藜麥種子總黃酮含量。

2.3 超聲波輔助提取黃酮與熱回流提取黃酮方法效率比較結(jié)果

超聲波輔助提取黃酮與熱回流提取黃酮方法效率比較結(jié)果，見表4。

表4 黃酮總量超聲波輔助提取與熱回流提取比較Table 4 Ultrasonic assist extraction of total flavonoids and comparison of hot reflux extraction

超聲波輔助提取總體水平比熱回流法提取效率高。超聲波輔助提取法提取最適條件為提聲波功率為42 W，提取溫度59 ℃，提取時(shí)間35 min，此條件下平均提取含量為0.31%；熱回流法提取最適條件為提取溫度59 ℃，超聲波功率0 W，提取時(shí)間35 min，此條件下平均提取含量為0.26%。相比較而言，超聲波輔助提取法的平均提取量為熱回流法的1.19 倍。

用超聲波輔助提取法種子中的黃酮類化合物優(yōu)于用熱回流提取法提取黃酮類化合物，分析原因可能是超聲波輔助提取法比熱回流法更能快速促進(jìn)藜麥種子細(xì)胞中黃酮類成分的溶出。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化藜麥種子總黃酮含量的最佳提取工藝，由方差分析得出超聲波功率對(duì)藜麥種子提取的總黃酮含量的影響最大，提取溫度次之，提取時(shí)間最小。得出其最佳工藝條件為：提取時(shí)間35 min、超聲波功率42 W 和提取溫度為59 ℃，在此條件下，總黃酮含量可達(dá)0.31%。與熱回流提取黃酮方法相比較，同等提取溫度和提取時(shí)間的情況下，超聲波提取黃酮法有明顯優(yōu)勢(shì)，平均提取含量可達(dá)熱回流法的1.19 倍。表明超聲波可以增加溶劑分子與物質(zhì)分子的接觸，促進(jìn)提取物黃酮的溶出，增加提取藜麥種子的總黃酮含量，提高提取效率。

本試驗(yàn)可以在一定程度上提高藜麥黃酮的提取率，增加其產(chǎn)量，以促進(jìn)藜麥黃酮類物質(zhì)的開發(fā)利用，為多種黃酮類藥物和保健品的生產(chǎn)提供一定的物質(zhì)保障。