楊玉梅，柴志欣，信金偉，王 會，王吉坤，張成福，鐘金城*，姬秋梅*

(1.西南民族大學 青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，四川 成都 610041；2. 省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室，西藏 拉薩 850009)

【研究意義】牦牛(Bosgrunniens)是生活在高寒缺氧等極端環(huán)境的特有牛種，以食草為生，生性強悍，為青藏高原牧民提供主要的生產(chǎn)和生活資料，是高原草地畜牧業(yè)不可替代的重要畜種[1]。牦牛是一個全能型的優(yōu)質(zhì)資源，其生長性狀是選育工作的重要參考，由于粗放式養(yǎng)殖和不健全的良種體系影響牦牛群體的生產(chǎn)力，具體變現(xiàn)為體格小、體重下降和繁殖率降低等生產(chǎn)性能“退化”癥候，嚴重限制牦牛業(yè)快速、高效的發(fā)展[2]。因此，提高牦牛生產(chǎn)水平成為了育種工作的重中之重。【前人研究進展】殘跡(Vestigial)基因在果蠅中與TEAD(TEA domain)/轉錄調(diào)節(jié)因子TEF(transcription enhancer factor)相互作用，在果蠅的翅膀和飛行肌肉分化與發(fā)育過程中起重要作用[3-6]，其家族包含4個成員(VGLL1-VGLL4)。哺乳動物VGLL1-4蛋白含有TEF-1相互作用結構域稱為TDU結構域(Tondu domain)，并有助與TEAD的組織特異性功能因子結合[7-8]。其中殘跡相似基因2(Vestigial like family member2,VGLL2/VITO-1)從小鼠肌肉特異表達基因芯片中篩選出來的，該基因編碼具有轉錄調(diào)節(jié)因子1(TEF-1)相互作用結構域的蛋白質(zhì)，編碼的蛋白質(zhì)可以在骨骼肌發(fā)育期間充當TEF-1調(diào)節(jié)基因表達的輔因子，已研究發(fā)現(xiàn)編碼多種同種型的剪接轉錄物變體[9]。VGLL2在小鼠發(fā)育過程的體節(jié)肌節(jié)和咽囊中表達，而在成人的骨骼肌中選擇性表達[10-11]。研究表明，對小鼠進行過表達研究，過表達VGLL2增強10T1/2細胞MyoD介導的肌源性轉換[12]。此外，TEAD1的骨骼肌特異性過表達可誘導成年小鼠快速-慢速纖維型轉變[13]。使用反義嗎啉代的敲低研究表明，抑制VGLL2表達會減弱C2C12成肌細胞和禽肢肌肉中的MyHC表達[14]。因此，以上研究均顯示VGLL2可在體外作用于肌肉分化。VGLL2缺陷小鼠在基礎條件下表現(xiàn)出更快的肌肉收縮表型，并且Myh7/miR-208b及其下游轉錄抑制蛋白的下游靶標在新生兒骨骼肌中表現(xiàn)出緩慢抽搐纖維的顯著表達變化[15]。VGLL2在正常骨骼肌纖維分布中具有很強的活性，在體內(nèi)直接和間接發(fā)揮作用。【本研究切入點】鑒于VGLL2基因?qū)俟趋兰》只瘏f(xié)同轉錄因子，可作用于生肌細胞分化，VGLL2基因在骨骼肌中可特異性表達，推測其可能直接或間接影響畜禽的生長發(fā)育。迄今為止，關于VGLL2基因的作用機制在人、小鼠、斑馬魚等物種進行了較為深入的研究，但尚未有牦牛的相關研究報道?！緮M解決的關鍵問題】因此，本研究以VGLL2基因為目標基因，分析標記位點對牦牛生長性狀的影響，以期為牦牛分子育種提供新的理論方法和技術途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

隨機選取西藏申扎牦牛(53)、帕里牦牛(19)、類烏齊牦牛(44)、斯布牦牛(28)和四川麥洼牦牛(94)健康成年個體，剪取耳組織，置于75 %乙醇帶回實驗室，-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。在樣品采集過程中，同時測定牦牛生長性狀(包括體重、體高、體斜長、胸圍和管圍)。

1.2 基因組DNA提取和DNA混合池構建

采用動物組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取基因組DNA，用1 %瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分別檢測DNA的純度和濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

