余 萍，董 超，姚春馨，丁玉梅，周曉罡*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術與種質資源研究所，云南 昆明 650223; 2.云南省農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室，云南 昆明 650223; 3.農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質創(chuàng)制重點實驗室，云南 昆明 650223)

【研究意義】馬鈴薯晚疫病菌是危害馬鈴薯和番茄最為嚴重的病害之一，對全球的食物生產(chǎn)構成持續(xù)的威脅[1]。馬鈴薯晚疫病菌的侵染發(fā)育是一個復雜的生物學過程，在感染和定植期間，該病原菌產(chǎn)生的細胞外效應蛋白被分泌到植物質外體，其中一些被認為是傳遞到宿主細胞質中促進感染進程。氮是氨基酸和核酸的重要組成部分。氮源在微生物的細胞周期、生長和蛋白質轉化中起著重要作用。真菌在營養(yǎng)脅迫條件下，可以通過物質的再利用維持細胞生存乃至生長，在此過程中病原菌致病基因能夠被誘導表達。因此，對馬鈴薯晚疫病菌在低氮脅迫條件下致病基因編碼的分泌蛋白如何表達，在什么條件下表達，在病菌與環(huán)境、病菌與寄主的互作中起到何種作用，還需要進行深入研究。【前人研究進展】馬鈴薯晚疫病菌作為模式生物，其基因序列的公布，為研究其復雜的生物學功能、致病性及進化提供重要依據(jù)[2-4]。有研究表明，在細菌和酵母中，氮饑餓嚴重影響其細胞周期，生長和蛋白質轉化[5]。在體外，真菌會產(chǎn)生和分泌大量的蛋白質以應對氮饑餓[6]。生長在缺氮培養(yǎng)基上的稻瘟病菌提取物處理水稻葉片，強烈誘導葉片衰老癥狀與真菌感染的組織相似[7]。類似于基因組學和轉錄組學，蛋白質組學已經(jīng)發(fā)展到采用高通量技術和方案，更快地分析大量蛋白質，以明白植物致病菌的相互作用，病菌的致病性和毒力等[8]。通過蛋白質組學，可以發(fā)現(xiàn)成千上萬的蛋白質何時，在哪里，怎樣互相交流以應答所處的環(huán)境。其中Label-free無標記定量蛋白質組學基于對離子強度變化的測量研究比較兩個或更多樣本[9]。基于Label-free的蛋白質組學雖然準確度相對較低，但具有更大的蛋白質濃度動態(tài)范圍，并且更簡單，更便宜?！颈狙芯壳腥朦c】應用基于Label-free蛋白質組學技術和生物信息學分析研究氮饑餓處理條件對馬鈴薯晚疫病菌分泌蛋白的影響?！緮M解決的關鍵問題】探究氮源是否影響馬鈴薯晚疫病菌的致病性蛋白的分泌，從而影響馬鈴薯晚疫病菌的致病性。

1 材料與方法

1.1 馬鈴薯晚疫病菌的培養(yǎng)及處理

將實驗室保存的致病疫霉NOD-1從試管轉移至固體培養(yǎng)基(黑麥70.0 g/L，番茄汁150 mL/L，瓊脂粉8.0 g/L，阿莫西林100 mg/L，五氯苯30 mg/L，利福平10 mg/L，那他霉素10 mg/L)，在17 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。缺氮處理參照Zhou等(2016)的方法[10]。將來自2份菌絲體的濾液置于冰上，在4 ℃攪拌下將100 %(NH4)2SO4緩慢加入到濾液中過夜以沉淀蛋白質，然后在4 ℃和10 000 r/min下離心10 min。將沉淀物溶于去離子水中，轉移至截止范圍為1 KD的透析袋中，并置于4 ℃的去離子水中。透析液每4 h更換一次。將透析過的蛋白質冷凍干燥并保留。

1.2 蛋白質的裂解和定量

取樣品組內合并，分別與 300 μl的 SDT裂解液混合裂解樣品，經(jīng)超聲進一步破碎，沸水浴 15 min后，12 000 r/min離心 30 min，所得上清即含目標總蛋白。利用BCA 法對目標總蛋白定量。

