張曉東 李彩霞 王元忠

摘要：克隆滇龍膽7-脫氧番木鱉酸-7-羥化酶基因GrDL7H，并進行表達分析，為龍膽苦苷生物合成途徑的解析奠定基礎。根據滇龍膽轉錄組GrDL7H序列，使用RT-PCR（逆轉錄PCR）和3′RACE（cDNA末端快速擴增）技術從滇龍膽幼葉中克隆該基因及其啟動子，并進行序列分析和組織特異性表達分析。結果表明，GrDL7H基因（登錄號：KT306971）全長2 154 bp，包含5個外顯子和4個內含子，其中GrDL7H基因（登錄號：KP340980）開放閱讀框長 1 542 bp，編碼513個氨基酸;GrDL7H蛋白質相對分子質量為59.08 ku，等電點（pI值）為8.88，屬于CYP450蛋白超家族成員，可能定位于葉綠體;GrDL7H蛋白質無信號肽，為親水穩(wěn)定蛋白質，主要由α-螺旋和環(huán)構成;GrDL7H蛋白質具有CYP450蛋白質保守結構域，功能為參與氧化還原反應;滇龍膽GrDL7H蛋白質與黃金雞納樹CcDL7H蛋白質的親緣關系最近;GrDL7H基因啟動子主要包含6個光應答元件、1個赤霉素應答元件、6個參與茉莉酸甲酯應答的順式調控元件和1個熱脅迫應答元件等;組織特異性表達分析結果表明，GrDL7H基因主要在葉片中表達。

關鍵詞：滇龍膽;7-脫氧番木鱉酸-7-羥化酶;基因克隆;表達分析

中圖分類號： S188;Q78 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0076-06

滇龍膽（Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl.）為多年生草本植物，主要分布于云南、四川等地，其根部主要用來治療肝炎和膽囊炎[1-2]。目前，由于滇龍膽的市場需求量逐年增加，野生滇龍膽遭到人為大肆破壞[3]。從合成生物學角度來看，滇龍膽的主要藥效成分為龍膽苦苷，要大量合成龍膽苦苷，首先必須先弄清龍膽苦苷的生物合成途徑及其調控機制。

萜類生物合成途徑包括基本前體形成、碳骨架結構形成和萜類化合物的結構后修飾3個階段[4]。7-脫氧番木鱉 酸-7-羥化酶（CrDL7H）是萜類龍膽苦苷生物合成途徑第二階段重要的酶，能夠催化7-脫氧番木鱉酸生成番木鱉酸[5]。在長春花中，有研究者通過病毒誘導的基因沉默技術鑒定了 7- 脫氧番木鱉酸-7-羥化酶，CrDL7H基因沉默后，裂環(huán)番木鱉苷含量減少了70%，7-脫氧番木鱉酸鮮質量含量增加到4 mg/g，且在裂環(huán)番木鱉苷途徑中羥基化先于羧基氧甲基化[5]。使用表達CrDL7H酶的酵母微體進行酶動力學分析，結果表明其米氏常數Km和最大速率Vmax分別為（111.07±14.80） μmol/min和（5.50±0.77） μmol/min[6]。目前，CrDL7H酶基因已從長春花、小曼長春花、蘿芙木、秀麗藤、金銀花、金雞納樹、水甘草等許多植物中分離[5]，但是目前僅在長春花中進行過詳細的研究。DL7H基因表達具有組織特異性。在川西獐牙菜中，SmDL7H基因在葉中的表達量最高，其次是莖和花，在根中的表達量最低;并且與G10H、IS、IO、SLS2等基因表達量相比，DL7H基因的表達量相對較低[7]。在長春花中，CrDL7H基因主要在葉中表達，在第1對葉中表達量最高，在第2、3、4、5對葉中的表達量逐漸降低，且對應的長春堿與裂環(huán)番木鱉苷的含量逐漸減少;其次是莖和花，表達量最低的為根[8]。

目前，由于龍膽科植物的基因組并未測序，導致龍膽苦苷生物合成途徑并不完全清楚[9]。本研究根據筆者于2013年在滇龍膽轉錄組數據庫中檢索的GrDL7H基因序列，設計特異性引物，通過逆轉錄PCR（RT-PCR）技術成功從滇龍膽葉片中擴增到GrDL7H基因，然后根據所克隆基因序列設計引物，對該基因的啟動子序列進行擴增和分析，最后對二年生滇龍膽根、莖、葉、花等不同組織中GrDL7H基因的表達情況進行分析，以期為滇龍膽龍膽苦苷生物合成途徑的解析提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