分別從5個不同牦牛群體中隨機抽取10份DNA模板，利用分光光度計法分3次測定DNA樣品濃度(上、中、下層)，取其平均值，再分別稀釋至50 ng/μl。每個樣品取1 μl混勻構建DNA池，于4 ℃環(huán)境下靜置24～48 h。

1.3 引物設計與PCR擴增

根據(jù)牛VGLL2基因序列(NC_037336.1)設計引物，分別針對3個外顯子序列利用 Primer 5.0設計3對引物(表 1)，引物送英維捷基(上海)生物技術有限公司合成。

引物VGLL2-1和VGLL2-2PCR反應體系(25 μl)，其中上、下游引物各1 μl、DNA模板1 μl，ddH2O 9.5 μl，Premix ExTaq預混酶12.5 μl。引物VGLL2-3PCR反應體系為25 μl，上、下游引物各1 μl、DNA模板1 μl、金牌MIX 22 μl。

其中引物VGLL2-2和VGLL2-3PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s、退火30 s(各引物退火溫度見表1)、72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存；VGLL2-1PCR擴增程序：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s、退火30 s(引物退火溫度見表1)、72 ℃延伸10 s，共30個循環(huán)，72 ℃延伸2 min，4 ℃保存；1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 牦牛VGLL2基因的引物序列

1.4 基因SNP位點的篩查與檢測

通過構建好的DNA池擴增牦牛VGLL2基因，PCR擴增產(chǎn)物送生物技術擎科有限公司進行正反雙向測序，運用DNAMAN 5.0將測序結果與NCBI上參考目的片段序列進行比對并校正拼接；使用Chromas軟件篩選雙峰位點(突變位點)。對于篩選到的SNPs位點利用PCR擴增產(chǎn)物直接測序法對各類群牦牛共238個個體進行分型，判定基因型。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增產(chǎn)物

用DNA池對所設計引物進行PCR擴增(圖1)。由圖1可知，PCR擴增產(chǎn)物均為單一特異性條帶，與預期大小基本一致，確定為目的基因。用BioEdit 7.0.5生物軟件查找雙峰位點，預測多態(tài)位點，結果見圖2。

2.2 VGLL2基因測序結果

對上述3對擴增產(chǎn)物進行測序，結果顯示，在VGLL2-2引物的PCR擴增片段上發(fā)現(xiàn)存在4個突變位點(圖2)，一處位于外顯子G5000A，剩余3處位于內(nèi)含子(C4868T、C4872G和G4889A)。

2.3 VGLL2基因SNPs的篩查和檢測

3個SNPs位點擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，G5000A位點包括GG、GA、AA 3種基因型，帕里牦牛包括GA和AA 2種基因型，申扎牦牛、麥洼牦牛、斯布牦牛和類烏齊牦牛包含GG、GA、AA 3種基因型；C4868T位點包括CC和CT 2種基因型，在5個群體中擁有CC和CT 2種基因型；C4872G位點包括CC和CT 2種基因型，麥洼牦牛和類烏齊牦牛含有CC和CT 2種基因型，而申扎牦牛、斯布牦牛、帕里牦牛僅存在CC基因型；G4889A位點包括GG和GA 2種基因型，麥洼牦牛和類烏齊牦牛含有GG和GA 2種基因型，而申扎牦牛、斯布牦牛、帕里牦牛僅存在GG基因型。因C4872G和G4889A位點的GC型和GA型僅在麥洼牦牛和類烏齊牦牛中發(fā)現(xiàn)。

M: DAN Marker D2000, 1、2、3：第一、二、三外顯子的PCR擴增產(chǎn)物M: DNA Marker, 1,2,3: PCR products of first, second and third exons圖1 牦牛VGLL2基因的PCR擴增產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophpresis of PCR amplified VGLL2 gene in yak

2.4 牦牛VGLL2基因的遺傳多樣性

2.4.1 基因型頻率、基因頻率及χ2適合性檢驗 由表2可知，在C4868T位點中，CC基因型在申扎牦牛、麥洼牦牛、斯布牦牛、帕里牦牛和類烏齊牦牛中的分布頻率分別為0.9623、0.7872、0.8214、0.9474和0.7727，為優(yōu)勢基因型。C4872G位點中，GG基因型在麥洼牦牛和類烏齊牦牛群體中為優(yōu)勢基因型。G4889A位點中為優(yōu)勢基因型。G5000A位點中，GA基因型在申扎牦牛、麥洼牦牛和類烏齊牦牛群體中為優(yōu)勢基因型；AA基因型在麥洼牦牛和斯布牦牛群體中為優(yōu)勢基因型。C4868T位點中，等位基因C基因頻率在5個群體中分別為0.9811、0.8936、0.9107、0.9737和0.8864，為優(yōu)勢等位基因。C4872G位點中，等位基因G在2個群體中分別為優(yōu)勢等位基因。G4889A位點中，等位基因G在5個群體中為優(yōu)勢等位基因。G5000A位點中，等位基因A在5個群體中為優(yōu)勢等位基因。

