劉鑫龍，王立暉，劉鵬，安娜，陳光輝，趙瑞，杭忠霞

（天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津300350）

植物甾醇，能夠抑制人體對膽固醇的吸收，降低心血管疾病的發(fā)病率，目前已經(jīng)被添加到多種食物中[1]。然而植物甾醇的高熔點和難溶于水的特性導(dǎo)致其很難被人體吸收利用[2]。將植物甾醇轉(zhuǎn)化為脂肪酸酯，形成稠度與食用脂肪和油脂相似的半流質(zhì)液體，進(jìn)而與含脂肪的食物結(jié)合，可以有效提高甾醇的生物利用率[3]。以植物甾醇與α-亞麻酸為底物合成的亞麻酸甾醇酯，不僅可以促進(jìn)植物甾醇消化吸收，其中含有的α-亞麻酸也具有降血脂，保護(hù)肝臟等特殊功能。生物酶法合成植物甾醇酯不僅反應(yīng)條件溫和、能耗低、副產(chǎn)物少，而且無溶劑污染[4]。然而游離酶價格高、穩(wěn)定性差、難與底物分離，導(dǎo)致生產(chǎn)成本很高。通過將酶固定化，可以增強游離酶的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，提高生物酶在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用價值。Zheng 等[5]將CRL 脂肪酶固定在二氧化硅顆粒上以提高其穩(wěn)定性，并用于合成植物甾醇酯。在最優(yōu)條件下（150 μmol/mL植物甾醇、1 ∶1.5 醇酸摩爾比、55 ℃、24 h）植物甾醇轉(zhuǎn)化率為95.3%。固定化酶在重復(fù)使用7 次后，仍保留有78.6%的初始活性。但反應(yīng)過程中需要持續(xù)高轉(zhuǎn)速攪拌，而且催化劑重復(fù)使用時需要離心操作實現(xiàn)分離，必然導(dǎo)致操作復(fù)雜和成本的增大。

Pickering 乳液是利用固體顆粒作為乳化劑構(gòu)建的油包水（w/o）或水包油（o/w）狀的兩相體系，可以將酶分子包含在水相中實現(xiàn)酶的固定化。脂肪酶是一種界面反應(yīng)酶[6]，在兩相界面處催化活性最高，當(dāng)含酶Pickering 乳液中催化非均相反應(yīng)時，脂肪酶會自發(fā)富集在油水兩相界面處，充分利用兩相中的底物進(jìn)行反應(yīng)，展現(xiàn)高效的催化性能。此外，Pickering 乳液催化劑使用完畢后僅需靜置片刻，即會沉入容器底部實現(xiàn)與反應(yīng)體系的分離，回收再利用因而變得非常容易。Jiang課題組[7]將以介孔硅固定化脂肪酶為乳化劑構(gòu)建Pickering 乳液催化劑，并用于催化植物甾醇酯合成。生物柴油最大產(chǎn)率為95.8 %（水含量0.65%、酸醇摩爾比2 ∶1、酶用量 150 mg、30 ℃）。乳液催化劑在重復(fù)使用15 次后，產(chǎn)率為 88.6%。Wei 課題組[8]采用 Pickering 乳液固定化絲酵母脂肪酶催化水解外消旋酯，在無攪拌的條件下其絕對酶活（4.5 U/mg）是游離酶（0.2 U/mg）的22.5 倍。該Pickering 乳液固定酶重復(fù)使用27 次后仍保留91.7%的初始催化能力。據(jù)我們所知，將Pickering 乳液固定化脂肪酶用于催化合成亞麻酸甾醇酯得研究還未有報道。

本項目基于異辛烷和脂肪酶水溶液的兩相狀態(tài)，以多壁碳納米管為乳化劑構(gòu)建一種新型的Pickering乳液固定化酶，并用于催化合成亞麻酸甾醇酯，通過單因素試驗篩選最優(yōu)反應(yīng)條件，以期得到一種高效的生產(chǎn)工藝，為酶促合成植物甾醇酯的工業(yè)化生產(chǎn)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）：中國科學(xué)院成都有機化學(xué)有限公司；皺褶假絲酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase，CRL，15 U/mg）：杭州創(chuàng)科生物科技有限公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）：百靈威科技有限公司；植物甾醇（植物甾醇73.96%，菜籽甾醇17%，豆甾醇5%，菜油甾醇1 %，甾醇總量95.19 %）：西安藍(lán)天生物工程有限公司；亞麻酸（80 %）：河南利諾生化有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波細(xì)胞粉粹機（BILON-250Y）：北京比朗實驗設(shè)備有限公司；氣相色譜儀（SP-1000）：北京北分瑞利（集團(tuán)）色譜儀器中心；激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP5）：Leica Microsystems 有限公司；掃描電子顯微鏡（Nova NanoSEM 450）：Field Electron and Ion Company（FEI）；激光粒度分析儀（LS-909）：珠海歐美克儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Pickering 乳液催化劑的制備

