楊玉梅，柴志欣，信金偉，王 會(huì)，王吉坤，張成福，鐘金城*，姬秋梅*

(1.西南民族大學(xué) 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2. 省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏 拉薩 850009)

【研究意義】牦牛(Bosgrunniens)是生活在高寒缺氧等極端環(huán)境的特有牛種，以食草為生，生性強(qiáng)悍，為青藏高原牧民提供主要的生產(chǎn)和生活資料，是高原草地畜牧業(yè)不可替代的重要畜種[1]。牦牛是一個(gè)全能型的優(yōu)質(zhì)資源，其生長(zhǎng)性狀是選育工作的重要參考，由于粗放式養(yǎng)殖和不健全的良種體系影響牦牛群體的生產(chǎn)力，具體變現(xiàn)為體格小、體重下降和繁殖率降低等生產(chǎn)性能“退化”癥候，嚴(yán)重限制牦牛業(yè)快速、高效的發(fā)展[2]。因此，提高牦牛生產(chǎn)水平成為了育種工作的重中之重?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】殘跡(Vestigial)基因在果蠅中與TEAD(TEA domain)/轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子TEF(transcription enhancer factor)相互作用，在果蠅的翅膀和飛行肌肉分化與發(fā)育過(guò)程中起重要作用[3-6]，其家族包含4個(gè)成員(VGLL1-VGLL4)。哺乳動(dòng)物VGLL1-4蛋白含有TEF-1相互作用結(jié)構(gòu)域稱為TDU結(jié)構(gòu)域(Tondu domain)，并有助與TEAD的組織特異性功能因子結(jié)合[7-8]。其中殘跡相似基因2(Vestigial like family member2,VGLL2/VITO-1)從小鼠肌肉特異表達(dá)基因芯片中篩選出來(lái)的，該基因編碼具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1(TEF-1)相互作用結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，編碼的蛋白質(zhì)可以在骨骼肌發(fā)育期間充當(dāng)TEF-1調(diào)節(jié)基因表達(dá)的輔因子，已研究發(fā)現(xiàn)編碼多種同種型的剪接轉(zhuǎn)錄物變體[9]。VGLL2在小鼠發(fā)育過(guò)程的體節(jié)肌節(jié)和咽囊中表達(dá)，而在成人的骨骼肌中選擇性表達(dá)[10-11]。研究表明，對(duì)小鼠進(jìn)行過(guò)表達(dá)研究，過(guò)表達(dá)VGLL2增強(qiáng)10T1/2細(xì)胞MyoD介導(dǎo)的肌源性轉(zhuǎn)換[12]。此外，TEAD1的骨骼肌特異性過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)成年小鼠快速-慢速纖維型轉(zhuǎn)變[13]。使用反義嗎啉代的敲低研究表明，抑制VGLL2表達(dá)會(huì)減弱C2C12成肌細(xì)胞和禽肢肌肉中的MyHC表達(dá)[14]。因此，以上研究均顯示VGLL2可在體外作用于肌肉分化。VGLL2缺陷小鼠在基礎(chǔ)條件下表現(xiàn)出更快的肌肉收縮表型，并且Myh7/miR-208b及其下游轉(zhuǎn)錄抑制蛋白的下游靶標(biāo)在新生兒骨骼肌中表現(xiàn)出緩慢抽搐纖維的顯著表達(dá)變化[15]。VGLL2在正常骨骼肌纖維分布中具有很強(qiáng)的活性，在體內(nèi)直接和間接發(fā)揮作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】鑒于VGLL2基因?qū)俟趋兰》只瘏f(xié)同轉(zhuǎn)錄因子，可作用于生肌細(xì)胞分化，VGLL2基因在骨骼肌中可特異性表達(dá)，推測(cè)其可能直接或間接影響畜禽的生長(zhǎng)發(fā)育。迄今為止，關(guān)于VGLL2基因的作用機(jī)制在人、小鼠、斑馬魚等物種進(jìn)行了較為深入的研究，但尚未有牦牛的相關(guān)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】因此，本研究以VGLL2基因?yàn)槟繕?biāo)基因，分析標(biāo)記位點(diǎn)對(duì)牦牛生長(zhǎng)性狀的影響，以期為牦牛分子育種提供新的理論方法和技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

