楊偉克，唐芬芬，劉增虎，董占鵬

(云南省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101)

【研究意義】抗菌肽(Antibacterial pepetides，AMPs)是一類普遍存在的防御性蛋白質(zhì)，它是一類具有生物活性的小分子多肽，由20～60個氨基酸殘基組成，這類活性多肽多數(shù)具有強堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜的抗菌活性，在昆蟲先天免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮了極其重要的作用[1-2]。家蠶幼蟲在眠前停止食桑，排空腸內(nèi)的內(nèi)容物，經(jīng)過一定的時間，機體生成新皮蛻去舊皮，進入下一個齡期。就眠蛻皮是桑蠶生長發(fā)育過程中非常重要的生理特征之一，然而關于家蠶眠期免疫調(diào)控機制的研究鮮見報道，因此開展家蠶眠期免疫應答模式的研究，探究抗菌肽基因的表達變化規(guī)律，為豐富和完善昆蟲先天性免疫防御機制的提供新線索?！厩叭搜芯窟M展】家蠶作為鱗翅目昆蟲的模式生物，其基因組測序已完成，Cheng等通過對家蠶基因組框架圖序列的搜尋找到了35條抗菌肽基因序列[3-5]。目前已確認在家蠶基因組中主要存在7個抗菌肽基因家族，即Cecropin、Moricin、Gloverin、Attacin、Lebocin、Enbocin和Defensin家族[6-7]。目前對家蠶抗菌肽基因表達調(diào)控的研究報道相對較多，主要集中在外源病原微生物、物理化學因子或特定的環(huán)境脅迫誘導的免疫反應，但這些免疫反應均是通過經(jīng)典的Toll或IMD信號途徑調(diào)控抗菌肽基因的表達[8-10]。在果蠅的先天免疫研究中，研究者發(fā)現(xiàn)饑餓可以調(diào)控抗菌肽基因的表達，并且不依賴于Toll和IMD信號途徑[11]，筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)，饑餓同樣可以誘導鱗翅目昆蟲家蠶抗菌肽基因DefensinB的表達[12]。昆蟲進入眠期發(fā)育時，處于停食的相對饑餓狀態(tài)和對病原抵抗性的相對薄弱環(huán)節(jié)，此時機體主動提高其細胞免疫或體液免疫的活性，增強自身免疫力，保護機體免受傷害，這有利于昆蟲的正常生長發(fā)育[13-14]?！颈狙芯壳腥朦c】一般家蠶的幼蟲期有4個眠期，蠶進入眠期主要表現(xiàn)為不吃不動，此時自身的能量代謝會變慢，這在一定程度上會影響相應的免疫防御能力?！緮M解決的關鍵問題】家蠶眠期免疫相關因子和基因表達調(diào)控的研究少見報道，以四齡眠至五齡起蠶不同發(fā)育階段的血淋巴和脂肪體為實驗材料，測定血淋巴的抗菌活性，同時檢測分析7個抗菌肽基因的表達變化情況，旨在明確家蠶眠期抗菌肽基因的變化規(guī)律，為深入研究和解析家蠶眠期免疫防御機制提供新線索。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

家蠶品系大造(Dazao)人工孵化，在恒溫培養(yǎng)箱于25 ℃桑葉飼養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑

主要儀器：PCR擴增儀，瓊脂糖凝膠電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)，低溫高速離心機，Bio-Rad公司CFX-96實時熒光定量PCR檢測儀、恒溫培養(yǎng)箱。主要試劑：高純總RNA快速提取試劑盒(Bioteke公司，貨號RP1202)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，貨號RR047A)，熒光定量試劑(Bio-Rad公司，貨號1725121)。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集 在家蠶四齡眠期0、12、24 h和眠起(五齡起蠶)取材。用脫脂棉蘸取75 %的酒精進行體表消毒、晾干，在冰上用昆蟲針刺其腹足，收集血淋巴，用沸水煮5 min進行預處理，7500 r/min 離心1 min，上清液用于抗菌活性的測定。同時將家蠶表皮剪開，用鑷子刮取脂肪體，保存于1.5 mL Trizol中，液氮保存。根據(jù)高純總RNA快速提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)操作步驟提取家蠶脂肪體總RNA。用紫外分光光度計測定RNA樣品濃度，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3.2 血淋巴抗菌活性測定 選用革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和革蘭氏陰性菌大腸桿菌(E.coliK12D31)為供試菌株。分別取對數(shù)生長期的菌液加入96孔板中，每孔80 μl，加入預處理的家蠶血淋巴20 μl，終體積為100 μl。設1個陰性對照和1個陽性對照組，陰性對照組和陽性對照組分別以PBS緩沖液和卡那霉素替代家蠶血淋巴?；靹蚝笥妹笜藘x測OD570值，然后置于37 ℃搖床培養(yǎng)，每隔1 h進行測定，利用抑菌曲線表示其抗菌活性。每種處理設5個重復，取其平均值。

