楊方慧，夏麗飛，孫云南，陳林波*，田易萍，宋維希，梁名志

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/云南省茶樹種質(zhì)資源創(chuàng)新與配套栽培技術(shù)工程研究中心/茶葉加工與質(zhì)量安全研究中心，云南 勐海 666201；2.云南省茶學(xué)重點實驗室，云南 勐海 666201)

【研究意義】花是被子植物特有的繁殖器官，由4輪花器官構(gòu)成。由內(nèi)到外依次為雌蕊、雄蕊、花瓣、萼片[1]。植物花器官的形成與發(fā)育一直是植物學(xué)研究的熱點。而茶樹開花結(jié)果，直接影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，探究影響及調(diào)控茶樹花繁殖發(fā)育基因具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對雙子葉模式植物擬南芥、金魚草各類花器官同源異型突變體的研究發(fā)現(xiàn)，MADS-box轉(zhuǎn)錄因子形成了經(jīng)典的ABCDE花發(fā)育模型，參與花器官發(fā)育和生殖分生組織屬性決定[2-4]。該模型全面地闡述了參與花器官形態(tài)建成中各基因之間的協(xié)調(diào)關(guān)系，萼片發(fā)育由A、E類基因調(diào)控，花瓣發(fā)育由A、B、E類基因共同調(diào)控，雄蕊發(fā)育由B、C、E類基因共同調(diào)控，心皮發(fā)育由C、E類基因調(diào)控，胚珠發(fā)育由D、E類基因調(diào)控[3,5]。在ABCDE花發(fā)育模型中，E類功能負責(zé)調(diào)控四輪花器官的形成[6-7]，是MADS-box轉(zhuǎn)錄因子中重要的一類功能基因。茶樹花由花托、花萼、花冠、雄蕊群和雌蕊組成，屬完全花[8]。但是有關(guān)茶樹花器官的形成和發(fā)育相關(guān)的研究較少。【本研究切入點】云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所科技人員通過人工雜交獲得一株花瓣、雄蕊、雌蕊均發(fā)育不正常的特異茶樹種質(zhì)，主要表現(xiàn)為一是花瓣不能正常展開，至花脫落雄蕊群依然緊實不像正?；ㄒ粯映梢唤z一絲狀，花絲短，且花藥發(fā)育不完全；二是雌蕊呈畸形，每朵花均有2～4簇發(fā)育不完全的雌蕊，每簇雌蕊花柱分裂成較細的2～5裂不等，柱頭極小。課題組前期對正常父本花和母本花以及雜交后代不育花的轉(zhuǎn)錄組差異分析[9-10]，篩選出一條與AGL9基因高度同源的基因序列，通過設(shè)計特異引物進行驗證，獲得含有完整編碼的AGL9基因CDS序列?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對AGL9基因的基本生物信息學(xué)特征進行分析，并檢測AGL9基因在正?；ê筒挥ㄖ械谋磉_規(guī)律，探討其可能是調(diào)控茶樹花繁殖發(fā)育的重要因素，為深入研究茶樹花不育機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗基地的云抗10號茶樹芽、葉、莖、幼果、花芽、花蕾、含苞待放花、花瓣、雄蕊、雌蕊，以及不育茶樹花芽、花蕾、含苞待放花、花瓣、雄蕊、雌蕊為材料。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

上述樣品總RNA的提取選用美國Invitrogen公司的Trizol試劑盒。RNA的濃度檢測采用微量分光光度計Nanodrop 2000、完整性分析采用1 %的瓊脂糖凝膠電泳。用于基因驗證的cDNA采用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒。用于實時熒光定量PCR分析的cDNA采用RevertAid Premium Reverse Transcriptase合成試劑盒。

1.3 CsAGL9基因CDS片段驗證

根據(jù)CsAGL9基因CDS序列，利用primer premier 5.0軟件設(shè)計2對特異引物(表1)進行CsAGL9基因的擴增驗證。CsAGL9基因的測序分析由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.4 CsAGL9基因序列的生物信息學(xué)分析

