付建鑫，張炳文，邵家威，張桂香

（濟(jì)南大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)系，山東濟(jì)南250002）

灰綠堿蓬（Suaedaglauca bunge），又名黃須菜，是一年生藜科堿蓬屬草本鹽生植物[1-2]。在我國東北鹽地、山西、寧夏、甘肅自貢及黃河三角洲灘涂地區(qū)分布廣泛[3-5]。明代的《救荒本草》中記載堿蓬具有良好的藥效：“味咸性涼，清熱消積”[6-7]?！毒V目拾遺》有記載：“可清熱，瘰癘、腹脹”[8-9]。目前對堿蓬的研究主要著眼于鹽地堿蓬中的多糖[10-11]、色素[12-13]及黃酮[14-15]等物質(zhì)及其活性的研究，對于灰綠堿蓬及其植物鹽的研究較少。劉素華等[16]測定了鹽地堿蓬中的植物鹽成分主要為NaCl、KCl，同時含有微量的鈣、鐵、錳等元素。王勝等[17-18]等用二氧化碳-液氨萃取法提取到了低鉛高鋅、低錳、低銅的堿蓬植物鹽。

本研究在結(jié)合前人鹽地堿蓬植物鹽提取工藝研究基礎(chǔ)上，在不同提取方式、不同生長時期的灰綠堿蓬、不同原料粒度處理方式及不同提取部位等方面，對影響植物鹽提取因素進(jìn)行了較為全面的探究，利用響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）優(yōu)化植物鹽的提取工藝，并對灰綠堿蓬的基本營養(yǎng)成分及礦物元素進(jìn)行測定，以期為灰綠堿蓬的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全株灰綠堿蓬：2018年采自黃河三角洲灘涂地區(qū)。

石油醚、無水乙醇、硫酸銅、氫氧化鈉、濃硫酸、鹽酸、硼酸、苯酚、硝酸、葡萄糖均為分析純：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶（酶活250 U/g）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

IMS-972 型電解質(zhì)分析儀：深圳市希來恒醫(yī)用墊子有限公司；DK-98-I 型電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；RE2000B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：鄭州市亞榮儀器有限公司；XYF-3K 型遠(yuǎn)紅外線食品烤爐：廣州紅菱電熱設(shè)備有限公司；HLD-12 型超微粉碎機(jī)：濟(jì)南恒龍達(dá)機(jī)電科技有限公司；TANK ECO 型微波消解儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；FP640 型火焰發(fā)射光度計：上海儀電分析儀器有限公司；Ice3500AA 原子吸收分光光度計：Thermo Scientific 公司；PF32 型原子熒光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FA2004N 電子天平：上海上平儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 堿蓬植株基本成分含量測定

蛋白質(zhì)含量測定，按GB 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》執(zhí)行；總糖含量測定，按GB/T 15672-2009《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食用菌中總糖含量的測定》執(zhí)行；脂肪含量測定，按GB 5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定》執(zhí)行。

1.3.2 礦物質(zhì)元素含量測定

樣品處理：準(zhǔn)確稱量恒重的堿蓬全植株、芽葉部、莖部及根部樣品各 1 g，加入 7 mL HNO3、1 mL H2O2，在加熱板上85 ℃進(jìn)行預(yù)熱消解12 min～15 min，當(dāng)出現(xiàn)氣體冒出時轉(zhuǎn)入消化爐。按照梯度升溫140 ℃保持20 min，補(bǔ)加 2 mL HNO3后 200 ℃保持 10 min，消化完畢后降溫至120 ℃～130 ℃揮發(fā)余酸至近干，冷卻至室溫25 ℃。將消化液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，至少3 次洗滌消化管合并洗液于容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線。以不加堿蓬樣品的試劑作空白對照試驗，測定結(jié)果均以干基計。

儀器條件：火焰發(fā)射光譜法測定K、Na 元素，條件見表1。原子吸收分光光度法測定Mg、Zn、Fe、Cu 元素。

表1 火焰發(fā)射光譜法條件Table 1 Detective condition of flame emission spectrometry

原子吸收分光光度法條件，見表2。

表2 原子吸收分光光度法條件Table 2 Detective condition of atomic absorption spectrophotometry

1.3.3 影響植物鹽提取因素確定

均選取全株堿蓬，經(jīng)不同理方式、條件下進(jìn)行植物鹽提取，用IMS-972 型電解質(zhì)分析儀測定提取液中K+、Na+的濃度。

1.3.3.1 不同粉碎粒度K+、Na+含量

取 50、80、150、250 目和未粉碎（記為 W）的堿蓬全株干粉各5 g，150 mL 蒸餾水在80 ℃攪拌浸提2 h，離心（4 ℃、10 000 r/min、10 min）取濾后上清液于 250 mL容量瓶定容。測定鹽離子濃度，試驗測定數(shù)據(jù)平行3次，取平均值。