1.3 蛋白質的酶解和LC-MS/MS分析

經(jīng) Zeba 處理后的樣品，每份 100 μl，參照Chen等方法[11]交由上海中科新生命生物科技有限公司進行酶解和LC-MS/MS分析，獲得LC-MS/MS數(shù)據(jù)。簡言之，經(jīng)過一系列試劑的加入、離心等處理，獲得酶解后產(chǎn)物，并在OD280下定量。酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細管高效液相色譜分離后用 Q-Exactive 質譜儀(Thermo Finnigan)進行質譜分析。

1.4 Maxquant非標記分析

LC-MS/MS 原始文件均導入 Maxquant 1.3.0.5軟件進行查庫非標記定量分析。數(shù)據(jù)庫為uniprot_phytophthorainfestans_18465_20151221.fasta。主要參數(shù)：主要搜索為6×10-6，允許最多2次錯過裂解位點，碎片離子的質量公差為20×10-6，胰蛋白酶酶促切割，固定修飾：半胱氨酸的氨甲酰甲基化，可變修飾：蛋白質N端乙酰化和蛋氨酸氧化，肽和蛋白質的錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)均為0.01?；贚abel Free定量(LFQ)在MaxQuant軟件中確定的肽量化蛋白質豐度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Perseus 1.3.0.4軟件對Maxquant所得的查庫文件進行統(tǒng)計學分析。TMHMM(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)用于預測蛋白的跨膜螺旋數(shù)量。WoLF PSORT(http://wolfpsort.seq.cbrc.jp)用于預測蛋白質亞細胞定位。亞細胞定位可以提供額外的信息，支持特定蛋白質的功能。使用Gene Ontology(http://geneontology.org/)基因功能分類體系和生物信息學在線工具KEGG(https://www.kegg.jp/kegg/)對差異表達蛋白進行功能和代謝途徑分析。采用STRING數(shù)據(jù)庫[12](http://www.string-db.org/)對受氮饑餓處理的馬鈴薯晚疫病菌差異蛋白進行互作分析，構建差異表達蛋白間的互作網(wǎng)絡圖。信號肽的存在是使用SignalP服務器預測(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)[13-14]。

2 結果與分析

2.1 差異表達蛋白點的質譜鑒定

馬鈴薯晚疫病菌受氮饑餓處理后的分泌蛋白，經(jīng)label-free非標記定量蛋白質組鑒定，共有5615個肽段數(shù)和相對應的1188個蛋白質被鑒定。該試驗進行3次獨立的生物學重復。

在這些蛋白質中，以LFQ值用于表征蛋白質豐度，以比值(氮饑餓/對照)大于2.0且P值小于0.05定義為表達量上調，比值小于0.5且P值小于0.05定義為表達量下調。氮饑餓處理馬鈴薯晚疫病菌相對對照其分泌蛋白共差異表達61個，其中41個蛋白質表達量上調，20個蛋白質表達量下調(表1)。

表1 差異蛋白質點的鑒定結果

續(xù)表1 Continued table 1

登錄號IDs蛋白質Proteins分子量 (kDa)Molecular mass覆蓋率( %)Coverage表達量變化ChangeTMHsWoLF PSORTD0NUH0轉谷氨酰胺酶誘導子77.748.800.350SecretedCON__P41361抗凝血酶52.3514.600.230Endoplasmic reticulumD0MXH1碳水化合物結合蛋白60.446.000.310SecretedD0MXT1內切-1,3-β-葡聚糖酶88.9510.900.460SecretedCON__P00761胰蛋白酶24.4125.100.260-D0MRF1碳酸酐酶37.0314.500.470MitochondrialCON__P35908角蛋白65.8759.100.390MitochondrialCON__P13645角蛋白59.5150.400.320nuclearD0NMR0黃素氧還蛋白20.9548.500.500CytoplasmicCON__Q0IIK2轉鐵蛋白77.749.200.230SecretedCON__P02533角蛋白51.6244.300.320NuclearCON__P13647角蛋白62.3836.300.340NuclearD0MWU3 未知蛋白26.7724.600.360CytoplasmicD0MX07NUK681.5917.300.300nucleolarD0NPM8二聚二氫二醇脫氫酶38.2521.000.330MitochondrialD0ND14未知蛋白22.2742.900.361SecretedD0MXW5組蛋白H315.3416.900.460NuclearD0N6Y2未知蛋白42.2919.400.350SecretedCON__Q86YZ3角蛋白282.3922.200.380NuclearCON__P08779角蛋白51.2745.500.240Nuclear

