應(yīng)瑞峰，黃梅桂，王耀松，吳彩娥，李婷婷，范龔健

（南京林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院，江蘇南京210037）

桑黃主要寄生在桑樹(shù)上，它是一種真菌，有些地方也叫作桑臣、桑耳或鮑氏層孔菌，并且有著黃褐色的子實(shí)體，因而得名。桑黃在分類上屬于擔(dān)子菌門、銹荸孔菌科、針層孔菌屬。在我國(guó)桑黃主要寄生于楊樹(shù)、松樹(shù)、柳樹(shù)、杜鵑等樹(shù)的樹(shù)干上，桑黃分布比較廣泛，主要集中分布在我國(guó)東北、西北、華北等地，尤其在原始森林中。桑黃早在2000 多年前，記載桑黃用作昂貴的中藥，其最大的特點(diǎn)就是：桑黃具有非常突出的調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，延緩衰老和抗腫瘤的效果[1-2]。桑黃子實(shí)體具有很好的抗腫瘤效果，很多研究結(jié)果表明，桑黃提取物能有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)和繁殖，是目前國(guó)際上各國(guó)公認(rèn)的生物抗癌領(lǐng)域中效率最高的真菌，因此桑黃成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界研究的熱點(diǎn)。桑黃的主要化學(xué)成分有很多，主要是：萜類、黃酮類和多糖等。許多研究表明多糖是桑黃最重要的生物活性成分，它在抑制腫瘤細(xì)胞方面作用尤其顯著，它不但存在于桑黃子實(shí)體，也存在于桑黃的菌絲體中和桑黃的發(fā)酵液中[3-4]。隨著產(chǎn)業(yè)的升級(jí)進(jìn)步，超聲波微波輔助提取技術(shù)被應(yīng)用于真菌或植物活性物質(zhì)的提取，特別是一些富有前瞻性的產(chǎn)業(yè)化工廠也將其應(yīng)用于真菌多糖的提取，但得率仍然比較低，有一些研究也應(yīng)用微波輔助技術(shù)，技術(shù)有著反應(yīng)條件溫和、周期短、成本低等優(yōu)勢(shì)，也有報(bào)道此技術(shù)運(yùn)用到真菌多糖的提取中[5-6]，將超聲波微波技術(shù)運(yùn)用到桑黃多糖提取的研究卻是非常少的。本次研究中應(yīng)用超聲波協(xié)同微波法對(duì)桑黃進(jìn)行多糖的提取，尋找最佳提取條件，最大限度的提高桑黃多糖得率，并且為桑黃產(chǎn)業(yè)化提供可行的理論基礎(chǔ)。本研究應(yīng)用復(fù)合超聲波微波法對(duì)桑黃子實(shí)體多糖進(jìn)行提取，然后對(duì)提取得到的多糖進(jìn)行活性研究，其研究結(jié)果能為桑黃開(kāi)發(fā)和綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑黃子實(shí)體：浙江省淳安千島湖桑都食用菌合作社；超純水：南京林業(yè)大學(xué)食品實(shí)驗(yàn)室自制；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxido，DMSO）：Sigma 公司；乙醇（純度 95%）：南京化學(xué)試劑公司；96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板：Costar 公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清：Gibco 公司；EnoGeneCellTMCounting Kit-8（CCK-8）細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒：南京恩晶生物科技有限公司；紫杉醇：中國(guó)四川太極制藥公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XO-SM200 超聲波微波輔助提取設(shè)備：中國(guó)南京先歐儀器制造有限公司；QT-58A 紫外檢測(cè)儀：中國(guó)上海琪特儀器公司；TU-1800PC 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：中國(guó)北京普析通用公司；SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)公司；MCO-15AC 二氧化碳培養(yǎng)箱：日本三洋SANYO；XD-202 熒光倒置生物顯微鏡：中國(guó)南京江南永新公司；Thermo MK3 酶標(biāo)儀：美國(guó)熱電有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 桑黃多糖提取工藝流程

桑黃子實(shí)體→粉碎→超聲波微波復(fù)合提取→過(guò)濾→80%醇沉→離心→沉淀復(fù)溶→醇沉→干燥→粗多糖

1.3.2 桑黃多糖提取工藝單因素試驗(yàn)