1.3.3.2 不同浸提方式K+、Na+含量

比較索氏提取和酶輔助浸提兩種方法的植物鹽提取效果，原料細(xì)度選為1.3.3.1 中最優(yōu)目數(shù)。

索氏提取法：考察索氏提取法中料液比、溶劑種類、回流次數(shù)對堿蓬植物鹽提取得率的影響。使用5%NaOH 溶液、5%HCl 溶液溶劑時引入了外源 Na+，故衡量鹽離子濃度指標(biāo)時，只選用K+作為目標(biāo)值。

索氏提取法試驗因素水平見表3。

酶輔助浸提：考察纖維素酶輔助浸提法在38 ℃下酶單位、浸提時間對堿蓬植物鹽提取得率的影響。

酶輔助浸提法試驗因素水平見表4。

表3 索氏提取法試驗因素水平表Table 3 Soxhlet extraction test factor design level table

表4 酶輔助浸提法試驗因素水平表Table 4 Enzyme assisted extraction test factor design level table

1.3.3.3 不同提取部位K+、Na+含量

取堿蓬芽葉部、莖部和根部干粉各5 g，150 mL 蒸餾水在 80 ℃攪拌浸提 2 h，離心（4 ℃、10 000 r/min、10 min）取濾后上清液于250 mL 容量瓶定容。測定鹽離子濃度，試驗測定數(shù)據(jù)平行3 次，取平均值。

1.3.3.4 不同生長時期K+、Na+含量

取全植株堿蓬萌芽期、成熟期、枯萎期干粉各5 g，150 mL 蒸餾水在 80 ℃攪拌浸提 2 h，離心（4 ℃、10 000 r/min、10 min）取濾后上清液于250 mL 容量瓶定容。測定鹽離子濃度，試驗測定數(shù)據(jù)平行3 次，取平均值。

1.3.4 堿蓬植物鹽提取工藝優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗

根據(jù)探究試驗的結(jié)果，選取影響植物鹽提取明顯因素料液比（A）、酶單位（B）、浸提時間（C）、粉碎粒度（D）為關(guān)鍵參數(shù)控制指標(biāo)，采用Box-Behnken 響應(yīng)面的方法設(shè)計四因素三水平試驗，以植物鹽浸出得率（X）為響應(yīng)值，每組試驗平行測定3 次。

響應(yīng)面試驗因素水平見表5。

表5 響應(yīng)面試驗因素水平Table 5 Factors and levels of response surface methodology

1.3.4.2 植物鹽提取得率

式中：M 為浸提前干燥樣品質(zhì)量，g；M0為浸提后干燥質(zhì)量，g；X 為浸提得率，mg/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用origin 8.0 軟件進(jìn)行處理并制圖分析單因素試驗結(jié)果，運用design expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿蓬全株各物質(zhì)含量

2.1.1 堿蓬全株營養(yǎng)成分含量

堿蓬全株各營養(yǎng)成分含量見表6。

表6 各物質(zhì)成分含量Table 6 Contents of various substances

由表6 可知，堿蓬中多糖的含量約為39.625 mg/g，堿蓬中水分含量約為82.8%，根據(jù)酸水解法測定堿蓬中粗脂肪含量為0.319%，堿蓬中蛋白質(zhì)的含量約為2.45%。

2.1.2 礦物元素含量

堿蓬全株、芽葉、莖部及根部的各金屬離子含量見表7。

表7 堿蓬中不同部位各礦物元素含量Table 7 The content of mineral elements from all part of Suaedaglauca bunge mg/kg

2.2 不同粉碎粒度提取液中K+、Na+含量結(jié)果與分析

不同粉碎粒度提取液中K+、Na+含量結(jié)果見圖1。

原料粒徑對植物鹽提取效率有明顯影響。由圖1可以看出，隨著原料粒度逐漸減小，單位體積提取溶劑中鹽離子含量逐漸增高。原料粒度低于150 目時，K+、Na+濃度增長明顯，離子濃度變化隨著粒度增加，變化率趨于平緩，因為此時溶劑鹽離子的濃度趨近于飽和。故綜合考慮粉碎成本和時間，選取150 目為最佳粒度。

圖1 不同粉碎粒度的鹽離子濃度Fig.1 The ion concentration of extraction on different granularity of Suaedaglauca bunge