隨機(jī)選取西藏申扎牦牛(53)、帕里牦牛(19)、類烏齊牦牛(44)、斯布牦牛(28)和四川麥洼牦牛(94)健康成年個(gè)體，剪取耳組織，置于75 %乙醇帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。在樣品采集過(guò)程中，同時(shí)測(cè)定牦牛生長(zhǎng)性狀(包括體重、體高、體斜長(zhǎng)、胸圍和管圍)。

1.2 基因組DNA提取和DNA混合池構(gòu)建

采用動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取基因組DNA，用1 %瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)DNA的純度和濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

分別從5個(gè)不同牦牛群體中隨機(jī)抽取10份DNA模板，利用分光光度計(jì)法分3次測(cè)定DNA樣品濃度(上、中、下層)，取其平均值，再分別稀釋至50 ng/μl。每個(gè)樣品取1 μl混勻構(gòu)建DNA池，于4 ℃環(huán)境下靜置24～48 h。

1.3 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

根據(jù)牛VGLL2基因序列(NC_037336.1)設(shè)計(jì)引物，分別針對(duì)3個(gè)外顯子序列利用 Primer 5.0設(shè)計(jì)3對(duì)引物(表 1)，引物送英維捷基(上海)生物技術(shù)有限公司合成。

引物VGLL2-1和VGLL2-2PCR反應(yīng)體系(25 μl)，其中上、下游引物各1 μl、DNA模板1 μl，ddH2O 9.5 μl，Premix ExTaq預(yù)混酶12.5 μl。引物VGLL2-3PCR反應(yīng)體系為25 μl，上、下游引物各1 μl、DNA模板1 μl、金牌MIX 22 μl。

其中引物VGLL2-2和VGLL2-3PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、退火30 s(各引物退火溫度見表1)、72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存；VGLL2-1PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s、退火30 s(引物退火溫度見表1)、72 ℃延伸10 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸2 min，4 ℃保存；1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 牦牛VGLL2基因的引物序列

1.4 基因SNP位點(diǎn)的篩查與檢測(cè)

通過(guò)構(gòu)建好的DNA池?cái)U(kuò)增牦牛VGLL2基因，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生物技術(shù)擎科有限公司進(jìn)行正反雙向測(cè)序，運(yùn)用DNAMAN 5.0將測(cè)序結(jié)果與NCBI上參考目的片段序列進(jìn)行比對(duì)并校正拼接；使用Chromas軟件篩選雙峰位點(diǎn)(突變位點(diǎn))。對(duì)于篩選到的SNPs位點(diǎn)利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序法對(duì)各類群牦牛共238個(gè)個(gè)體進(jìn)行分型，判定基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

用DNA池對(duì)所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1)。由圖1可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均為單一特異性條帶，與預(yù)期大小基本一致，確定為目的基因。用BioEdit 7.0.5生物軟件查找雙峰位點(diǎn)，預(yù)測(cè)多態(tài)位點(diǎn)，結(jié)果見圖2。

2.2 VGLL2基因測(cè)序結(jié)果

對(duì)上述3對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，在VGLL2-2引物的PCR擴(kuò)增片段上發(fā)現(xiàn)存在4個(gè)突變位點(diǎn)(圖2)，一處位于外顯子G5000A，剩余3處位于內(nèi)含子(C4868T、C4872G和G4889A)。

