劉元林，龍鳴，田曉靜，，*，張福梅，陳士恩，馬忠仁，，諾茹·伊扎·諾丁

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730124：2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心中國-馬來西亞國家聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730030；3.馬來西亞標(biāo)準(zhǔn)與工業(yè)研究所工業(yè)生物技術(shù)研究中心，雪蘭莪州莎阿南新區(qū)40700）

我國枸杞資源豐富，共有7 個(gè)品種和3 個(gè)變種，主要分布在西北地區(qū)[1]。枸杞具有滋補(bǔ)作用，可入藥，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明：枸杞具有降血糖、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、補(bǔ)腎、抗氧化、抗輻射、降血壓、抗衰老、抗疲勞、保肝、明目等功效[2]。枸杞黃酮具有多種保健作用[3-6]，如何從植物中提取純度高、活性高的黃酮類物質(zhì)，將黃酮進(jìn)一步加工成具有抗癌、抗衰老、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等功能的保健食品成為熱點(diǎn)。目前黃酮提取方法主要為有機(jī)溶劑提取法[7]、超聲波法[8-9]、微波輔助酶法[10]、酶解法等[11]；黃酮含量檢測方法有分光光度法[12]、色譜法[13]、薄層色譜法等[14-15]。目前對枸杞黃酮研究主要在提取工藝的比較與優(yōu)化方面，通過分析枸杞黃酮含量判定枸杞品質(zhì)的研究較少。

本文通過對比分析超聲波提取法、乙醇浸提法以及酶提法提取枸杞黃酮的效果，得出較佳提取方法，在此基礎(chǔ)上，采用單因素試驗(yàn)研究超聲波功率、超聲時(shí)間以及乙醇濃度3 個(gè)因素對黃酮提取的影響規(guī)律，再采用三因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波提取工藝。在優(yōu)化提取條件下，結(jié)合顯著性分析和主成分分析研究不同產(chǎn)地、品種枸杞黃酮提取率的差異，為監(jiān)督市場枸杞的品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

不同產(chǎn)地、品種枸杞樣品購于寧夏中寧市場信息見表1 與表2，15 種市售枸杞樣品信息見表3，樣品購回后置于-4 ℃冷藏待用。

722E 型可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；KQ2200DE 數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SXT-06 索式提取器：上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；H2050R 臺式高速冷凍離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)器有限公司；DG120 型中藥材粉碎機(jī)：浙江省瑞安壽海藥材器械廠；CR-10 便攜式積分球分光光度儀（色差計(jì)）：日本Konica Minolta 公司。

表1 不同地區(qū)枸杞樣品信息表Table 1 Sample information of Lycium barbarum L.from different regions

表2 不同品種枸杞樣品信息表Table 2 Sample information of Lycium barbarum L.of different varieties

表3 15 種市售枸杞樣品基本信息表Table 3 Sample information of 15 comercially avaiable Lycium barbarum L.

蘆?。汉戏什┟郎锟萍加邢挢?zé)任公司；石油醚、無水乙醚、亞硝酸鈉、氫氧化鈉：天津市百世化工有限公司；果膠酶（10 000 U/g）：東莞市瓦里西化工有限公司；藥品均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

將枸杞洗干凈，置于55 ℃烘箱干燥至恒重后粉碎，以密封袋密封，置于-4 ℃冷藏待用。

1.2.2 黃酮提取率測定

參照劉景煜等[16]所用方法，采用分光光度計(jì)法測定枸杞黃酮含量。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。用最小二乘法作線性回歸，可以得出蘆丁濃度C（μg/mL）與吸光度A 的關(guān)系曲線，回歸方程式：A=0.003 9C+0.005 8，R2=0.993 1，在 0～110 μg/mL區(qū)間有較好的線性相關(guān)性。

式中：A 為由標(biāo)準(zhǔn)曲線算得被測液中黃酮含量，μg；M 為試樣質(zhì)量，g；V1為測定用試樣體積，mL；V2為試樣定容體積，mL。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

參照枸杞黃酮提取[17-19]文獻(xiàn)，采用乙醇浸提法、超聲波提取法、酶提取法提取枸杞黃酮，對比分析獲得較佳的提取方法。在此基礎(chǔ)上，以枸杞黃酮提取率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)研究超聲功率（60、70、80、90、100 W）；提取時(shí)間（10、15、20、25、30 min）；乙醇濃度（55%、65%、75%、85%、95%）對枸杞黃酮提取率的影響規(guī)律。

1.2.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用三因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，其因素水平設(shè)計(jì)表見表4。

表4 正交試驗(yàn)因素水平表Table 4 Orthogonal test factors and levels

1.2.5 基本物理參數(shù)測定

參照 GB/T18672-2014《枸杞》[20]和 SN/T0878-2000《進(jìn)出口枸杞檢驗(yàn)規(guī)程》[21]，采用稱量方法測定百粒重；結(jié)合稱量與計(jì)數(shù)測量粒度；使用游標(biāo)卡尺測量枸杞長軸長和短軸長；采用色差計(jì)測量a*、b*、L*。每個(gè)參數(shù)重復(fù)檢測3 次，以其平均值進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.6 粗脂肪含量的測定