2.3 不同浸提方式K+、Na+含量結(jié)果與分析

2.3.1 索氏提取法

2.3.1.1 不同浸提料液比對K+、Na+離子濃度的影響

不同料液比下K+、Na+離子濃度見圖2。

圖2 不同料液比的鹽離子濃度Fig.2 The ion concentration of extraction on different solid-liquid ratio of Suaedaglauca bunge

圖2 可以看出，K+、Na+濃度隨著溶劑體積的增大而增大。K+濃度變化率在料液比達(dá)到1 ∶20（g/mL）以后減小，當(dāng)料液比達(dá)到 1 ∶16（g/mL）時，此時 K+的提取濃度達(dá)到最大。Na+濃度變化趨勢與K+相似，故可以看出 1 ∶16（g/mL）最佳的提取料液比，此時的 K+、Na+離子濃度分別為10.27 mmol/L 和92.54 mmol/L。

2.3.1.2 不同浸提溶劑對K+、Na+離子濃度的影響

不同浸提溶劑中K+、Na+離子濃度見圖3。

不同提取溶劑對目標(biāo)物質(zhì)的溶解析出能力不同，適宜的提取溶劑是高效提取的重要基礎(chǔ)。從圖3 可以看出，不同溶劑對K+的浸提效果從大到小依次5%NaOH 溶液＞水＞5%HCl 溶液＞無水乙醇。無水乙醇作為極性較強(qiáng)溶劑，對K+浸提效果較差。5%NaOH 溶液和水作為溶劑的浸提效果相差不多，故選用水作為浸提溶劑最佳。

圖3 不同浸提溶劑浸提液的鹽離子濃度Fig.3 The ion concentration of extraction on different solvents of Suaedaglauca bunge

2.3.1.3 不同浸提次數(shù)對K+、Na+離子濃度的影響

不同浸提次數(shù)中K+、Na+離子濃度見圖4。

圖4 不同次數(shù)浸提液鹽離子濃度Fig.4 The ion concentration of different extraction times of Suaedaglauca bunge

由圖4 可以看出，K+和Na+濃度隨著浸提次數(shù)的增加而逐漸增大，并且Na+濃度高于K+濃度。提取3、4 次的 Na+濃度分別為 102.3、103.5 mmol/L，K+濃度分別為11.7、11.6 mmol/L，由此可以看出浸提次數(shù)達(dá)到3 次以后，隨著浸提次數(shù)的增加，離子濃度增加不顯著。因此，索氏提取法中浸提次數(shù)選擇3 次為最佳提取條件。

2.3.2 酶提法

2.3.2.1 不同酶提時間下K+、Na+離子含量

不同酶提時間下K+、Na+離子含量見圖5。

酶解植物細(xì)胞壁，增大內(nèi)容物流出，在適宜的溫度條件下具有高效、溫和的特點。在纖維素酶添加量為500 U，溫度為38 ℃的條件下，隨著提取時間的增加，植物提取液中K+和Na+濃度逐漸增加進(jìn)而趨于平緩。當(dāng)提取時間達(dá)到90 min 時，隨著時間延長，鹽離子濃度增長緩慢。因此，酶法輔助提取時選用的時間為90 min 為適宜條件。

圖5 酶輔助浸提不同時間浸提液鹽離子濃度Fig.5 The ion concentration of different extraction times with enzyme of Suaedaglauca bunge

2.3.2.2 不同酶單位浸提條件下K+、Na+離子含量

不同酶單位下K+、Na+離子含量見圖6。

圖6 不同活力單位酶輔助浸提液的鹽離子濃度Fig.6 The ion concentration of different extraction times with enzyme of Suaedaglauca bunge

在纖維素酶單位為500 U 時，溶液中K+和Na+濃度含量分別達(dá)到6.70 mmol/L 和93.0 mmol/L，而當(dāng)纖維素酶單位繼續(xù)增加時，離子濃度均有所下降，可能原因是多余的酶在滅活煮沸過程中沉淀了部分鹽離子。因此，選擇酶添加量為500 U 較為合適，說明此時的酶添加量對底物酶解較為徹底，利用率最高。