1.3.3 抗菌肽基因引物設計 分別選取7個家蠶抗菌肽家族的主效基因，以真核翻譯起始因子4A基因(家蠶芯片探針 ID：sw22934)作為熒光定量內(nèi)參基因運用引物設計軟件 Primer Premier 5.0 進行引物設計。引物由華大基因合成，引物序列見表1。

1.3.4 實時熒光定量PCR檢測抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄活性 參照實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行操作，反應程序：95 ℃，30 s →(95 ℃，5 s →60 ℃，30 s)40個循環(huán)→65 ℃，5 s(然后每次加0.5 ℃，直到95 ℃，5 s)。Bio-Rad公司CFX-96實時熒光定量PCR檢測儀記錄實驗數(shù)據(jù)，根據(jù)文獻報道的公式2-△△Ct計算基因的相對表達量[15-16]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 用Excel2016和SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)處理及圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 眠期血淋巴抑菌活性檢測

分別取四齡眠0、12、24 h和五齡起的家蠶幼蟲血淋巴，以PBS和卡那霉素作為對照組，測定抑菌活性。從圖1可以看出，四齡眠0 h和五齡起蠶的血淋巴對大腸桿菌沒有抑菌活性，其抑菌曲線與陰性對照組無差異，而四齡眠12 h和四齡眠24 h的血淋巴對大腸桿菌均有顯著的抑菌活性(t測驗，P<0.05)。而圖2結(jié)果表明家蠶四齡眠0、12、24 h和五齡起蠶的血淋巴對金黃色葡萄球菌均沒有抑菌活性。這一結(jié)果暗示四齡眠12和24 h的家蠶血淋巴中產(chǎn)生了某些抑菌物質(zhì)，但其抑菌活性具有選擇性，僅對革蘭氏陰性菌株有抑菌作用。

A：四齡眠0 h；B：四齡眠12 h；C：四齡眠24 h；D：五齡起蠶；CK+：陽性對照；CK-：陰性對照。下同A: The fourth molting for 0 hours; B: The fourth molting for 12 hours; C: The fourth molting for 24 hours; D: The newly molted fifth instar; CK+: Positive control; CK-: Negative control. The same as below圖1 血淋巴對大腸桿菌抑菌曲線Fig.1 The antibacterial curve of hemolymph against Escherichia coli

圖2 血淋巴對金黃色葡萄球菌抑菌曲線Fig.2 The antibacterial curve of hemolymph against Staphylococcus aureus

2.2 cDNA模板檢測

以提取RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，家蠶管家基因Actin3的引物進行普通PCR檢測。結(jié)果如圖3所示，所有cDNA模板均能擴增出亮度均一的條帶，說明反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板質(zhì)量較高，可以用于后續(xù)實時熒光定量PCR實驗。

2.3 家蠶抗菌肽基因的相對表達量測定

家蠶抗菌肽基因主要在脂肪體組織中轉(zhuǎn)錄表達，隨后分泌到血淋巴中發(fā)揮免疫防御功能[17]。抑菌曲線結(jié)果顯示在四齡眠12和24 h的家蠶血淋巴對大腸桿菌具有一定的抑制活性，表明此時血淋巴中產(chǎn)生了抗菌物質(zhì)。進一步利用實時熒光定量PCR對家蠶四齡眠0、12、24 h和五齡起蠶脂肪體的抗菌肽基因進行定量分析，結(jié)果如圖4所示?？咕幕騆ebocin3和Moricin在四齡眠0、12、24 h和五齡起蠶的表達量均相對較低，并且在測定的時間范圍內(nèi)無明顯變化。Attacin1基因僅在四齡眠24 h表達量較高。在四齡眠0 h至五齡起蠶這段時間內(nèi)，CecropinB6和Gloverinv2基因出現(xiàn)下調(diào)表達的趨勢，而Enbocin2和DefensinB的表達量逐漸升高，呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢。這表明在家蠶四齡眠期，抗菌肽基因的表達規(guī)律并不一致。