圖2 牦牛VGLL2基因DNA池部分測序Fig.2 The results of sequencing of VGLL2 fragment in yak

圖3 牦牛VGLL2基因4個SNP位點測序Fig.3 Sequencing of 4 SNP sites in VGLL2 fragment of yak

對牦牛VGLL2基因4個SNP位點進行卡方適應性檢驗(表3)，位點C4868T、C4872G、G4889A和G5000Aχ2值均未達到顯著水平(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

表2 5個牦牛類群基因4個SNP位點等位基因及基因型頻率

續(xù)表2 Continued table 2

位點Loci牦牛類群Yak group數(shù)量Quantity基因型頻率Genotypic frequency等位基因頻率Allele frequencyCCCTTTCTC4872G麥洼牦牛940.9149(86)0.0851(8)00.95740.0426類烏齊牦牛440.9545(42)0.0455(2)00.97730.0227GGGAAAGAG4889A麥洼牦牛940.9255(87)0.0745(7)00.96280.0372類烏齊牦牛440.9545(42)0.0455(2)00.97730.0227GGGAAAGAG5000A申扎牦牛530.1889(10)0.4151(22)0.3962(21)0.39620.6038麥洼牦牛940.2234(21)0.4362(41)0.3404(32)0.44150.5585斯布牦牛280.0714(2)0.3571(10)0.5714(16)0.250.75帕里牦牛1900.4211(8)0.5789(11)0.21050.7895類烏齊牦牛440.0227(1)0.5227(23)0.4545(20)0.28410.7159

表3 5個牦牛類群VGLL2基因4個SNP位點的Hardy-Weinberg平衡的χ2檢驗

2.4.2 群體遺傳多態(tài)性 運用PIC_CALC軟件計算多態(tài)信息含量，位點C4868T、C4872G和G4889A在群體中的PIC含量均低于0.25，屬于低度多態(tài)；位點G5000A在群體中的PIC含量均大于0.25低于0.5，屬于中度多態(tài)(表4)，可見不同群體的多態(tài)性程度差異較大，其中麥洼牦牛多態(tài)性含量最高，為0.3716，帕里牦牛的最低，為0.2771。

2.4.3VGLL2基因多態(tài)性與牦牛生長性狀的關聯(lián)性分析 運用SPSS16.0分析軟件中的單因素分析，對238頭牦牛個體VGLL2基因的2個SNP位點C4868T和G5000A不同基因型與體高、體斜長、胸圍、管圍和體重等生長性狀進行相關性分析(表5)。結果表明，位點C4868T與體高、體斜長、胸圍和體重均具有差異顯著性(P<0.05)。CC基因型個體體高、體斜長、胸圍和體質(zhì)量顯著高于GC基因型。位點G5000A除管圍外其他生長性狀基本遵循GA基因型個體均值略高于AA和GG基因型個體均值的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。對138頭類烏齊牦牛和麥洼牦牛個體VGLL2基因的2個SNP位點(C4872G,G4889A)不同基因型與體高、體斜長、胸圍、管圍和體重等生長性狀進行相關性分析(表5)，C4872G、G4889A位點兩種基因型在體高、體斜長、胸圍、管圍和體重等生長性狀上無顯著差異(P>0.05)。

表4 5個牦牛類群VGLL2基因4個SNP位點的遺傳多態(tài)性指標

表5 牦牛VGLL2基因位點不同基因型與生長性狀關聯(lián)性分析

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)，同列相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

Note: Different letters in the same column indicate significant difference (P<0.05), and the same letter in the same column indicates that the difference is not significant (P>0.05).

