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        基于非均相反應(yīng)的新型固定化酶的構(gòu)建及催化合成植物甾醇酯的研究

        2019-11-14 06:34:00劉鑫龍王立暉劉鵬安娜陳光輝趙瑞杭忠霞
        食品研究與開發(fā) 2019年21期
        關(guān)鍵詞:植物

        劉鑫龍,王立暉,劉鵬,安娜,陳光輝,趙瑞,杭忠霞

        (天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院,天津300350)

        植物甾醇,能夠抑制人體對膽固醇的吸收,降低心血管疾病的發(fā)病率,目前已經(jīng)被添加到多種食物中[1]。然而植物甾醇的高熔點和難溶于水的特性導(dǎo)致其很難被人體吸收利用[2]。將植物甾醇轉(zhuǎn)化為脂肪酸酯,形成稠度與食用脂肪和油脂相似的半流質(zhì)液體,進(jìn)而與含脂肪的食物結(jié)合,可以有效提高甾醇的生物利用率[3]。以植物甾醇與α-亞麻酸為底物合成的亞麻酸甾醇酯,不僅可以促進(jìn)植物甾醇消化吸收,其中含有的α-亞麻酸也具有降血脂,保護(hù)肝臟等特殊功能。生物酶法合成植物甾醇酯不僅反應(yīng)條件溫和、能耗低、副產(chǎn)物少,而且無溶劑污染[4]。然而游離酶價格高、穩(wěn)定性差、難與底物分離,導(dǎo)致生產(chǎn)成本很高。通過將酶固定化,可以增強游離酶的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性,提高生物酶在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用價值。Zheng 等[5]將CRL 脂肪酶固定在二氧化硅顆粒上以提高其穩(wěn)定性,并用于合成植物甾醇酯。在最優(yōu)條件下(150 μmol/mL植物甾醇、1 ∶1.5 醇酸摩爾比、55 ℃、24 h)植物甾醇轉(zhuǎn)化率為95.3%。固定化酶在重復(fù)使用7 次后,仍保留有78.6%的初始活性。但反應(yīng)過程中需要持續(xù)高轉(zhuǎn)速攪拌,而且催化劑重復(fù)使用時需要離心操作實現(xiàn)分離,必然導(dǎo)致操作復(fù)雜和成本的增大。

        Pickering 乳液是利用固體顆粒作為乳化劑構(gòu)建的油包水(w/o)或水包油(o/w)狀的兩相體系,可以將酶分子包含在水相中實現(xiàn)酶的固定化。脂肪酶是一種界面反應(yīng)酶[6],在兩相界面處催化活性最高,當(dāng)含酶Pickering 乳液中催化非均相反應(yīng)時,脂肪酶會自發(fā)富集在油水兩相界面處,充分利用兩相中的底物進(jìn)行反應(yīng),展現(xiàn)高效的催化性能。此外,Pickering 乳液催化劑使用完畢后僅需靜置片刻,即會沉入容器底部實現(xiàn)與反應(yīng)體系的分離,回收再利用因而變得非常容易。Jiang課題組[7]將以介孔硅固定化脂肪酶為乳化劑構(gòu)建Pickering 乳液催化劑,并用于催化植物甾醇酯合成。生物柴油最大產(chǎn)率為95.8 %(水含量0.65%、酸醇摩爾比2 ∶1、酶用量 150 mg、30 ℃)。乳液催化劑在重復(fù)使用15 次后,產(chǎn)率為 88.6%。Wei 課題組[8]采用 Pickering 乳液固定化絲酵母脂肪酶催化水解外消旋酯,在無攪拌的條件下其絕對酶活(4.5 U/mg)是游離酶(0.2 U/mg)的22.5 倍。該Pickering 乳液固定酶重復(fù)使用27 次后仍保留91.7%的初始催化能力。據(jù)我們所知,將Pickering 乳液固定化脂肪酶用于催化合成亞麻酸甾醇酯得研究還未有報道。