2.3 VGLL2基因SNPs的篩查和檢測(cè)

3個(gè)SNPs位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，G5000A位點(diǎn)包括GG、GA、AA 3種基因型，帕里牦牛包括GA和AA 2種基因型，申扎牦牛、麥洼牦牛、斯布牦牛和類烏齊牦牛包含GG、GA、AA 3種基因型；C4868T位點(diǎn)包括CC和CT 2種基因型，在5個(gè)群體中擁有CC和CT 2種基因型；C4872G位點(diǎn)包括CC和CT 2種基因型，麥洼牦牛和類烏齊牦牛含有CC和CT 2種基因型，而申扎牦牛、斯布牦牛、帕里牦牛僅存在CC基因型；G4889A位點(diǎn)包括GG和GA 2種基因型，麥洼牦牛和類烏齊牦牛含有GG和GA 2種基因型，而申扎牦牛、斯布牦牛、帕里牦牛僅存在GG基因型。因C4872G和G4889A位點(diǎn)的GC型和GA型僅在麥洼牦牛和類烏齊牦牛中發(fā)現(xiàn)。

M: DAN Marker D2000, 1、2、3：第一、二、三外顯子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M: DNA Marker, 1,2,3: PCR products of first, second and third exons圖1 牦牛VGLL2基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophpresis of PCR amplified VGLL2 gene in yak

2.4 牦牛VGLL2基因的遺傳多樣性

2.4.1 基因型頻率、基因頻率及χ2適合性檢驗(yàn) 由表2可知，在C4868T位點(diǎn)中，CC基因型在申扎牦牛、麥洼牦牛、斯布牦牛、帕里牦牛和類烏齊牦牛中的分布頻率分別為0.9623、0.7872、0.8214、0.9474和0.7727，為優(yōu)勢(shì)基因型。C4872G位點(diǎn)中，GG基因型在麥洼牦牛和類烏齊牦牛群體中為優(yōu)勢(shì)基因型。G4889A位點(diǎn)中為優(yōu)勢(shì)基因型。G5000A位點(diǎn)中，GA基因型在申扎牦牛、麥洼牦牛和類烏齊牦牛群體中為優(yōu)勢(shì)基因型；AA基因型在麥洼牦牛和斯布牦牛群體中為優(yōu)勢(shì)基因型。C4868T位點(diǎn)中，等位基因C基因頻率在5個(gè)群體中分別為0.9811、0.8936、0.9107、0.9737和0.8864，為優(yōu)勢(shì)等位基因。C4872G位點(diǎn)中，等位基因G在2個(gè)群體中分別為優(yōu)勢(shì)等位基因。G4889A位點(diǎn)中，等位基因G在5個(gè)群體中為優(yōu)勢(shì)等位基因。G5000A位點(diǎn)中，等位基因A在5個(gè)群體中為優(yōu)勢(shì)等位基因。

圖2 牦牛VGLL2基因DNA池部分測(cè)序Fig.2 The results of sequencing of VGLL2 fragment in yak

圖3 牦牛VGLL2基因4個(gè)SNP位點(diǎn)測(cè)序Fig.3 Sequencing of 4 SNP sites in VGLL2 fragment of yak

對(duì)牦牛VGLL2基因4個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行卡方適應(yīng)性檢驗(yàn)(表3)，位點(diǎn)C4868T、C4872G、G4889A和G5000Aχ2值均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

表2 5個(gè)牦牛類群基因4個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因及基因型頻率

續(xù)表2 Continued table 2

位點(diǎn)Loci牦牛類群Yak group數(shù)量Quantity基因型頻率Genotypic frequency等位基因頻率Allele frequencyCCCTTTCTC4872G麥洼牦牛940.9149(86)0.0851(8)00.95740.0426類烏齊牦牛440.9545(42)0.0455(2)00.97730.0227GGGAAAGAG4889A麥洼牦牛940.9255(87)0.0745(7)00.96280.0372類烏齊牦牛440.9545(42)0.0455(2)00.97730.0227GGGAAAGAG5000A申扎牦牛530.1889(10)0.4151(22)0.3962(21)0.39620.6038麥洼牦牛940.2234(21)0.4362(41)0.3404(32)0.44150.5585斯布牦牛280.0714(2)0.3571(10)0.5714(16)0.250.75帕里牦牛1900.4211(8)0.5789(11)0.21050.7895類烏齊牦牛440.0227(1)0.5227(23)0.4545(20)0.28410.7159