1）提取時(shí)間的選擇：稱取5 份2.0 g 的桑黃菌干粉，每份樣品分別注入100 mL 的蒸餾水，液料比為50 mL/g，設(shè)定超聲波功率為360 kW，微波功率為100 W，提取溫度為100 ℃，在此條件下，提取時(shí)間設(shè)定為 20、30、40、50、60 min，然后測(cè)定樣品的多糖含量，并計(jì)算多糖的提取率。

2）提取液料比的選擇：精確的稱取5 份2.0 g 的桑黃菌干粉，設(shè)定超聲波的功率為360 kW，提取時(shí)間設(shè)定為40 min，提取溫度為100 ℃，5 份樣品的液料比分別以 20、30、40、50、60 mL/g，提取結(jié)束后，分別測(cè)定提取物的多糖的含量和多糖的提取率。

3）超聲波功率對(duì)桑黃多糖提取率的影響：分別稱取2.0 g 桑黃菌粉5 份，液料比為50 mL/g，按比例加入蒸餾水，超聲波功率設(shè)定為 60、180、360、720、900 kW，微波功率為100 W，提取溫度為100 ℃，處理時(shí)間設(shè)定為40 min，分別測(cè)定多糖的含量和多糖提取率。

4）微波功率對(duì)桑黃多糖提取率的影響：試驗(yàn)中稱取5 份桑黃菌粉2.0 g，加入蒸餾水，溶液的液料比為50mL/g。設(shè)定超聲波功率為360kW，提取溫度為100℃，分別在微波功率 100、200、300、400、500 W 條件下，處理40 min，提取結(jié)束后測(cè)定樣品中多糖的含量和多糖的提取率。

1.3.3 桑黃多糖提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，然后在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用三因素三水平的提取試驗(yàn)見(jiàn)表1，按L9（34）的正交設(shè)計(jì)方案，設(shè)計(jì)并且實(shí)施多糖提取的正交試驗(yàn)，每組試驗(yàn)都要重復(fù)3 次以上。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.4 總糖含量與蛋白質(zhì)含量測(cè)定

本次試驗(yàn)采用的是苯酚－硫酸法，選擇以葡萄糖為試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)試驗(yàn)測(cè)定樣本總糖含量；本試驗(yàn)中，選擇以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)法，測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的總含量。

1.4 試驗(yàn)條件

1.4.1 桑黃多糖體外抗氧化活性

1）清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH）能力測(cè)定：稱取樣品分別配制成 12.5、25、50、100、200、400、800 μg/mL 濃度的溶液。配制 0.1 mmol/L DPPH 溶液。準(zhǔn)確移取各個(gè)待測(cè)液2.0 mL 于10 mL 透明試管中。使用移液管分別加入2.0 mL，0.1 mmol/LDPPH 溶液，用振蕩機(jī)混勻，放置一段時(shí)間，再用紫外分光光度計(jì)測(cè)定517 nm 波長(zhǎng)處的吸光度，記為A樣品。做3 組平行試驗(yàn)。準(zhǔn)確移取各濃度待測(cè)液2.0 mL 與相應(yīng)溶劑（水）2.0 mL，再用振蕩機(jī)混勻，放置一段時(shí)間，測(cè)定在517 nm 波長(zhǎng)處的吸光度，記為A對(duì)照。準(zhǔn)確移取DPPH溶液2.0 mL 與相應(yīng)溶劑（無(wú)水乙醇）2.0 mL，振蕩機(jī)混勻，測(cè)定在517 nm 波長(zhǎng)處的吸光度，記為A空白。為了分析試驗(yàn)結(jié)果，VC作為陽(yáng)性對(duì)照物，按以下公式計(jì)算DPPH 自由基清除率：