M：DL2000 Marker；1～3：四齡眠0 h；4～6：四齡眠12 h；7～9：四齡眠24 h； 10～12：五齡起蠶M:DL2000 Marker; 1-3: The fourth molting for 0 hours; 4-6: The fourth molting for 12 hours; 7-9: The fourth molting for 24 hours; 10-12: The newly molted fifth instar圖3 管家基因Actin3的PCR擴增結(jié)果Fig.3 The PCR amplification of Actin3

圖4 家蠶抗菌肽基因的表達變化Fig.4 The expression changes of antibacterial peptide genes in silkworm

3 討 論

鱗翅目模式昆蟲家蠶體液免疫主要是由血淋巴中的脂肪體應答外源病原微生物的感染，誘導產(chǎn)生抗菌肽，分泌到血淋巴中發(fā)揮免疫防御功能[17-18]。昆蟲抗菌肽的產(chǎn)生主要通過兩條經(jīng)典的信號傳導途徑(Toll信號通路和IMD信號通路)，其中Toll信號通路主要由真菌和革蘭氏陽性菌激活，而IMD信號途徑主要由革蘭氏陽性菌激活[19-21]。

試驗結(jié)果顯示，家蠶四齡眠12和24 h的血淋巴對革蘭氏陰性菌具有一定的抑菌作用，但對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌卻無抑菌效果，表明此時血淋巴中產(chǎn)生了抑菌物質(zhì)，并且該抑菌物質(zhì)的抑菌作用具有選擇性。熒光定量PCR結(jié)果顯示，被測試的7個抗菌肽基因出現(xiàn)不同程度的應答，其中Lebocin3和Moricin2個基因在四齡眠至五齡起蠶的不同發(fā)育時間段的表達量無變化，表明這2個基因在眠期不發(fā)揮免疫防御功能，而CecropinB6和Gloverinv2基因出現(xiàn)下調(diào)表達的趨勢，推測這2個抗菌肽基因在家蠶眠期能量相對匱乏時受到負調(diào)控。另外Attacin1基因僅在四齡眠24 h出現(xiàn)上調(diào)表達，而Enbocin2和DefensinB基因從四齡眠開始到五齡起蠶這段時間呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢，其表達量均是逐漸升高。推測在家蠶眠期Attacin1、Enbocin2和DefensinB可能是受到饑餓、激素或是其它信號的正向調(diào)控，促進或激活了基因的表達，主動提高家蠶自身的免疫防御能力。

當昆蟲處于饑餓狀態(tài)，機體能量代謝相對變慢，其自身免疫防御能力會減弱，此時為了防御外來病原微生物的侵染，很有可能會通過其它途徑主動增強自身免疫[13-14]。前期對家蠶的研究發(fā)現(xiàn)，饑餓脅迫能誘導抗菌肽基因DefensinB的表達，但調(diào)控機理未知[12]。而在對果蠅免疫研究中發(fā)現(xiàn)，在非感染狀態(tài)下，饑餓可以誘導抗菌肽基因Drosomycin的表達，并且證實饑餓條件下Drosomycin的表達既不依賴Toll信號通路也不依賴IMD信號通路，而是通過類胰島素(Insulin-like signaling, ILS)信號水平下降介導FoxO轉(zhuǎn)錄因子(fork-head transcript factor)調(diào)控抗菌肽基因的表達[11]。家蠶進入眠期，不再進食，自身代謝變慢，此時機體處于相對饑餓狀態(tài)，相應的免疫力會有所下降或減弱，推測機體通過其它途徑誘導抗菌肽等免疫蛋白的產(chǎn)生，主動增強自身免疫，其調(diào)控原理及機制是否與果蠅相似，有待進一步去探究和證實。

4 結(jié) 論

家蠶四齡眠12和24 h的血淋巴產(chǎn)生了具有選擇性的抑菌活性物質(zhì)，并且僅對革蘭氏陰性菌具有一定的抑菌作用。在四齡眠至五齡起蠶的不同發(fā)育時間抗菌肽基因Enbocin2和DefensinB的表達量逐漸增加，而Attacin1僅在四齡眠24 h出現(xiàn)高表達，提示這3個抗菌肽基因在家蠶眠期發(fā)揮了重要的免疫防御功能，但其免疫調(diào)控機理還不明確。