將20 mg MWCNTs 置于盛有3 mL 異辛烷的耐壓瓶中，再加入1 mL 含CRL 脂肪酶（9 U）的磷酸緩沖液（pH 7.0、0.1 mol/L），用超聲波細(xì)胞粉碎機超聲5 min（超聲 1 s，停歇 2 s，超聲溫度 30 ℃，功率 18 W），即可獲得Pickering 乳液催化劑，命名為CRL@PE。

1.3.2 亞麻酸甾醇酯的合成與檢測

在盛有CRL@PE 的耐壓瓶中，加入植物甾醇30 μmol，將其置于55 ℃水浴鍋中加熱5 min 以促進(jìn)甾醇溶解。向耐壓瓶中加入30 μmol 的α-亞麻酸，并置于一定溫度下的恒溫水浴鍋中反應(yīng)240 min。取10 μL 樣品通過氣相色譜分析計算植物甾醇的轉(zhuǎn)化率（公式1）[5]。每個樣品檢測3 次。

式中：A 為甾醇峰面積和（β-谷甾醇+菜籽甾醇+菜油甾醇+豆甾醇）；B 為甾醇酯峰面積和；1.63 為甾醇酯平均分子量與甾醇平均分子量的比值。

氣相色譜條件：毛細(xì)管柱型號為安捷倫DB-5 HT（15.0 m×320 μm×0.10 μm）。氣體流速 3.5 mL/min。進(jìn)樣器溫度320 ℃，氫火焰離子化檢測器溫度350 ℃。色譜柱起始溫度 210 ℃，2 min 后以 10 ℃/min 的速度升溫至320 ℃，并保持15 min。最后再以10 ℃/min 的速度升溫至350 ℃。

1.3.3 亞麻酸甾醇酯合成的單因素優(yōu)化

為了提高CRL@PE 催化能力和植物甾醇轉(zhuǎn)化率，采用單因素試驗分析含水率（2.0%～7.0%）、酸醇摩爾比（1 ∶1～5 ∶1）、酶用量（3 U～18 U）、反應(yīng)溫度（25 ℃～50 ℃）和反應(yīng)時間（0～24 h）對亞麻酸甾醇酯合成反應(yīng)的影響，并篩選最優(yōu)反應(yīng)條件。

1.3.4 CRL@PE 性能評價

在眾多酶法合成植物甾醇酯工藝中，以植物甾醇轉(zhuǎn)化率為評價指標(biāo)，綜合考慮生產(chǎn)成本，比較最優(yōu)反應(yīng)條件下CRL@PE 與其他催化劑的性能差異。

1.3.5 CRL@PE 的穩(wěn)定性測定

每一輪亞麻酸甾醇酯合成反應(yīng)結(jié)束后，將耐壓瓶靜置，待體系分層后小心的去除CRL@PE 中95%的異辛烷，然后用等量的新的異辛烷多次洗滌剩余物質(zhì)，直至植物甾醇或植物甾醇酯去除干凈（氣相色譜分析中無底物和產(chǎn)物信號存在）。加入新的異辛烷、植物甾醇和亞麻酸（與第一輪反應(yīng)中用量相等），開始下一批次反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，用氣相色譜分析和計算植物甾醇轉(zhuǎn)化率。