式中：I 為樣品對(duì)超氧負(fù)離子的清除率，%；A樣品為樣品測(cè)試值；A空白為空白值；A對(duì)照為對(duì)照值。

2）清除超氧負(fù)離子的測(cè)定：樣品被鹽酸三羥甲基氨基甲烷（Tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris-HCl）緩沖液（pH 值為 8.0，濃度為 16 mmol/L）溶解，制成不同濃度的溶液。氯化硝基四氮唑藍(lán)（nitrotetrazole chloride blue，NBT）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nionamide adenine dinucleotide，NADH） 均 用 Tris-HCl 緩 沖 液（pH8.0，16 mmol/L）溶解，濃度分別為 300、468 μmol/L；然后用蒸餾水溶解吩嗪硫酸甲酯（phenazine methyl sulfate，PMS），其濃度為 60 μmol/L。取 1.50 mL 不同濃度的樣品溶液，0.50 mL NBT，0.5 mL NADH，混勻，加入0.5 mL 的PMS，然后將桑黃樣品更換為1.50 mL 的緩沖溶液，作為試驗(yàn)中的空白對(duì)照。然后按照相同的操作方法，在25 ℃的水浴中放置5min 后，測(cè)定樣品的吸光度（波長(zhǎng)為560 nm），每次操作重復(fù)3 次以上。試驗(yàn)結(jié)束后，計(jì)算超氧負(fù)離子清除率I，計(jì)算公式為：

式中：I 為試驗(yàn)樣品對(duì)超氧負(fù)離子的清除率，%；A樣品為樣品的測(cè)試值；A空白為空白對(duì)照值。

1.4.2 桑黃多糖體外抗腫瘤活性

CCK-8 染色法檢測(cè)細(xì)胞活力：試驗(yàn)中挑選活細(xì)胞比例90%以上的細(xì)胞，進(jìn)行樣品測(cè)試。細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)采用EnoGeneCelTMCounting Kit-8（CCK-8）細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒。制成濃度為1×105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，試驗(yàn)中，在96 孔板中，每一個(gè)孔中加入100 μL 細(xì)胞懸液；然后將96 孔板放置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為24 h；每一個(gè)孔，分別加入100 μL相應(yīng)的含藥物的培養(yǎng)基。試驗(yàn)中，要求同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組和溶媒對(duì)照組，每一個(gè)組要求5 復(fù)孔；96 孔板放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為37 ℃，CO2濃度為 5%，培養(yǎng) 72 h；每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，試驗(yàn)中將培養(yǎng)板放置在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，時(shí)間設(shè)定為4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm 處的OD 值，計(jì)算桑黃多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2，人宮頸癌細(xì)胞Hela 細(xì)胞的抑制率及IC50值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 12.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（t 檢驗(yàn)），分析組間差異。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波微波協(xié)同作用

液料比對(duì)桑黃子實(shí)體多糖得率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 液料比對(duì)桑黃子實(shí)體多糖得率的影響Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on the extraction yield of polysaccharides

由圖1 可知，桑黃多糖熱水提取過(guò)程中，隨著液料比增大，桑黃多糖得率顯著增高，較高的液料比加快了水的傳質(zhì)過(guò)程，當(dāng)液料比為50 mL/g 時(shí)，桑黃多糖得率最高，但高于50 mL/g 時(shí)，得率又會(huì)下降，因此，選擇液料50 mL/g 比較合適。

超聲功率對(duì)桑黃子實(shí)體多糖得率的影響見(jiàn)圖2。

如圖2 所示，隨著超聲波功率的加大，桑黃多糖得率大幅的增加，功率在360 kW 時(shí)多糖的得率達(dá)到最高值，之后多糖得率迅速下降，大功率超聲波對(duì)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破壞作用較大，使桑黃多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞或者使其降解。

微波功率對(duì)桑黃子實(shí)體多糖得率的影響見(jiàn)圖3。

如圖3 所示，微波功率在200 W 時(shí)，多糖的提取率最高，超過(guò)200 W，提取率開(kāi)始下降。

圖2 超聲功率對(duì)桑黃子實(shí)體多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power onthe extraction yield of polysaccharides

圖3 微波功率對(duì)桑黃子實(shí)體多糖得率的影響Fig.3 Effect ofmicrowave power on the extraction yield of polysaccharides

提取時(shí)間對(duì)桑黃子實(shí)體多糖得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)桑黃子實(shí)體多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasound treatment time on the extraction yield of polysaccharides