2.2 亞細胞定位分析

圖1 差異蛋白的亞細胞定位分析Fig.1 Subcelluar location of differently proteins

由圖1可知，61個差異表達蛋白質定位在細胞的6個部位，其中在質膜和內質網(wǎng)的蛋白質各有1個；細胞核上的12個，比例高達19.67 %；細胞質上的22個，比例高達36.07 %；分泌的15個，比例高達24.59 %；線粒體上的9個，比例高達14.75 %；還有1個蛋白預測不了所處位置。

2.3 差異表達蛋白的GO功能分析

使用GO功能分類系統(tǒng)對61個差異蛋白進行生物過程、分子功能和細胞位置分類(圖2)，以明確差異表達蛋白參與行駛的功能。這61個蛋白中大多數(shù)蛋白主要參與生物過程中的細胞過程(19.67 %)、代謝過程(13.11 %)和細胞成分組織或生物起源(11.48 %)；分子功能中的捆綁(32.79 %)和水解酶活性(11.48 %)；細胞位置中的細胞質(13.11 %)。

2.4 KEGG代謝途徑分析

使用KEGG在線工具對61個差異表達蛋白進行代謝途徑分析，以確定它們分別參與哪幾類生化代謝途徑。KEGG分析表明61個差異表達蛋白共參與28個代謝途徑。其中DOMUR6、DOMX78、DOMYA3、DON3B2、DON096和DONME3共6個蛋白參與碳代謝途徑，并且前4個蛋白還參與氨基酸的生物合成。另外，DOMZN9、DONBG4、DONBZ4、DONLP0 4個蛋白共同參與核糖體代謝。參與氮代謝的僅有DOMRF1蛋白。說明氮饑餓環(huán)境下主要影響馬鈴薯晚疫病菌株的碳代謝。

2.5 差異蛋白間相互作用網(wǎng)絡圖譜

61個差異表達蛋白通過STRING在線分析表明53個蛋白之間有密切的蛋白間相互作用關系，構成結構復雜的差異表達蛋白相互作用網(wǎng)絡圖。聚類分析表明53個差異表達蛋白可分為3類(圖3)。PITG＿08718、PITG＿09345、PITG＿03221、PITG＿13312、PITG＿19178、PITG＿09431這6個蛋白聚為一類。蛋白PITG＿07328、PITG＿07048、PITG＿05636、PITG＿13614、PITG＿02785、PITG＿02049、PITG＿03698、PITG＿11913、PITG＿04065聚為一類。剩下的39個蛋白為一類。

A：生物過程；B：分子功能；C：細胞位置A：Biological process；B：Molecular function；C：Cellular component圖2 差異表達蛋白的GO分析Fig.2 The GO analysis of differentially expressed proteins

圖3 差異表達蛋白的聚類互作網(wǎng)絡圖Fig.3 Clustering network map of the differentially expressed proteins

3 討 論

效應子被定義為發(fā)病相關蛋白，能夠促進感染和/或引發(fā)防御防御反應。細胞質效應子干擾植物細胞中的植物免疫。在效應子的毒力功能中起重要作用[15-18]。例如，來自致病疫霉的SNE1和CRN8可以改變宿主細胞生理學[17,19-20]。CRN效應物首先在致病疫霉中鑒定出來，可以誘導植物葉片皺縮和細胞死亡[21]。CRN效應子在N-末端具有信號肽，接著是保守的FLAK(苯丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸-賴氨酸)基序和可變的C-末端。許多先前的研究表明CRN效應子的主要活性是誘導植物細胞死亡[22]。致病疫霉的CRN1和CRN2可導致植物細胞死亡[21]。然而，近期研究表明，只有少數(shù)CRN效應物可以引發(fā)植物細胞死亡[23-24]。大多數(shù)CRN效應子可以抑制由PAMP或誘導子引發(fā)的細胞死亡[23]。最近研究顯示，CRN效應子可通過靶向不同的亞核區(qū)室和改變宿主細胞信號傳導來獲得毒力[24]。筆者研究在氮缺乏條件下，鑒定了2種不含信號肽的CRN效應子高效表達，分別比對照高出5.7、2.2倍。它們都位于細胞質中。否具有致病性尚不清楚，需要進一步研究。另外，碳代謝在生物體中有著重要作用，在氮饑餓情況下，碳代謝相關的6個蛋白質都高效表達，說明生物體能通過碳代謝彌補氮代謝的不足，但是否對致病性有影響尚待研究。

4 結 論

氮源提高致病性蛋白的分泌，影響馬鈴薯晚疫病菌的致病性。