基因克隆和啟動子擴增所用材料為滇龍膽無菌苗幼葉，采自玉溪師范學院分子生物學實驗室，經云南省農業(yè)科學院藥用植物研究所金航研究員鑒定為滇龍膽，采樣日期為2014年5月17日。qPCR（實時定量基因擴增）分析使用的二年生滇龍膽植株采自臨滄市云縣臨滄耀陽生物藥業(yè)科技有限公司后箐基地，由該公司技術經理董順福鑒定為滇龍膽，采樣日期為2018年4月30日。

1.2 試驗方法

1.2.1 GrDL7H基因的擴增 采用多糖植物組織提取試劑盒提取滇龍膽幼葉總RNA，采用逆轉錄試劑盒合成cDNA，采用植物基因組DNA提取試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]提取滇龍膽葉片DNA。根據前期測序的滇龍膽轉錄組GrDL7H基因轉錄本序列，設計1對特異引物GrDL7H EcoRⅠ-F、GrDL7H-R（表1）。以cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系如下：PrimeSTAR Max Premix（2×，TaKaRa）25 μL，cDNA模板2 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，加ddH2O補足50 μL。PCR反應條件如下：98 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，30個循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，然后割膠，使用膠回收試劑盒（德國QIAGEN）對目的片段進行回收，將其連接到pMD19-T載體上。轉化大腸桿菌DH5α[寶生物工程（大連）有限公司]后進行藍白斑篩選，挑取12個白斑搖菌;使用試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）提取質粒，經酶切檢測正確后進行測序[生工生物工程（上海）股份有限公司]，獲得重組質粒pMD19-fGrDL7H。根據測序結果，設計基因特異性引物GrDL7H 3RACE-F，進行3′ cDNA末端快速擴增（RACE）。使用DNAMAN軟件比對后，進行基因片段拼接，獲得GrDL7H基因ORF（開放閱讀框）全長。設計基因特異性引物，分別以cDNA和gDNA為模板進行PCR擴增，PCR產物進行TA克隆后，分別進行DNA測序。

1.2.2 GrDL7H基因啟動子的克隆 根據“1.2.1”節(jié)中克隆到的滇龍膽GrDL7H基因序列，設計基因特異引物GrDL7H-sp2和GrDL7H-sp3（表1）。采用Universal Genome Walker 2.0試劑盒，分別使用DraⅠ、EcoR V、PuvⅡ和StuⅠ酶切滇龍膽基因組DNA，加接頭后，構建文庫DL1、DL2、DL3和DL4，然后進行2輪PCR擴增。第1輪PCR總體系為25 μL，具體成分如下：DL1 g DNA 1 μL，50×Advantage 2聚合酶混合物0.5 μL，10×Advantage 2 PCR Buffer 1 μL，AP1（10 μmol/L）1 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，GrDL7H-sp2（10 μmol/L）1 μL，ddH2O 19.5 μL，反應條件為94 ℃ 25 s、72 ℃ 3 min，7個循環(huán);94 ℃ 25 s、67 ℃ 3 min，32個循環(huán);63 ℃ 7 min。第2輪PCR總體系為25 μL，具體成分如下：第1輪PCR產物 1 μL，50×Advantage 2聚合酶混合物0.5 μL，10×Advantage 2 PCR 1 μL，AP1（10 μmol/L） 1 μL緩沖液，dNTP（10 mmol/L）1 μL，GrDL7H-sp3（10 μmol/L）1 μL，ddH2O 19.5 μL，反應條件為94 ℃ 25 s、72 ℃ 3 min，5個循環(huán);94 ℃ 25 s、67 ℃ 3 min，20個循環(huán);63 ℃ 7 min。第2輪PCR產物經TA克隆，獲得重組質粒pMD19-pGrDL7H，菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司進行DNA測序。