3 討 論

VGLL2基因與新生兒肌肉中的TEAD1/4形成復合物，在骨骼肌中發(fā)揮協(xié)同作用。TEAD1的過表達誘導朝向慢肌收縮表型和衛(wèi)星細胞增生的過渡[16-17]。VGLL2有助于肌肉特異性基因的TEAD依賴性調(diào)節(jié)，特別是在慢肌纖維中，以上研究表明，VGLL2基因可能對生長性狀有所影響。

目前，對VGLL2基因的研究主要集中在對人的橫紋肌肉瘤的研究[18]及對雞胚胎骨骼肌形成的研究[19]，且在其他物種上的研究多集中在調(diào)控機理上，而進行多態(tài)性研究較少，故可用于該基因多態(tài)性研究方面可供參考的文獻較少。目前，對牦牛VGLL2基因多態(tài)性及性狀相關性的研究尚未有報道。本試驗通過DNA混合池測序和直接測序法分析了牦牛VGLL2基因的3個外顯子的遺傳多樣性及其與生長性狀的關聯(lián)性，結果顯示第一外顯子和第三外顯子高度保守未發(fā)現(xiàn)突變，在第二外顯子上存在1個SNP位點G5000A和第二內(nèi)含子上有3個SNP位點(C4868T，C4872G，G4889A)，內(nèi)含子雖為基因中無編碼功能的序列，但其對基因表達調(diào)控起著重要作用[20]，研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子突變夠能影響附近的剪切供體和調(diào)節(jié)原件，進而導致基因編碼蛋白發(fā)生改變[21]。許多研究證實了這一結論，牦牛PPARδ基因第3內(nèi)含子g.10045A/G和g.10226A/G變異與體重顯著相關[22]，牦牛TMEM-18第一內(nèi)含子861(A/C)和1267(C/T)變異與體重顯著相關[23]?？梢奡NP位點(C4868T，C4872G，G4889A)變異可能不同程度影響VGLL2蛋白的活性，進而影響其有關的生長發(fā)育性狀。

Hardy-Weinberg平衡說明，4個SNP位點P值均大于0.05，處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，說明4個SNP位點受選擇、基因突變等影響較小，可能是人工選育、遷徙和遺傳漂變下處于動態(tài)平衡中，且對這些位點可以加強選擇力度。在遺傳多態(tài)性分析中，多態(tài)信息含量(PIC)、純合度(Ho)、雜合度(He)和有效等位基因(Ne)等指標從不同方向證實了群體的遺傳變異水平。群體的雜合度一般認為與遺傳多樣性密切相關，群體雜合度越高，說明群體的遺傳變異較大，遺傳多樣性較豐富[24]。群體的雜合度一般認為與遺傳多樣性密切相關，群體雜合度越高，說明群體的遺傳變異較大，遺傳多樣性較豐富[25]。多態(tài)信息含量數(shù)據(jù)顯示，位點C4868T、C4872G和G4889A在群體中屬于低度多態(tài)，低度多態(tài)可能是遺傳分化程度較低，缺乏與其他種群的基因交流，可能在該位點的遺傳變異程度較小，突變少，使得基因的純合型得以積累；位點G5000A在群體中屬于中度多態(tài)，中度多態(tài)可能是遺傳分化程度較高，與其他種群的基因交流較豐富，可能在該位點的遺傳變異程度較大，突變大。數(shù)據(jù)顯示C4868T、C4872G、G4889A僅發(fā)現(xiàn)2個基因型，分別缺失TT、CC和AA基因型，這可能是遺傳漂變所致，由于該純合基因型為致死基因，在長期的選擇中被淘汰或者是因試驗樣本數(shù)較少，后期可較大樣本量進行進一步驗證。

本研究通過對牦牛VGLL2基因4個多態(tài)位點與生長性狀進行相關性分析，結果表明，牦牛VGLL2基因C4868T位點處的不同基因型與牦牛體高、體斜長、胸圍和體重顯著相關，表現(xiàn)為CC基因型個體體高、體斜長、胸圍和體質(zhì)量顯著高于GC基因型(P<0.05)。其余3個位點的不同基因型與牦牛體高、體斜長、胸圍、管圍和體重差異不顯著(P>0.05)。因此推斷VGLL2基因上的C4868T位點可能影響牦牛的體高、體斜長、胸圍和體重，可作為與牦牛生產(chǎn)性狀相關的候選分子標記，為今后的牦牛選育提供理論依據(jù)。

4 結 論

牦牛VGLL2基因的C4868T位點與牦牛的體高、體斜長、胸圍和體重顯著相關，可作為牦牛生產(chǎn)性狀分子標記輔助育種的候選位點，可對后續(xù)牦牛的體高、體斜長、胸圍和體重性狀的選擇提供理論依據(jù)。