2 結(jié)果與討論

2.1 CRL@PE的表征

圖1 為CRL@PE 乳液的形貌圖。

圖1 CRL@PE 乳液的形貌圖Fig.1 The morphology of CRL@PE emulsion

在光學(xué)顯微鏡的觀察下（4×10 倍），CRL@PE 乳液由眾多球狀液滴組成，液滴直徑約 50 μm～80 μm（圖1a）。為了更細(xì)致的觀察CRL@PE 的形貌，利用1.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的瓊脂水溶液作為水相構(gòu)建乳液，室溫靜置至乳液液滴凝固后，借助掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 觀察 CRL@PE 液滴形貌，見圖1b。從圖1b 中可以確定，每個CRL@PE 液滴表面均覆蓋一層由若干無序、相互交織的納米管構(gòu)成的外殼。因為瓊脂的凝固膨脹導(dǎo)致液滴形狀為不規(guī)則球體。為了確定乳液類型和脂肪酶CRL 在乳液中的位置，將CRL 用異硫氰酸熒光素標(biāo)記后溶于磷酸鹽緩沖液中作為水相，構(gòu)建CRL@PE，并通過共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）觀察現(xiàn)象，見圖1c。在圖1c 中，被標(biāo)記的脂肪酶CRL 發(fā)出綠光（激發(fā)波長495 nm～545 nm），呈現(xiàn)一個個標(biāo)準(zhǔn)的圓形。鑒于CRL 僅溶于水，且異辛烷未被標(biāo)記（無熒光現(xiàn)象），可以判斷CRL@PE 是油包水（w/o）的類型。

2.2 亞麻酸甾醇酯合成條件的單因素優(yōu)化

采用CRL@PE 催化植物甾醇和亞麻酸酯化反應(yīng)合成亞麻酸甾醇酯，反應(yīng)過程受到乳液含水率、酸醇摩爾比、CRL 用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的影響。為了獲得最大的植物甾醇轉(zhuǎn)化率，本部分采用單因素法初步判定最優(yōu)的反應(yīng)條件。

2.2.1 含水率的優(yōu)化

研究磷酸緩沖液用量（水相）對乳液制備和植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響，并用含水率表示（%v/wt.，mL/100 mg MWCNTs），結(jié)果如圖2 所示。

圖2 含水率對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of the water fraction on conversion efficiency of phytosterols

隨著含水率從2.0%增加到4.0%，植物甾醇轉(zhuǎn)化率（24 h）也從63.0%增長到80.4%。然而，當(dāng)含水率進(jìn)一步增加至7.0 %時，植物甾醇轉(zhuǎn)化率卻下降到了62.0%。這是因為含水率較低時，大量納米管堆積在液滴表面，形成厚厚的外殼，阻礙底物與界面處的酶分子接觸，抑制酯化反應(yīng)的發(fā)生。當(dāng)含水率超過4.0%，水相過量而納米管數(shù)量不足，導(dǎo)致CRL@PE 液滴不穩(wěn)定，聚并變大導(dǎo)致界面面積減小。同時過量自由水（未用于構(gòu)建乳液液滴的部分）的存在促進(jìn)了植物甾醇酯的分解。因此，選擇含水率4.0%作為后續(xù)試驗條件。

2.2.2 酸醇比的優(yōu)化

植物甾醇和亞麻酸的酯化反應(yīng)從化學(xué)平衡角度分析，最佳配比為1 ∶1，但增大亞麻酸用量，可以提高植物甾醇的轉(zhuǎn)化率，酸醇摩爾比對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響如圖3 所示。

圖3 酸醇摩爾比對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of the molar ratio of linolenic acid to phytosterol on conversion efficiency of phytosterols

隨著酸醇摩爾比的增加，植物甾醇轉(zhuǎn)化率也隨之增長，但增長趨勢在摩爾比為2 ∶1 時達(dá)到最大，此時植物甾醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高值為85.9 %。綜合考慮成本因素，選擇酸醇摩爾比2 ∶1 作為后續(xù)反應(yīng)的操作條件。

2.2.3 酶用量的優(yōu)化

酶用量對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響如圖4 所示。

圖4 酶用量對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of the dosage of lipase on conversion efficiency of phytosterols

植物甾醇轉(zhuǎn)化率隨著酶用量的增加（3 U～18 U）迅速上升。而酶用量的持續(xù)增加（＞15 U），卻會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低。這可能歸結(jié)于兩個原因：1）在CRL@PE 中脂肪酶大量聚集在兩相界面，改變了界面處酶分子的微環(huán)境，導(dǎo)致催化性能受到影響；2）脂肪酶也可能堆積在水相核心，因接觸不到底物而難以發(fā)揮效力。綜上所述，選擇酶用量12 U 作為后續(xù)反應(yīng)的催化劑用量。