2.4 不同提取部位K+、Na+含量結(jié)果與分析

不同提取部位K+、Na+含量見圖7。

圖7 可知，熱水浸提液的離子濃度為根部＜莖部＜芽葉?？梢悦黠@看出，Na+、K+在不同部位中的濃度差異較大：各個部位中的Na+濃度遠(yuǎn)大于K+，且芽葉部的Na+濃度遠(yuǎn)大于根部，相差約為24.3%。造成這種離子濃度分布的原因是在鹽堿地等高滲環(huán)境中，莖部鹽離子濃度低于芽葉處，莖部為植株縱向生長造成，營養(yǎng)物質(zhì)、水分、無機(jī)鹽及礦物質(zhì)在此路徑中被運輸?shù)窖咳~部位，同時，芽葉部位進(jìn)行生理蒸騰作用、光合作用時消耗水分等物質(zhì)，積留植物鹽。

圖7 堿蓬不同提取部位浸提液鹽離子濃度Fig.7 The ion concentration of extraction on different part of Suaedaglauca bunge

2.5 不同生長時期K+、Na+含量結(jié)果與分析

不同生長時期K+、Na+含量見圖8。

圖8 堿蓬不同生長時期浸提液鹽離子濃度Fig.8 The ion concentration of extraction on different growth of Suaedaglauca bunge

堿蓬不同生長時期，各組織細(xì)胞分化生長差異顯著。營養(yǎng)生長期Na+濃度遠(yuǎn)高于萌芽期和枯萎期，K+的濃度變化也呈現(xiàn)如此趨勢，但離子濃度差小于Na+。此趨勢與趙可夫等[4]研究介紹的堿蓬的生長生理特性大致吻合：在組織細(xì)胞高度生長分化的時期，發(fā)達(dá)且功能完善的組織更容易抱持高濃度的鹽離子，同時也供正常生長所用。萌芽期和枯萎期的堿蓬植株各個分化組織液的濃度，同比營養(yǎng)期都較低。

2.6 響應(yīng)面結(jié)果與分析

響應(yīng)面試驗結(jié)果見表8。

表8 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果Table 8 Scheme and results of response surface methodology

續(xù)表8 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果Continue table 8 Scheme and results of response surface methodology

擬合多元二次方程模型的方差分析見表9。

表9 擬合多元二次方程模型的方差分析Table 9 Analysis of variance for the fitted multivariate quadratic equation model

表9 擬合多元二次方程模型的方差分析Table 9 Analysis of variance for the fitted multivariate quadratic equation model

通過表8、表9 分析可知，回歸模型顯著（P＜0.05），失擬項不顯著（P＞0.1），說明回歸模型與實際情況擬合吻合度較高，試驗產(chǎn)生的誤差較小，可以使用此模型對堿蓬植物鹽提取得率進(jìn)行模擬分析和預(yù)測。在此模型中料液比（A）、酶單位（B）、浸提時間（C）、原料粒度（D）、料液比與酶單位的交互項目（AB）、料液比二次項（A2）、酶單位二次項（B2）、浸提時間二次項（C2）、原料粒度二次項（D2）對植物鹽提取得率具有明顯影響：B＞A＞D＞C。

利用design-expert8.0.6 軟件分析數(shù)據(jù)，分析可得到料液比、酶單位、浸提時間、原料粒度與提取得率之間的二次回歸方程為：X=10.37+0.71A+1.44B+0.56C+0.57D+0.70AB+0.11AC+0.17AD-0.40BC+0.087BD+0.12CD-1.22A2-1.36B2-0.72C2-0.83D2。堿蓬植物鹽浸提優(yōu)化參數(shù)為料液比1 ∶20（g/mL）、纖維素酶單位600 U、浸提時間120 min、原料粒度200 目，此時植物鹽提取得率為（10.31±0.27）mg/g。

3 結(jié)論

對灰綠堿蓬基本營養(yǎng)成分分析得出，水分、脂肪、蛋白質(zhì)含量分別為82.8%、0.319%、2.45%，總糖含量為39.6 mg/g。植物鹽提取因素探究發(fā)現(xiàn)，選材處于營養(yǎng)期、粒度為150 目的芽葉部位最佳；索氏提取法最優(yōu)條件為料液比 1 ∶16（g/mL）、水浸提 3 次；酶輔助浸提法最優(yōu)條件為38 ℃下纖維素酶500 U 浸提90 min。響應(yīng)面法優(yōu)化提取灰綠堿蓬中的植物鹽，提取試驗最優(yōu)參數(shù)為：料液比 1 ∶20（g/mL）、纖維素酶單位 600 U、浸提時間120 min、原料粒度200 目，此條件下的植物鹽提取平均得率為（10.31±0.27）mg/g，與模型預(yù)測的提取得率相近，說明模型可以較好的模擬灰綠堿蓬的植物鹽提取工藝。植物鹽富含硒等多種礦物元素，是一種天然添加劑，經(jīng)過純化后對于功能食品、飲料開發(fā)具有重大意義。