表3 5個(gè)牦牛類群VGLL2基因4個(gè)SNP位點(diǎn)的Hardy-Weinberg平衡的χ2檢驗(yàn)

2.4.2 群體遺傳多態(tài)性 運(yùn)用PIC_CALC軟件計(jì)算多態(tài)信息含量，位點(diǎn)C4868T、C4872G和G4889A在群體中的PIC含量均低于0.25，屬于低度多態(tài)；位點(diǎn)G5000A在群體中的PIC含量均大于0.25低于0.5，屬于中度多態(tài)(表4)，可見不同群體的多態(tài)性程度差異較大，其中麥洼牦牛多態(tài)性含量最高，為0.3716，帕里牦牛的最低，為0.2771。

2.4.3VGLL2基因多態(tài)性與牦牛生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性分析 運(yùn)用SPSS16.0分析軟件中的單因素分析，對(duì)238頭牦牛個(gè)體VGLL2基因的2個(gè)SNP位點(diǎn)C4868T和G5000A不同基因型與體高、體斜長(zhǎng)、胸圍、管圍和體重等生長(zhǎng)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析(表5)。結(jié)果表明，位點(diǎn)C4868T與體高、體斜長(zhǎng)、胸圍和體重均具有差異顯著性(P<0.05)。CC基因型個(gè)體體高、體斜長(zhǎng)、胸圍和體質(zhì)量顯著高于GC基因型。位點(diǎn)G5000A除管圍外其他生長(zhǎng)性狀基本遵循GA基因型個(gè)體均值略高于AA和GG基因型個(gè)體均值的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。對(duì)138頭類烏齊牦牛和麥洼牦牛個(gè)體VGLL2基因的2個(gè)SNP位點(diǎn)(C4872G,G4889A)不同基因型與體高、體斜長(zhǎng)、胸圍、管圍和體重等生長(zhǎng)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析(表5)，C4872G、G4889A位點(diǎn)兩種基因型在體高、體斜長(zhǎng)、胸圍、管圍和體重等生長(zhǎng)性狀上無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 5個(gè)牦牛類群VGLL2基因4個(gè)SNP位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性指標(biāo)

表5 牦牛VGLL2基因位點(diǎn)不同基因型與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)性分析

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)，同列相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

Note: Different letters in the same column indicate significant difference (P<0.05), and the same letter in the same column indicates that the difference is not significant (P>0.05).

3 討 論

VGLL2基因與新生兒肌肉中的TEAD1/4形成復(fù)合物，在骨骼肌中發(fā)揮協(xié)同作用。TEAD1的過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)朝向慢肌收縮表型和衛(wèi)星細(xì)胞增生的過(guò)渡[16-17]。VGLL2有助于肌肉特異性基因的TEAD依賴性調(diào)節(jié)，特別是在慢肌纖維中，以上研究表明，VGLL2基因可能對(duì)生長(zhǎng)性狀有所影響。

目前，對(duì)VGLL2基因的研究主要集中在對(duì)人的橫紋肌肉瘤的研究[18]及對(duì)雞胚胎骨骼肌形成的研究[19]，且在其他物種上的研究多集中在調(diào)控機(jī)理上，而進(jìn)行多態(tài)性研究較少，故可用于該基因多態(tài)性研究方面可供參考的文獻(xiàn)較少。目前，對(duì)牦牛VGLL2基因多態(tài)性及性狀相關(guān)性的研究尚未有報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)DNA混合池測(cè)序和直接測(cè)序法分析了牦牛VGLL2基因的3個(gè)外顯子的遺傳多樣性及其與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果顯示第一外顯子和第三外顯子高度保守未發(fā)現(xiàn)突變，在第二外顯子上存在1個(gè)SNP位點(diǎn)G5000A和第二內(nèi)含子上有3個(gè)SNP位點(diǎn)(C4868T，C4872G，G4889A)，內(nèi)含子雖為基因中無(wú)編碼功能的序列，但其對(duì)基因表達(dá)調(diào)控起著重要作用[20]，研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子突變夠能影響附近的剪切供體和調(diào)節(jié)原件，進(jìn)而導(dǎo)致基因編碼蛋白發(fā)生改變[21]。許多研究證實(shí)了這一結(jié)論，牦牛PPARδ基因第3內(nèi)含子g.10045A/G和g.10226A/G變異與體重顯著相關(guān)[22]，牦牛TMEM-18第一內(nèi)含子861(A/C)和1267(C/T)變異與體重顯著相關(guān)[23]?？梢奡NP位點(diǎn)(C4868T，C4872G，G4889A)變異可能不同程度影響VGLL2蛋白的活性，進(jìn)而影響其有關(guān)的生長(zhǎng)發(fā)育性狀。