桑黃子實(shí)體提取過(guò)程中，由圖4 可知，多糖得率隨著提取時(shí)間增加而增大，30 min 內(nèi)的增加趨勢(shì)明顯，30 min 時(shí)達(dá)到最大值，30 min 之后多糖得率反而緩慢下降。當(dāng)超聲波與微波作用于桑黃時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)使桑黃中的多糖成分受到一定的破壞，而使得率降低。提取時(shí)間對(duì)桑黃子實(shí)體多糖得率的影響，試驗(yàn)結(jié)果顯示隨著溫度的逐漸升高，總糖得率逐漸增加。溫度越高提取效果越好，最佳提取溫度選為100 ℃。

按照液料比50 mL/g，提取溫度為100 ℃，以超聲波功率、微波功率、提取時(shí)間等作為影響多糖提取率的因素，試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，進(jìn)一步研究超聲波微波協(xié)同輔助提取桑黃子實(shí)體多糖的最優(yōu)提取工藝參數(shù)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)方差分析表見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Results and range analysis of orthogonal array design

表3 正交試驗(yàn)方差分析表Table 3 Analysis of variance in orthogonal array design

如表2 和表3 所示，顯示試驗(yàn)顯著性最強(qiáng)的單因素為超聲波功率，其次是提取時(shí)間，最后為微波功率。由試驗(yàn)結(jié)果可得超聲波微波輔助提取法的最佳工藝為超聲功率360 W、微波功率100 W、提取時(shí)間30 min、液料比50 mL/g 時(shí)，多糖得率最高，達(dá)10.6%。

在提取過(guò)程當(dāng)中超聲波能夠在提取溶液中產(chǎn)生空穴現(xiàn)象，這種空穴現(xiàn)象可以加速桑黃細(xì)胞內(nèi)多糖成分的快速溶出，另外也要考慮超聲波的次級(jí)效應(yīng)，比如我們非常熟悉的機(jī)械振動(dòng)和化學(xué)效應(yīng)等，這些效應(yīng)也可以加速桑黃細(xì)胞壁多糖的擴(kuò)散釋放，多糖從真菌組織釋放后超聲波使其充分與溶劑混合。微波可快速穿透桑黃，也可以被桑黃吸收產(chǎn)生熱。所謂的超聲波微波協(xié)同技術(shù)就是將超聲振動(dòng)與微波兩種不同的作用方式結(jié)合在一起，有效的利用微波的高能作用與超聲波振動(dòng)的空穴作用，對(duì)桑黃進(jìn)行快速、高效、可靠的提取。與其他提取方法相比，比如熱水提取法，超聲波微波輔助提取法，是基于超聲波和微波場(chǎng)的瞬時(shí)穿透性加熱方式，它是一種更有效更快速的提取法，現(xiàn)在它被廣泛應(yīng)用植物活性物質(zhì)的提取，被提取組分在微波場(chǎng)作用下迅速產(chǎn)生大量熱能，可加速植物組織內(nèi)被提取組分由固體內(nèi)部向固液界面擴(kuò)散的速率。超聲波微波提取顯著的優(yōu)于傳統(tǒng)熱水提取法，此項(xiàng)技術(shù)有效提高了提取的選擇性，減少了提取時(shí)間。傳統(tǒng)熱水提取法和超聲波微波提取法提取多糖后組織的顯微結(jié)構(gòu)，證實(shí)超聲波和微波的協(xié)同效應(yīng)對(duì)真菌細(xì)胞具有膨爆作用。超聲波微波協(xié)同條件下真菌多糖的提取是一快速的組織崩解過(guò)程，這一過(guò)程使提取時(shí)間縮短，而且多糖得率也能有效提高，多糖的生物活性也能一定程度的提高[7-8]。

2.2 桑黃多糖活性研究

對(duì)熱水法和超聲波微波輔助提取的多糖進(jìn)行含量測(cè)定，熱水法和超聲波微波輔助提取的多糖含量分別為20.1%和21.4%。對(duì)熱水法和超聲波微波輔助提取的多糖進(jìn)行清除DPPH 和清除超氧負(fù)離子的活性測(cè)定。桑黃多糖對(duì)DPPH 的清除率曲線見(jiàn)圖5。