        本項目基于異辛烷和脂肪酶水溶液的兩相狀態(tài),以多壁碳納米管為乳化劑構(gòu)建一種新型的Pickering乳液固定化酶,并用于催化合成亞麻酸甾醇酯,通過單因素試驗篩選最優(yōu)反應(yīng)條件,以期得到一種高效的生產(chǎn)工藝,為酶促合成植物甾醇酯的工業(yè)化生產(chǎn)提供借鑒。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes,MWCNTs):中國科學(xué)院成都有機化學(xué)有限公司;皺褶假絲酵母脂肪酶(Candida rugosa lipase,CRL,15 U/mg):杭州創(chuàng)科生物科技有限公司;異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,F(xiàn)ITC):百靈威科技有限公司;植物甾醇(植物甾醇73.96%,菜籽甾醇17%,豆甾醇5%,菜油甾醇1 %,甾醇總量95.19 %):西安藍(lán)天生物工程有限公司;亞麻酸(80 %):河南利諾生化有限責(zé)任公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        超聲波細(xì)胞粉粹機(BILON-250Y):北京比朗實驗設(shè)備有限公司;氣相色譜儀(SP-1000):北京北分瑞利(集團(tuán))色譜儀器中心;激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP5):Leica Microsystems 有限公司;掃描電子顯微鏡(Nova NanoSEM 450):Field Electron and Ion Company(FEI);激光粒度分析儀(LS-909):珠海歐美克儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 Pickering 乳液催化劑的制備

        將20 mg MWCNTs 置于盛有3 mL 異辛烷的耐壓瓶中,再加入1 mL 含CRL 脂肪酶(9 U)的磷酸緩沖液(pH 7.0、0.1 mol/L),用超聲波細(xì)胞粉碎機超聲5 min(超聲 1 s,停歇 2 s,超聲溫度 30 ℃,功率 18 W),即可獲得Pickering 乳液催化劑,命名為CRL@PE。

        1.3.2 亞麻酸甾醇酯的合成與檢測

        在盛有CRL@PE 的耐壓瓶中,加入植物甾醇30 μmol,將其置于55 ℃水浴鍋中加熱5 min 以促進(jìn)甾醇溶解。向耐壓瓶中加入30 μmol 的α-亞麻酸,并置于一定溫度下的恒溫水浴鍋中反應(yīng)240 min。取10 μL 樣品通過氣相色譜分析計算植物甾醇的轉(zhuǎn)化率(公式1)[5]。每個樣品檢測3 次。

        式中:A 為甾醇峰面積和(β-谷甾醇+菜籽甾醇+菜油甾醇+豆甾醇);B 為甾醇酯峰面積和;1.63 為甾醇酯平均分子量與甾醇平均分子量的比值。

        氣相色譜條件:毛細(xì)管柱型號為安捷倫DB-5 HT(15.0 m×320 μm×0.10 μm)。氣體流速 3.5 mL/min。進(jìn)樣器溫度320 ℃,氫火焰離子化檢測器溫度350 ℃。色譜柱起始溫度 210 ℃,2 min 后以 10 ℃/min 的速度升溫至320 ℃,并保持15 min。最后再以10 ℃/min 的速度升溫至350 ℃。

        1.3.3 亞麻酸甾醇酯合成的單因素優(yōu)化

        為了提高CRL@PE 催化能力和植物甾醇轉(zhuǎn)化率,采用單因素試驗分析含水率(2.0%~7.0%)、酸醇摩爾比(1 ∶1~5 ∶1)、酶用量(3 U~18 U)、反應(yīng)溫度(25 ℃~50 ℃)和反應(yīng)時間(0~24 h)對亞麻酸甾醇酯合成反應(yīng)的影響,并篩選最優(yōu)反應(yīng)條件。

        1.3.4 CRL@PE 性能評價

        在眾多酶法合成植物甾醇酯工藝中,以植物甾醇轉(zhuǎn)化率為評價指標(biāo),綜合考慮生產(chǎn)成本,比較最優(yōu)反應(yīng)條件下CRL@PE 與其他催化劑的性能差異。

        1.3.5 CRL@PE 的穩(wěn)定性測定

        每一輪亞麻酸甾醇酯合成反應(yīng)結(jié)束后,將耐壓瓶靜置,待體系分層后小心的去除CRL@PE 中95%的異辛烷,然后用等量的新的異辛烷多次洗滌剩余物質(zhì),直至植物甾醇或植物甾醇酯去除干凈(氣相色譜分析中無底物和產(chǎn)物信號存在)。加入新的異辛烷、植物甾醇和亞麻酸(與第一輪反應(yīng)中用量相等),開始下一批次反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,用氣相色譜分析和計算植物甾醇轉(zhuǎn)化率。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 CRL@PE的表征