Hardy-Weinberg平衡說(shuō)明，4個(gè)SNP位點(diǎn)P值均大于0.05，處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，說(shuō)明4個(gè)SNP位點(diǎn)受選擇、基因突變等影響較小，可能是人工選育、遷徙和遺傳漂變下處于動(dòng)態(tài)平衡中，且對(duì)這些位點(diǎn)可以加強(qiáng)選擇力度。在遺傳多態(tài)性分析中，多態(tài)信息含量(PIC)、純合度(Ho)、雜合度(He)和有效等位基因(Ne)等指標(biāo)從不同方向證實(shí)了群體的遺傳變異水平。群體的雜合度一般認(rèn)為與遺傳多樣性密切相關(guān)，群體雜合度越高，說(shuō)明群體的遺傳變異較大，遺傳多樣性較豐富[24]。群體的雜合度一般認(rèn)為與遺傳多樣性密切相關(guān)，群體雜合度越高，說(shuō)明群體的遺傳變異較大，遺傳多樣性較豐富[25]。多態(tài)信息含量數(shù)據(jù)顯示，位點(diǎn)C4868T、C4872G和G4889A在群體中屬于低度多態(tài)，低度多態(tài)可能是遺傳分化程度較低，缺乏與其他種群的基因交流，可能在該位點(diǎn)的遺傳變異程度較小，突變少，使得基因的純合型得以積累；位點(diǎn)G5000A在群體中屬于中度多態(tài)，中度多態(tài)可能是遺傳分化程度較高，與其他種群的基因交流較豐富，可能在該位點(diǎn)的遺傳變異程度較大，突變大。數(shù)據(jù)顯示C4868T、C4872G、G4889A僅發(fā)現(xiàn)2個(gè)基因型，分別缺失TT、CC和AA基因型，這可能是遺傳漂變所致，由于該純合基因型為致死基因，在長(zhǎng)期的選擇中被淘汰或者是因試驗(yàn)樣本數(shù)較少，后期可較大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究通過(guò)對(duì)牦牛VGLL2基因4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，牦牛VGLL2基因C4868T位點(diǎn)處的不同基因型與牦牛體高、體斜長(zhǎng)、胸圍和體重顯著相關(guān)，表現(xiàn)為CC基因型個(gè)體體高、體斜長(zhǎng)、胸圍和體質(zhì)量顯著高于GC基因型(P<0.05)。其余3個(gè)位點(diǎn)的不同基因型與牦牛體高、體斜長(zhǎng)、胸圍、管圍和體重差異不顯著(P>0.05)。因此推斷VGLL2基因上的C4868T位點(diǎn)可能影響牦牛的體高、體斜長(zhǎng)、胸圍和體重，可作為與牦牛生產(chǎn)性狀相關(guān)的候選分子標(biāo)記，為今后的牦牛選育提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

牦牛VGLL2基因的C4868T位點(diǎn)與牦牛的體高、體斜長(zhǎng)、胸圍和體重顯著相關(guān)，可作為牦牛生產(chǎn)性狀分子標(biāo)記輔助育種的候選位點(diǎn)，可對(duì)后續(xù)牦牛的體高、體斜長(zhǎng)、胸圍和體重性狀的選擇提供理論依據(jù)。