2.2.4 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的優(yōu)化

溫度對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響如圖5 所示。

圖5 反應(yīng)溫度對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on conversion efficiency of phytosterols

隨著溫度的增加，植物甾醇轉(zhuǎn)化率逐漸增加；在30 ℃時達(dá)到最大值93.2%（12 h）；此后繼續(xù)提高溫度，轉(zhuǎn)化率開始下降，而且溫度越高，轉(zhuǎn)化率下降越嚴(yán)重。這是因為低溫或較高的溫度會抑制酶的催化性能，導(dǎo)致反應(yīng)速度降低；高溫會促使酶蛋白變性，脂肪酶因結(jié)構(gòu)改變而失活。因此，選擇30 ℃作為后續(xù)試驗的反應(yīng)溫度。因此，本試驗中采用30 ℃作為反應(yīng)溫度。

隨著反應(yīng)時間的推移，植物甾醇轉(zhuǎn)化率逐漸提高，達(dá)到最大值后基本保持不變，證明反應(yīng)即將達(dá)到平衡點?？紤]成本因素，選擇12 h 作為最佳反應(yīng)時間，此時轉(zhuǎn)化率為93.2%。

2.2.5 CRL@PE 性能評價

表1 顯示了CRL@PE 與其他酶催化劑在合成植物甾醇酯反應(yīng)中的性能差異。以植物甾醇轉(zhuǎn)化率高低為評價標(biāo)準(zhǔn)，綜合考慮能耗和生產(chǎn)成本，CRL@PE 法合成植物甾醇酯具有反應(yīng)條件溫和、底物轉(zhuǎn)化效率高、催化劑性能優(yōu)異的特點，是一種相對高效的亞麻酸甾醇酯生產(chǎn)工藝。

表1 CRL@PE 與其他酶催化劑合成植物甾醇酯性能的比較Table 1 Comparison of the performance of CRL@PE with other lipase catalysts in synthesis of phytosterol esters

2.3 CRL@PE的穩(wěn)定性

重復(fù)使用性能是評價催化劑應(yīng)用價值的一個重要參數(shù)。圖6 顯示了CRL@PE 在催化植物甾醇酯合成過程中的性能變化。

圖6 CRL@PE 的重復(fù)使用性Fig.6 The reusability of CRL@PE

CRL@PE 重復(fù)使用10 次后，植物甾醇轉(zhuǎn)化率為92.06%，保持不變。此時CRL@PE 液滴大小基本未受到重復(fù)使用的影響。使用15 次后，轉(zhuǎn)化率為77.3%。由此可見，CRL@PE 具有良好的重復(fù)使用性。

將CRL@PE 置于不同溫度下水浴鍋中恒溫加熱3 h 后，于最優(yōu)條件下催化合成植物甾醇酯，分析CRL@PE 熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖7 所示。

圖7 CRL@PE 的熱穩(wěn)定性Fig.7 The thermal stability of CRL@PE

在30 ℃時轉(zhuǎn)化率最大為92.2%。而任何微小的溫度變化都會導(dǎo)致活性下降。長期接觸溫度高于30 ℃會損害CRL@PE 的結(jié)構(gòu)，然后破壞和水平從而減少活動將隨著溫度增加而增加。低溫（＜30 ℃）會影響傳質(zhì)速度，導(dǎo)致活動減少。

3 結(jié)論

本試驗以納米管為乳化劑，基于非均相反應(yīng)構(gòu)建了一種新型的Pickering 乳液催化劑CRL@PE，其具有油包水的結(jié)構(gòu)，液滴直徑為40 μm～60 μm。同時本課題組于國內(nèi)首次研究利用乳液催化劑合成亞麻酸甾醇酯的工藝過程，其最優(yōu)反應(yīng)條件為：含水率4.0%、酸醇摩爾比 2 ∶1（植物甾醇 30 μmol）、酶用量 12 U、溫度30 ℃、反應(yīng)時間10 h，此時植物甾醇最大轉(zhuǎn)化率為92.13%。此外，CRL@PE 具有良好的重復(fù)使用性和熱穩(wěn)定性，但對溫度變化較為敏感。

下一階段將詳細(xì)研究CRL@PE 的催化特性，包括催化動力學(xué)、失活動力學(xué)。采用更加科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆椒ㄑ芯緾RL@PE 催化不同反應(yīng)時的最佳條件。