圖5 桑黃多糖對(duì)DPPH 自由基的清除率曲線Fig.5 Scavenging curves of the polysaccharides from Phellinus igniarius DPPH free radicals

如圖5 所示，隨著桑黃多糖濃度的逐漸增加，其清除DPPH 自由基的能力增強(qiáng)，而且清除效果與桑黃質(zhì)量濃度之間存在明顯的量效關(guān)系。

桑黃多糖對(duì)超氧陰離子清除率曲線見(jiàn)圖6。

如圖6 所示，桑黃多糖清除超氧負(fù)離子的能力雖然不及VC，但也呈現(xiàn)很強(qiáng)的抗氧化性。超聲波微波輔助提取桑黃多糖其抗氧化活性顯著高于熱水法提取的多糖。

圖6 桑黃多糖對(duì)超氧陰離子清除率曲線Fig.6 Scavenging curves of the polysaccharides from Phellinus igniarius superoxide anion radicals

桑黃多糖質(zhì)量濃度對(duì)Hela 癌細(xì)胞的抑制率見(jiàn)圖7。

圖7 多糖質(zhì)量濃度對(duì)Hela 癌細(xì)胞的抑制率Fig.7 Effects of different polysaccharide concentrations on inhibitive rate of cancel cell Hela

如圖7 所示，對(duì)熱水法和超聲波微波輔助提取的多糖進(jìn)行抗腫瘤對(duì)比試驗(yàn)可知，桑黃多糖對(duì)對(duì)人宮頸癌細(xì)胞Hela 有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。熱水法提取的桑黃多糖其 IC50值為 0.95 mg/mL，在濃度 1.5 mg/mL 時(shí)Hela 的抑制率為60.74%；超聲波微波法提取的桑黃多糖其IC50值為0.81 mg/mL，在濃度1.5 mg/mL 時(shí)Hela的抑制率為65.20 %，超聲波微波提取桑黃多糖其抗腫瘤活性更強(qiáng)。陽(yáng)性對(duì)照藥紫杉醇注射液在濃度0.01 mg/mL 時(shí)Hela 的抑制率為73.73%。對(duì)比紫杉醇注射液，桑黃多糖抗腫瘤活性雖未超過(guò)，但也表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗腫瘤活性[8-10]。

桑黃多糖質(zhì)量濃度對(duì)HepG2 癌細(xì)胞的抑制率見(jiàn)圖8。

從圖8 可知，桑黃多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2 亦具有一定的細(xì)胞毒活性，熱水法提取的桑黃多糖其IC50值為0.79 mg/mL，在濃度1.5 mg/mL 時(shí)抑制率為66.01%；超聲波微波法輔助提取的桑黃多糖其IC50值為0.60 mg/mL，在濃度1.5 mg/mL 時(shí)抑制率為68.20%，超聲波微波提取桑黃多糖其抗腫瘤活性更強(qiáng)。陽(yáng)性對(duì)照藥紫杉醇注射液在濃度0.01 mg/mL 時(shí)HepG2 的抑制率為73.07%。對(duì)比紫杉醇注射液，桑黃多糖抗腫瘤活性雖未超過(guò)，但也表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗腫瘤活性[8-10]。試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波微波輔助提取不但效率高，而且可以提高多糖的活性。

圖8 多糖質(zhì)量濃度對(duì)HepG2 癌細(xì)胞的抑制率Fig.8 Effects of different polysaccharide concentrations on inhibitive rate of cancel cell HepG2

3 結(jié)論

相比傳統(tǒng)熱水提取法，應(yīng)用超聲波微波復(fù)合法輔助提取桑黃多糖，有效提高了提取率[11-12]，多糖得率最高達(dá)到10.6%。正交試驗(yàn)結(jié)果表明不同提取因素對(duì)桑黃子實(shí)體多糖得率的影響順序?yàn)椋撼暪β剩咎崛r(shí)間＞微波功率。熱水提取法與超聲波微波輔助提取法，這兩種方法提取的桑黃多糖，進(jìn)行了抗氧化及抗腫瘤活性研究，發(fā)現(xiàn)通過(guò)超聲波微波輔助提取的桑黃多糖有較好的抗氧化和抗腫瘤活性[11-12]。