參照衛(wèi)斌頡[22]的方法測定枸杞脂肪。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用顯著性分析（significance test）與主成分分析（principle component analysis，PCA）對不同產(chǎn)地、品種和市售枸杞進(jìn)行定性判別；試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 8.0 軟件（美國SAS 軟件公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)結(jié)果圖由Origin 8.0 軟件（美國 OriginLab 公司）繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種提取方法比較

3 種提取方法結(jié)果見圖1。

圖1 3 種提取方法結(jié)果比較Fig.1 The results of three extraction methods are compared

由圖1 可知，超聲波提取法黃酮提取率顯著高于其他兩種方法，乙醇浸提法與酶提取法黃酮提取率差異不顯著，與韓秋菊等[17]結(jié)果一致，故超聲波提取法提取效果更佳。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 超聲功率與黃酮提取率的關(guān)系

超聲功率對枸杞黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 超聲功率對枸杞黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of Ultrasonic power on the extraction rate of flavone in Lycium barbarum L.

由圖2 可知，在料液比為 1 ∶30（g/mL）、乙醇濃度為85 %、提取溫度為80 ℃、提取時(shí)間為15 min、提取2 次的條件下，發(fā)現(xiàn)枸杞黃酮提取率隨著超聲功率升高而上升，當(dāng)超聲功率到達(dá)80 W 時(shí)，提取率隨超聲功率升高而降低，可能是功率過大造成溫度上升，在一定程度上破壞黃酮提取物或使乙醇揮發(fā)，故提取枸杞黃酮較佳超聲功率為80 W。

2.2.2 乙醇濃度與黃酮提取率的關(guān)系

乙醇濃度對枸杞黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 乙醇濃度對枸杞黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of Ethanol concentration on the extraction rate of flavone in Lycium barbarum L.

由圖3 可知，在料液比為 1 ∶30（g/mL）、超聲功率為80 W、提取溫度為80 ℃、提取時(shí)間為15 min、提取2 次的條件下，枸杞黃酮提取率隨乙醇濃度升高而上升，乙醇濃度為85%時(shí)枸杞黃酮提取率最大，超過85%時(shí)枸杞黃酮提取率反而變小，故較佳乙醇濃度為85%。

2.2.3 超聲時(shí)間與黃酮提取率的關(guān)系

超聲時(shí)間對枸杞黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 超聲時(shí)間對枸杞黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of Ultrasonic time on the extraction rate of flavone in Lycium barbarum L.

由圖4 可知，在料液比為 1 ∶30（g/mL）、超聲功率為80 W、提取溫度為80 ℃、乙醇濃度為85 %、提取2次的條件下，隨超聲時(shí)間延長枸杞黃酮提取率先上升后下降，在提取時(shí)間為25 min 時(shí)最大，30 min 時(shí)提取率下降，可能是時(shí)間過長黃酮提取物發(fā)生一定程度水解，故提取枸杞黃酮較佳超聲時(shí)間為25 min。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

以超聲功率、乙醇濃度、超聲時(shí)間為因素，以黃酮提取率為指標(biāo)，采用三因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化，其設(shè)計(jì)表和結(jié)果見表5。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 5 Orthogonal test results table

由表5 可知，根據(jù)極差分析影響順序?yàn)锽＞A＞C，即乙醇濃度對枸杞黃酮的提取效果影響最為顯著，其次為超聲功率，最后為超聲時(shí)間。較佳提取條件為A3B2C2，即超聲功率90 W、乙醇濃度85 %、超聲時(shí)間25 min，提取2 次，此時(shí)枸杞黃酮提取率為2.267%。該結(jié)果與韓秋菊等[17]結(jié)果接近，但本研究各參數(shù)均略高于文獻(xiàn)報(bào)道，同時(shí)黃酮提取率也略高。

2.4 不同產(chǎn)地枸杞品質(zhì)差異分析

不同產(chǎn)地枸杞主成分分析結(jié)果見圖5。

圖5 不同產(chǎn)地枸杞主成分分析結(jié)果Fig.5 Results of principal component analysis of Lycium barbarum L.in different habitats

由圖5 可知，以不同產(chǎn)地枸杞物理參數(shù)和黃酮提取率進(jìn)行主成分分析時(shí)，第1 主成分為45.54%，第2主成分為21.60%，累積貢獻(xiàn)率為67.14%，基本可以代表枸杞的原始信息。不同產(chǎn)地枸杞物理指標(biāo)存在一定的差異性，寧夏產(chǎn)的枸杞粒度較大，粒子小且輕，a*、b*與其他地區(qū)差異顯著、寧夏枸杞位于最右方；甘肅瓜州枸杞百粒重與粒度在青海與寧夏中寧枸杞樣品之間、甘肅瓜州與青海產(chǎn)的枸杞a*、b*差異不顯著，甘肅瓜州枸杞位于中間；青海產(chǎn)枸杞粒子大且重，青海枸杞位于左方。寧夏中寧、甘肅瓜州、青海產(chǎn)的枸杞中的黃酮提取率、百粒重、粒度差異顯著，3 種產(chǎn)地分離效果較好，這與劉曉慧等[23]、張波等[24]結(jié)果一致，以基本物理指標(biāo)與黃酮提取率為輸入，采用主成分分析實(shí)現(xiàn)了不同產(chǎn)地有效的區(qū)分。