1.2.3 GrDL7H基因及啟動子的生物信息學分析 用美國國立生物技術信息中心（NCBI）網站的BLAST程序進行序列比對，用Genetyx 6.1.8軟件進行翻譯，用DNAMAN 7進行多序列比對;用Clustal X 2.1進行比對，然后使用MEGA 6.0軟件內置的NJ（鄰接）法構建系統進化樹，設置Bootstrap（自抽樣）=1 000;利用在線數據庫（http：//molbiol. edu.ru/eng/scripts/01_11.html）進行稀有密碼子分析。使用ChloroP服務器v 1.1進行葉綠體轉運肽預測;使用Interpro軟件進行保守結構域預測;使用ProtScale軟件進行疏水性分析，方法為Hphob./Kyte & Doolittle量表法;使用PredictProtein對二級結構進行預測;使用Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）對三級結構進行預測;利用Expasy中的TMHMM工具預測蛋白質的跨膜螺旋區(qū);利用在線工具Wolf Psort預測蛋白質的亞細胞定位情況。使用GT-AG原則，將ORF序列與gDNA序列進行比對，進行外顯子與內含子的分析。使用啟動子在線分析網站PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對克隆到的GrDL7H基因啟動子序列進行分析。

1.2.4 GrDL7H基因的熒光實時定量分析 分別取二年生滇龍膽的根、莖、葉、花，使用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit[寶生物工程（大連）有限公司]提取總RNA，使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser[寶生物工程（大連）有限公司]處理除去基因組DNA，然后反轉錄合成第1鏈cDNA。以轉錄組中GrACTIN基因（GenBank登錄號為KM061807）作為內參和GrDL7H基因ORF序列設計特異性引物（表1）。PCR體系如下：TB GreenPremix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）10 μL，ddH2O 7 μL，cDNA 1 μL，正反向引物各1 μL。qPCR條件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，重復4次。在LightCycler 480 Ⅱ熒光定量PCR儀（Roche，瑞士）上進行擴增反應，擴增曲線、溶解曲線、標準曲線由軟件自動生成。使用內參基因GrACTIN表達校準后，計算根、莖、葉中GrDL7H基因的相對表達量。采用比較CT值的2-ΔΔCT的方法進行定量數據的分析處理。

2 結果與分析

2.1 滇龍膽GrDL7H基因的克隆

以滇龍膽幼葉cDNA為模板，使用表1中的基因特異性引物GrDL7H EcoRⅠ-F和GrDL7H-R擴增出約1 500 bp的片段。通過TA克隆獲得重組質粒pMD19-fGrDL7H，然后進行DNA測序。結果表明，fGrDL7H長1 502 bp，不含3′末端。使用SMART RACE試劑盒進行擴增，獲得600 bp DNA片段（圖1-A）。使用DNAMAN軟件對GrDL7H基因片段進行組裝，結果發(fā)現GrDL7H基因ORF全長1 542 bp（圖1-B，登錄號：KP340980）。使用GrDL7H EcoR Ⅰ-F和GrDL7H EcoR Ⅰ-R對GrDL7H基因的基因組DNA（gDNA）進行擴增，結果顯示GrDL7H基因長2 154 bp（圖1-C，登錄號：KT306971），包含5個外顯子和4個內含子（圖1-D）。

2.2 GrDL7H基因的生物信息學分析

2.2.1 GrDL7H基因的ORF分析和多序列比對分析 利用Genetyx 6軟件對GrDL7H基因的ORF序列進行分析，該基因（GenBank登錄號為KP722033.1）長1 542 bp，編碼513個氨基酸。

利用GenBank數據庫的BLASTP程序對GrDL7H蛋白質進行比對分析，結果表明，滇龍膽GrDL7H與蘿芙木RsDL7HT（78.17%）、黃金雞納樹CcDL7H（77.78%）、長春花CrDL7H（77.73%）的序列相似性均較高，與擬南芥AtDL7H（51.47%）的蛋白質相似性稍低。利用DNAMAN 7將GrDL7H蛋白質序列與NCBI中相似性較高的部分序列進行多序列比對分析，結果表明，GrDL7H蛋白質與已知蛋白質序列的保守性較高（圖2）。利用MEGA 7.0軟件將GrDL7H氨基酸序列與NCBI中相似性較高的部分序列進行系統發(fā)育分析，結果顯示，滇龍膽GrDL7H蛋白質與黃金雞納樹CcDL7H的親緣關系較近（圖3）。