        圖1 為CRL@PE 乳液的形貌圖。

        圖1 CRL@PE 乳液的形貌圖Fig.1 The morphology of CRL@PE emulsion

        在光學(xué)顯微鏡的觀察下(4×10 倍),CRL@PE 乳液由眾多球狀液滴組成,液滴直徑約 50 μm~80 μm(圖1a)。為了更細(xì)致的觀察CRL@PE 的形貌,利用1.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的瓊脂水溶液作為水相構(gòu)建乳液,室溫靜置至乳液液滴凝固后,借助掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM) 觀察 CRL@PE 液滴形貌,見圖1b。從圖1b 中可以確定,每個CRL@PE 液滴表面均覆蓋一層由若干無序、相互交織的納米管構(gòu)成的外殼。因為瓊脂的凝固膨脹導(dǎo)致液滴形狀為不規(guī)則球體。為了確定乳液類型和脂肪酶CRL 在乳液中的位置,將CRL 用異硫氰酸熒光素標(biāo)記后溶于磷酸鹽緩沖液中作為水相,構(gòu)建CRL@PE,并通過共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy,CLSM)觀察現(xiàn)象,見圖1c。在圖1c 中,被標(biāo)記的脂肪酶CRL 發(fā)出綠光(激發(fā)波長495 nm~545 nm),呈現(xiàn)一個個標(biāo)準(zhǔn)的圓形。鑒于CRL 僅溶于水,且異辛烷未被標(biāo)記(無熒光現(xiàn)象),可以判斷CRL@PE 是油包水(w/o)的類型。

        2.2 亞麻酸甾醇酯合成條件的單因素優(yōu)化

        采用CRL@PE 催化植物甾醇和亞麻酸酯化反應(yīng)合成亞麻酸甾醇酯,反應(yīng)過程受到乳液含水率、酸醇摩爾比、CRL 用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的影響。為了獲得最大的植物甾醇轉(zhuǎn)化率,本部分采用單因素法初步判定最優(yōu)的反應(yīng)條件。

        2.2.1 含水率的優(yōu)化

        研究磷酸緩沖液用量(水相)對乳液制備和植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響,并用含水率表示(%v/wt.,mL/100 mg MWCNTs),結(jié)果如圖2 所示。

        圖2 含水率對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of the water fraction on conversion efficiency of phytosterols

        隨著含水率從2.0%增加到4.0%,植物甾醇轉(zhuǎn)化率(24 h)也從63.0%增長到80.4%。然而,當(dāng)含水率進(jìn)一步增加至7.0 %時,植物甾醇轉(zhuǎn)化率卻下降到了62.0%。這是因為含水率較低時,大量納米管堆積在液滴表面,形成厚厚的外殼,阻礙底物與界面處的酶分子接觸,抑制酯化反應(yīng)的發(fā)生。當(dāng)含水率超過4.0%,水相過量而納米管數(shù)量不足,導(dǎo)致CRL@PE 液滴不穩(wěn)定,聚并變大導(dǎo)致界面面積減小。同時過量自由水(未用于構(gòu)建乳液液滴的部分)的存在促進(jìn)了植物甾醇酯的分解。因此,選擇含水率4.0%作為后續(xù)試驗條件。

        2.2.2 酸醇比的優(yōu)化

        植物甾醇和亞麻酸的酯化反應(yīng)從化學(xué)平衡角度分析,最佳配比為1 ∶1,但增大亞麻酸用量,可以提高植物甾醇的轉(zhuǎn)化率,酸醇摩爾比對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響如圖3 所示。

        圖3 酸醇摩爾比對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of the molar ratio of linolenic acid to phytosterol on conversion efficiency of phytosterols

        隨著酸醇摩爾比的增加,植物甾醇轉(zhuǎn)化率也隨之增長,但增長趨勢在摩爾比為2 ∶1 時達(dá)到最大,此時植物甾醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高值為85.9 %。綜合考慮成本因素,選擇酸醇摩爾比2 ∶1 作為后續(xù)反應(yīng)的操作條件。

        2.2.3 酶用量的優(yōu)化

        酶用量對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響如圖4 所示。

        圖4 酶用量對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of the dosage of lipase on conversion efficiency of phytosterols

        植物甾醇轉(zhuǎn)化率隨著酶用量的增加(3 U~18 U)迅速上升。而酶用量的持續(xù)增加(>15 U),卻會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低。這可能歸結(jié)于兩個原因:1)在CRL@PE 中脂肪酶大量聚集在兩相界面,改變了界面處酶分子的微環(huán)境,導(dǎo)致催化性能受到影響;2)脂肪酶也可能堆積在水相核心,因接觸不到底物而難以發(fā)揮效力。綜上所述,選擇酶用量12 U 作為后續(xù)反應(yīng)的催化劑用量。