利用網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/的Blastp和網(wǎng)站http://smart.embl.de/的SMART進行CsAGL9蛋白比對和結(jié)構(gòu)分析；利用BioXM2.6軟件分析CsAGL9蛋白的氨基酸組成、多重序列比較以及同源性分析；通過網(wǎng)站http://web.expasy.org/compute_pi/的 ExPASy工具分析CsAGL9蛋白的等電點和分子量；以及運用軟件SOPMA預(yù)測CsAGL9蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

1.5 qRT-PCR分析CsAGL9基因組織特異性表達

根據(jù)驗證后的CsAGL9基因序列，利用primer premier 5.0軟件設(shè)計熒光定量PCR引物(表1)。以茶樹GAPDH基因(GE651107.1)為內(nèi)參，利用BBI的SG Fast qPCR aster Mix定量PCR試劑盒以及采用德國LightCycler 480熒光定量PCR儀進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 7 s，57 ℃ 10s，72 ℃ 15 s，共45個循環(huán)；72 ℃延伸15 s。設(shè)實驗重復(fù)3個，基因相對表達量采用2-ΔΔCt計算法。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 CsAGL9基因CDS驗證和序列分析

前期利用數(shù)字表達譜技術(shù)篩選出一條與MADS-box家族的AGL9轉(zhuǎn)錄因子高度同源的基因序列[9]，該基因在正常花父本花和母本花以及雜交后代不育花中差異表達，其堿基序列為1902 bp，通過NCBI中Blastx比對顯示與其他植物的AGL9蛋白同源性高，且含完整的開放閱讀框(ORF)。設(shè)計2對特征引物進行全長CDS擴增驗證，經(jīng)過高保真酶擴增(圖1)，PCR擴增產(chǎn)物回收測序拼接后獲得含有726 bp的ORF片段，編碼242個氨基酸(圖2)，命名為CsAGL9。

2.2 CsAGL9基因的生物信息學(xué)分析

通過NCBI和在線軟件SMART分析CsAGL9基因氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有2個保守功能結(jié)構(gòu)域，包括MADS盒子和K盒子，屬于MADS-box家族的E類功能基因(圖3)，說明茶樹CsAGL9具有其功能。利用在線工具ExPASy預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，其中α螺旋為51.24 %，無規(guī)則卷曲為35.12 %，延伸鏈為9.09 %，β-轉(zhuǎn)角為4.55 %。通過CsAGL9的氨基酸同源序列比對，發(fā)現(xiàn)與黃瓜(Cucumissativus，登錄號為XP_004140534.1)、橡膠樹(Heveabrasiliensis，登錄號為XP_021644266.1)和可可(Theobromacacao，登錄號為XP_007043947.1)的AGL9相似性為91 %，與馬鈴薯(Solanumtuberosum，登錄號為XP_006352168.1)的相似性為90 %(圖4)。

M為DL10 000 marker; 1，2為擴增的中間片段M is DL10 000 marker; 1 and 2 are the amplified intermediate fragments圖1 CsAGL9基因CDS驗證擴增產(chǎn)物Fig.1 CDS validation products of CsAGL9 gene

CsAGL9蛋白質(zhì)的相對分子量為27.67 kD，等電點為8.96，為堿性蛋白質(zhì)。利用在線工具SOPMA 對CsAGL9

圖2 CsAGL9 CDS與推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 CDS sequences of CsAGL9 and their deduced amino acids

圖3 CsAGL9蛋白功能性位點分析Fig.3 Functional site analysis of CsAGL9 protein

圖4 CsAGL9與其他AGL9基因的氨基酸比對Fig.4 Comparison of amino acid sequences of CsAGL9 with other reported AGL9 proteins