2.2.2 GrDL7H蛋白質的理化特性分析 使用ExPASy ProtParam tool對GrDL7H蛋白質進行分析，結果表明，GrDL7H蛋白質單體的相對分子質量為59 077 u，理論等電點（pI值）為8.88，這與長春花CrDL7H蛋白質類似[8];帶正電氨基酸殘基（Arg+Lys）為70個，帶負電氨基酸殘基（Asp+Glu）為63個，化學方程式為C2 686H4 240N708O743S23;不穩(wěn)定指數為31.37，屬穩(wěn)定蛋白質;脂肪指數為94.81;總平均疏水性（GRAVY）為-0.173，為親水蛋白質（圖4）。GrDL7H蛋白質含有20種基本氨基酸，其中亮氨酸含量最高，為11.9%;其次是賴氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸，含量分別為7.60%、6.40%、6.40%;半胱氨酸含量最低，為1.00%。

2.2.3 GrDL7H蛋白質的二級結構、三級結構分析 利用PredictProtein軟件對GrDL7H蛋白質進行二級結構分析，結果表明：該蛋白質二級結構中α-螺旋（H）占54.58%，環(huán)（L）占37.43%，延伸帶（E）占7.99%。利用Phyre 2軟件預測GrDL7H蛋白質的三級結構，結果見圖5，該模型以細胞色素p4504b1酶[c5t6qA]為模板，在第15～513位氨基酸處建模，序列相似度為24%。

2.2.4 GrDL7H蛋白質序列的分析歸類 使用InterPro 6.0在線工具對GrDL7H蛋白質進行分析和歸類，結果表明，GrDL7H蛋白質屬于細胞色素P450超家族E類、類群Ⅰ（IPR002401）的成員，包含細胞色素P450保守結構域（IPR036396）（圖6）。GO預測結果表明，在生物過程方面GrDL7H蛋白質參與氧化還原過程，在分子功能方面，該蛋白質參與鐵離子結合、氧化還原酶活性、血紅素結合，在細胞成分方面未預測到結果。

2.2.5 GrDL7H蛋白質信號肽分析 利用ExPASy SignalP 41服務器分析GrDL7H蛋白質，未發(fā)現信號肽，表明該蛋白質為非分泌型蛋白質。利用TMHMM 2.0工具預測GrDL7H蛋白質的跨膜螺旋區(qū)，結果表明：GrDL7H蛋白質在5～27位氨基酸含有跨膜區(qū)域，其余的1～4位氨基酸在細胞內，28～513位氨基酸在細胞外（圖7）。

2.2.6 GrDL7H蛋白質亞細胞定位分析 使用WoLF PSORT軟件進行GrDL7H蛋白的亞細胞定位分析，結果顯示，GrDL7H蛋白質在葉綠體、細胞核、核骨架、細胞膜、細胞質、液泡的定位系數分別為 6.0、3.5、2.5、2和1.0。

2.2.7 GrDL7H基因稀有密碼子分析 使用在線軟件對GrDL7H基因進行稀有密碼子分析，結果表明，在大腸桿菌和釀酒酵母中，GrDL7H基因中稀有密碼子分別占1.36%、0.19%，且均無二聯或三聯稀有密碼子連續(xù)出現的情況，因此可選用大腸桿菌表達菌BL21、Rosetta（DE3）或釀酒酵母進行蛋白質表達。

2.3 GrDL7H基因啟動子的克隆

以滇龍膽葉片DNA為模板，使用基因特異性引物分別進行2輪PCR擴增， 第2輪PCR擴增產物通過TA克隆獲得重組質粒pMD19-pGrDL7H，測序后，上傳至NCBI數據庫，獲得登錄號（GenBank登錄號：MG832585）。對獲得的GrDL7H啟動子進行生物信息學分析，結果表明，該啟動子不但在-30區(qū)域附近含有轉錄起始的核心啟動子元件TATA盒，而且含有啟動子和增強子區(qū)域通用順式作用元件CAAT盒;此外，還具有6個光應答元件、 1個赤霉素應答元件、6個參與茉莉酸甲酯應答的順式調控元件、1個熱脅迫應答元件和1個參與生物鐘控制的順式調控元件（表2）。