        2.2.4 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的優(yōu)化

        溫度對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響如圖5 所示。

        圖5 反應(yīng)溫度對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on conversion efficiency of phytosterols

        隨著溫度的增加,植物甾醇轉(zhuǎn)化率逐漸增加;在30 ℃時達(dá)到最大值93.2%(12 h);此后繼續(xù)提高溫度,轉(zhuǎn)化率開始下降,而且溫度越高,轉(zhuǎn)化率下降越嚴(yán)重。這是因為低溫或較高的溫度會抑制酶的催化性能,導(dǎo)致反應(yīng)速度降低;高溫會促使酶蛋白變性,脂肪酶因結(jié)構(gòu)改變而失活。因此,選擇30 ℃作為后續(xù)試驗的反應(yīng)溫度。因此,本試驗中采用30 ℃作為反應(yīng)溫度。

        隨著反應(yīng)時間的推移,植物甾醇轉(zhuǎn)化率逐漸提高,達(dá)到最大值后基本保持不變,證明反應(yīng)即將達(dá)到平衡點??紤]成本因素,選擇12 h 作為最佳反應(yīng)時間,此時轉(zhuǎn)化率為93.2%。

        2.2.5 CRL@PE 性能評價

        表1 顯示了CRL@PE 與其他酶催化劑在合成植物甾醇酯反應(yīng)中的性能差異。以植物甾醇轉(zhuǎn)化率高低為評價標(biāo)準(zhǔn),綜合考慮能耗和生產(chǎn)成本,CRL@PE 法合成植物甾醇酯具有反應(yīng)條件溫和、底物轉(zhuǎn)化效率高、催化劑性能優(yōu)異的特點,是一種相對高效的亞麻酸甾醇酯生產(chǎn)工藝。

        表1 CRL@PE 與其他酶催化劑合成植物甾醇酯性能的比較Table 1 Comparison of the performance of CRL@PE with other lipase catalysts in synthesis of phytosterol esters

        2.3 CRL@PE的穩(wěn)定性

        重復(fù)使用性能是評價催化劑應(yīng)用價值的一個重要參數(shù)。圖6 顯示了CRL@PE 在催化植物甾醇酯合成過程中的性能變化。

        圖6 CRL@PE 的重復(fù)使用性Fig.6 The reusability of CRL@PE

        CRL@PE 重復(fù)使用10 次后,植物甾醇轉(zhuǎn)化率為92.06%,保持不變。此時CRL@PE 液滴大小基本未受到重復(fù)使用的影響。使用15 次后,轉(zhuǎn)化率為77.3%。由此可見,CRL@PE 具有良好的重復(fù)使用性。

        將CRL@PE 置于不同溫度下水浴鍋中恒溫加熱3 h 后,于最優(yōu)條件下催化合成植物甾醇酯,分析CRL@PE 熱穩(wěn)定性,結(jié)果如圖7 所示。

        圖7 CRL@PE 的熱穩(wěn)定性Fig.7 The thermal stability of CRL@PE

        在30 ℃時轉(zhuǎn)化率最大為92.2%。而任何微小的溫度變化都會導(dǎo)致活性下降。長期接觸溫度高于30 ℃會損害CRL@PE 的結(jié)構(gòu),然后破壞和水平從而減少活動將隨著溫度增加而增加。低溫(<30 ℃)會影響傳質(zhì)速度,導(dǎo)致活動減少。

        3 結(jié)論

        本試驗以納米管為乳化劑,基于非均相反應(yīng)構(gòu)建了一種新型的Pickering 乳液催化劑CRL@PE,其具有油包水的結(jié)構(gòu),液滴直徑為40 μm~60 μm。同時本課題組于國內(nèi)首次研究利用乳液催化劑合成亞麻酸甾醇酯的工藝過程,其最優(yōu)反應(yīng)條件為:含水率4.0%、酸醇摩爾比 2 ∶1(植物甾醇 30 μmol)、酶用量 12 U、溫度30 ℃、反應(yīng)時間10 h,此時植物甾醇最大轉(zhuǎn)化率為92.13%。此外,CRL@PE 具有良好的重復(fù)使用性和熱穩(wěn)定性,但對溫度變化較為敏感。

        下一階段將詳細(xì)研究CRL@PE 的催化特性,包括催化動力學(xué)、失活動力學(xué)。采用更加科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆椒ㄑ芯緾RL@PE 催化不同反應(yīng)時的最佳條件。

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