2.3 茶樹CsAGL9基因的表達特征分析

采用qRT-PCR技術(shù)，分析茶樹CsAGL9基因在正?；ê筒挥ǖ幕ò?、雄蕊、雌蕊中的表達特征發(fā)現(xiàn)，CsAGL9基因在不育花的花瓣和雄蕊中的表達量分別高于正?；ǖ?.75和4.41倍(圖5)，而在雌蕊中不育花低于正?；?，是正?；ǖ?.8倍。這些結(jié)果說明了CsAGL9基因在不育花瓣、雄蕊、雌蕊形成中發(fā)揮重要的作用。同時還發(fā)現(xiàn)CsAGL9在莖中表達量最高，在葉片和果中表達量最低(圖6)，說明CsAGL9的表達具有組織特異性。

3 討 論

MADS-box基因是廣泛存在于動物、植物和真菌中的一類編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因家族，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子在決定植物花器官的形成和發(fā)育等方面發(fā)揮著重要的作用[11-14]。目前有關(guān)MADS-box基因與花器官發(fā)育之間的關(guān)系研究最為清楚，即著名的花發(fā)育相關(guān)ABCDE模型[3,15]。花是茶樹繁育后代的重要生殖器官，花器官的正常發(fā)育是茶樹繁衍的重要條件[8]。另外，茶樹是一種重要的葉用經(jīng)濟作物，據(jù)報道茶樹在開花結(jié)實期間將消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致茶樹鮮葉產(chǎn)量減少和品質(zhì)降低[9]。因此，開展茶樹花發(fā)育機制的相關(guān)研究具有提高茶葉價值的重要理論意義和實踐意義栽培茶樹的主要目的是獲得繁茂的芽葉，本研究利用課題組前期獲得的1條與AGL9基因高度同源的基因序列[9]，驗證克隆了1個含有完整編碼的茶樹AGL9基因，該基因含有1個726 bp的開放閱讀框，編碼242個氨基酸，與多種植物AGL9蛋白具有較高的相似性，并且含有MADS盒子和K盒子2個保守功能結(jié)構(gòu)域，屬于MADS-box家族的E類功能基因。E功能基因與API/FUL基因一樣，僅存在于被子植物中，包含SEP 1/2/3/4(SEPALLATA1/2/3/4)(曾命名AGL2，4，9和3)，是花器官發(fā)育的關(guān)鍵因子[15-16]。E類轉(zhuǎn)錄因子通過與ABC類蛋白形成四聚體復(fù)合物來調(diào)控和誘導(dǎo)花器官的形成。擬南芥中AP1-AP3-PI-SEP四聚體復(fù)合物決定花瓣的形成，AP3-PI-AG-SEP決定雄蕊的形成，AG-AG-SEP-SEP決定心皮的形成[3,15]，這些蛋白質(zhì)復(fù)合物通過激活或抑制不同的花器官特征基因發(fā)揮功能[17-19]。SEP蛋白可作為高級復(fù)合物的“粘合劑”，在四因子模型中發(fā)揮著必不可少的中心作用[20-23]。本研究結(jié)果表明，CsAGL9基因的表達量在茶樹正?；ê筒挥ǖ幕ò?、雄蕊、雌蕊中均出現(xiàn)差異性，有可能是導(dǎo)致茶樹花不育的一項重要原因。說明以MADS-box為基礎(chǔ)的花發(fā)育模型基因在茶樹花中差異表達，對決定茶樹花不育機制方面具有重要作用，直接影響茶樹花的生理及發(fā)育。下一步將開展CsAGL9功能驗證，進一步解析該基因在茶樹花器官形成和發(fā)育中的功能和作用機制。

圖5 CsAGL9在花不同組織中的表達特征Fig.5 The expressions of CsAGL9 in different tissues of flowers

圖6 CsAGL9組織特異性表達模式Fig.6 The tissue specific expression pattern of CsAGL9

4 結(jié) 論

茶樹CsAGL9基因?qū)ò?、雄蕊、雌蕊等花器官的形成和發(fā)育扮演重要的作用。