2.4 GrDL7H基因的組織表達分析

取二年生滇龍膽的根、莖、花和葉，通過熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測GrDL7H基因在根莖花葉等不同組織中的表達情況。結果顯示，GrDL7H基因表達量最高的組織是葉，其表達量大約分別是根、莖、花中的50、32、6倍;其次是花，表達量最低的是根（圖8）。這與川西獐牙菜SmDL7H基因在根莖葉花中的表達模式類似[7]。在長春花中，CrDL7H基因主要在葉中表達，隨著葉齡的增加，其表達量逐漸降低，相應的長春堿與裂環(huán)番木鱉苷的含量逐漸減少;其次是莖和花，表達量最低的是根[8]。這些結果表明，葉是滇龍膽龍膽苦苷生物合成的主要場所。

3 討論

滇龍膽的主要藥效成分為龍膽苦苷，屬于環(huán)烯醚萜類物質。該類物質的合成主要包括3個階段，第1階段是通過甲羥戊酸（MVA）和甲基赤蘚糖-4-磷酸（MEP）途徑合成IPP（異戊烯焦磷酸）和DMAPP（二甲基丙烯基二磷酸-三銨鹽）的基本前體，第2階段是IPP和DMAPP在異戊烯基轉移酶和萜類合酶作用下形成萜類化合物和中間產物，第3階段是萜類化合物的碳骨架結構在后修飾酶的催化下，分別進行羥基化、甲基化、糖基化等，形成結構穩(wěn)定、具有活性的萜類化合物[4]。為闡明龍膽苦苷生物合成途徑及其調控機制，本研究克隆了1個萜類合成第2階段的GrDL7H基因，其表達情況可能影響龍膽苦苷的生物合成。由于許多萜類合成途徑中的底物不能通過商業(yè)化途徑獲得，導致學界對DL7H基因的研究較少，目前研究比較清楚的僅有長春花中的CrDL7H基因。本研究從滇龍膽幼葉中克隆獲得GrDL7H基因，通過多序列比對分析，表明滇龍膽GrDL7H與其他植物DL7H蛋白質具有較高的相似性，特別是與長春花CrDL7H蛋白質的序列相似性高達77.73%，表明二者具有相似的結構與功能。在系統發(fā)育分析中，滇龍膽GrDL7H與黃金雞納樹CcDL7H的親緣關系較近，且GrDL7H蛋白質具有典型的CYP450蛋白質結構域，屬于E類家族成員，這些結果表明，所克隆的基因為DL7H基因。

在長春花中，CrDL7H基因在根、莖、葉、花芽和花中均有表達，但在第1對幼葉中的表達量遠遠高于其他組織[8]。組織表達特異性研究結果表明，滇龍膽GrDL7H基因在葉中的表達量最高，遠遠高于根、莖和花，因此推測滇龍膽葉片為龍膽苦苷生物合成的主要器官，這與朱宏濤等的研究結果[10]一致。目前研究表明，滇龍膽全株可以入藥[11-12]，但其根中龍膽苦苷含量最高[13]。因此，根中的龍膽苦苷主要是由葉片和莖中合成的龍膽苦苷通過運輸到達根中進行積累而成的。

在真核生物基因中，啟動子由核心啟動子和上游啟動子2個部分組成，是位于轉錄起始位點及其5′端上游近端大約100～200 bp的1組具有獨立功能的DNA序列，每個元件長度約為7～20 bp，是決定RNA聚合酶轉錄起始和轉錄頻率的關鍵元件[14]。本研究擴增到的滇龍膽GrDL7H基因啟動子片段大小為818 bp，不但具有核心啟動子TATA盒上游啟動子CAAT盒，而且具有6個光應答的元件、1個參與赤霉素應答元件、6個參與茉莉酸甲酯應答的順式調控元件、1個熱脅迫應答元件、1個參與生物鐘控制的順式調控元件，表明GrDL7H基因的表達受光、赤霉素、茉莉酸甲酯、熱脅迫、生物鐘等多種因素的調控，這同時也表明，可通過調控基因表達來提高龍膽苦苷的含量。

本研究為滇龍膽GrDL7H基因功能的解析奠定了基礎。今后將對GrDL7H基因進行蛋白質表達、純化和酶活分析、基因調控機制分析來研究其功能，從而為龍膽苦苷生物合成途徑及其調控機制的闡明奠定基礎。

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