2.5 不同品種枸杞品質(zhì)差異分析

不同品種枸杞主成分分析結(jié)果見圖6。

圖6 不同品種枸杞主成分分析結(jié)果Fig.6 Results of principal component analysis of different varieties of Lycium barbarum L.

由圖6 可知，以不同品種枸杞物理參數(shù)和黃酮提取率進(jìn)行主成分分析時(shí)，第1 主成分為72.89%，第2主成分為20.65%，總貢獻(xiàn)率達(dá)93.54%，代表了原始數(shù)據(jù)的很大部分信息。中寧枸杞、新品種5 號與小顆粒3 個(gè)品種百粒重、粒度、橫縱軸、色差、黃酮提取率都存在顯著差異，粒度與黃酮提取率小顆粒顯著高于其他兩個(gè)品種，百粒度、橫縱軸小顆粒顯著低于其他兩個(gè)品種，就色差而言小顆粒b*最大，故小顆粒品種分布在右側(cè)，其他樣品分布在左側(cè)，不同樣品彼此分離，且不同產(chǎn)地枸杞組間彼此區(qū)分，能實(shí)現(xiàn)3 個(gè)不同品種枸杞的區(qū)分。這與述小英等[25]以主成分和聚類分析對不同品種枸杞果實(shí)功能營養(yǎng)成分的區(qū)分結(jié)果一致。

2.6 市售枸杞品質(zhì)差異

對15 種市售枸杞的百粒重、粒度、長短軸、脂肪含量、黃酮提取率進(jìn)行檢測，結(jié)果見表6。

從表6 中可知，15 種枸杞的黃酮提取率差異顯著，但寧夏中衛(wèi)的NA 與QY 黃酮提取率差異不顯著；寧夏銀川的HM 與QL 黃酮提取率差異不顯著；新疆的HL 與寧夏中衛(wèi)的TZ 與YC 黃酮提取率差異不顯著；長短軸部分市售枸杞差異不顯著；百粒重、粒度、脂肪含量15 種市售枸杞差異性顯著。

15 種市售枸杞主成分分析結(jié)果見圖7。

由圖7 可知，以15 種市售枸杞物理參數(shù)和黃酮提取率為參數(shù)進(jìn)行主成分分析時(shí)，第1 主成分為66.24%。第2 主成分為21.00%，總貢獻(xiàn)率達(dá)87.24%，代表了原始數(shù)據(jù)大部分信息。青海產(chǎn)枸杞（YCT、QH）與新疆產(chǎn)枸杞HL 跟其他產(chǎn)地枸杞分離；寧夏地區(qū)中衛(wèi)、中寧與銀川產(chǎn)的枸杞不易區(qū)分開；陜西咸陽產(chǎn)的XY 與寧夏產(chǎn)枸杞不易區(qū)分開，原因可能為兩產(chǎn)地距離相對其他地區(qū)近，由此能實(shí)現(xiàn)市售枸杞的區(qū)分，這與2.4 中不同產(chǎn)地主成分分析結(jié)果一致。

表6 市售枸杞的基本參數(shù)Table 6 The basic parameters of Lycium barbarum L.

圖7 市售枸杞主成分分析結(jié)果Fig.7 The analysis results of the main components of Lycium barbarum L.

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，對枸杞黃酮提取而言，超聲波提取法優(yōu)于乙醇浸提法和酶提取法。采用三因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波提取法工藝條件，獲得較佳的提取條件為A3B2C2，即濃度為85%乙醇，超聲波功率為90 W，提取時(shí)間為每次25 min，提取次數(shù)2 次時(shí)，此時(shí)枸杞黃酮提取率為2.267%。在優(yōu)化的條件下，研究不同產(chǎn)地、品種枸杞樣品及15 種市售枸杞黃酮含量差異，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地、品種枸杞黃酮含量存在顯著性差異，甘肅產(chǎn)枸杞黃酮含量顯著高于寧夏與青海產(chǎn)枸杞；寧夏小顆粒枸杞黃酮含量高于新品種5 號與中寧枸杞；對市售枸杞，黃酮提取率差異性顯著，但部分品牌枸杞間黃酮提取率差異性不顯著；主成分分析結(jié)果表明枸杞物理參數(shù)和黃酮提取率可實(shí)現(xiàn)對不同產(chǎn)地、品種和市售枸杞樣品的區(qū)分。