徐君 江君 王歡

摘要：旨在篩選荷花淹水脅迫過程中表達穩(wěn)定的內參基因，使不同脅迫處理下荷花目標基因的定量更為準確。以不同淹水脅迫時間的荷花葉片為材料，利用實時定量PCR技術驗證5個植物常用內參基因，包括18S rRNA（18S）、actin（ACT）、elongation factor 1α（EF1α）、Histone H3（HIS）及β-tubulin（TUB）的表達水平，結合GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件對結果進行分析，對其表達穩(wěn)定性進行評價。將優(yōu)選的2個內參基因（18S和ACT）應用于荷花轉錄因子基因ERFB2-1（ethylene responsive factor B2-1）和ERFB2-2的淹水脅迫表達，結果顯示表達趨勢一致，驗證了可靠性。本研究對荷花淹水脅迫過程中關鍵基因表達的qRT-PCR分析有重要的應用價值。

關鍵詞：荷花;淹水脅迫;qRT-PCR;內參基因

中圖分類號： S682.320.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0050-04

荷花（Nelumbo nucifera）是蓮科蓮屬的多年生挺水植物，是我國十大名花之一[1]。荷花原產我國，具有分布范圍廣、種質資源豐富、群體花期時間長及葉色碧綠等特點，深受人們的喜愛，加上經濟用途廣泛，文化底蘊深厚，因而成為極好的水景美化植物和家庭園藝常用植物[2]。荷花是一種水生花卉，環(huán)境的變化使荷花時常要面對淹水脅迫影響[3]，因此，耐淹水脅迫資源和基因的挖掘是荷花育種目標之一。

隨著分子生物學的不斷發(fā)展，功能基因研究已成為植物耐脅迫育種的重要輔助手段，而基因的表達分析則是植物功能基因研究的基礎[4-5]。在比較耐淹荷花品種和淹水敏感型荷花品種功能基因差異表達的研究過程中，較多的涉及到應用實時定量PCR（quantitative real-time PCR，簡稱qRT-PCR）驗證和分析基因的表達模式和水平，為了校正不同樣本RNA提取效率、質量、反轉錄及擴增效率上的差異，試驗中需要用到在實驗條件下細胞中能夠恒定表達的基因也就是內參基因作為標準[6-7]，因此，篩選淹水脅迫條件下穩(wěn)定表達的內參基因對qRT-PCR試驗結果的可靠性有著關鍵的作用。

迄今，國內外對黃花蒿[8]、天藍苜蓿[9]、牡丹[10]等多種植物在不同試驗條件下進行了內參基因的篩選，對荷花花瓣著色過程中內參基因的穩(wěn)定性也有研究報道[11]，但對荷花在淹水脅迫條件下內參基因的篩選則沒有報道。本研究選取了植物研究中常用的內參基因18S核糖體RNA（18S）、肌動蛋白（ACT）、轉錄延伸因子（EF1α）、組蛋白H3（HIS）及微管蛋白（TUB）作為候選基因，研究荷花不同淹水脅迫時間下這5個基因的表達，利用內參基因穩(wěn)定性參考軟件BestKeeper[12]、GeNorm[13]及NormFinder[14]對其穩(wěn)定性進行了評價，為后續(xù)探索荷花耐淹水脅迫條件下的基因表達分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以2015年9月在河北白洋淀原生境收集的荷花“白洋淀紅蓮”種子為材料，種子曬干后保存。2017年5月，對種子尾部破殼，在25 ℃及16 h/d光照條件下浸種，胚軸發(fā)生1～2周后，選取芽長度一致的小苗用于淹水脅迫試驗。淹水試驗在培養(yǎng)箱內的水桶中進行，以小苗全部浸沒水中為處理組，淹水脅迫時間為1、2、4、12 h，以未淹水處理荷花幼苗作對照。采集葉片，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 葉片總RNA提取及cDNA第一鏈合成

葉片總RNA提取方法參照上海生工生物工程有限公司（簡稱上海生工）柱式植物總RNA抽提純化試劑盒（產品編號：B518661-0100）。利用瓊脂糖凝膠電泳及Nano drop2000檢測總RNA質量。cDNA第一鏈合成采用上海生工M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒（產品編號：B532435-0020）。反轉錄后經Nano drop檢測，稀釋至20 ng/μL，放置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 內參基因選擇及qRT-PCR引物設計

選擇常用的5個荷花看家基因作為內參候選基因，包括18S、ACT、EF1α、HIS及TUB（表1），根據(jù)qRT-PCR引物設計原則，采用Beacon Designer 7軟件設計引物，并在NCBI-BLAST上對引物進行特異性檢測，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。合成片段經普通PCR擴增，凝膠電泳檢測，并經熔解曲線分析驗證后，用于qRT-PCR試驗。

1.4 內參基因RT-PCR試驗及數(shù)據(jù)分析

內參基因的RT-qPCR試驗在楓嶺FTC-3000 Real-Time PCR儀完成，反應參照上海生工2×SG Fast qPCR Master Mix試劑盒（產品編號：B639271-0005）。反應體系：2×SG Fast qPCR Master mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），cDNA模板1 μL，DNF Buffer 2 μL，ddH2O補充至20 μL。每個樣本重復3次，擴增程序：95 ℃ 3 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。反應結束后，進行熔解曲線分析。所得結果分別采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 葉片總RNA提取質量及引物特異性鑒定

Nano drop2000檢測顯示，提取總RNA的D260 nm/D280 nm數(shù)值為1.9～2.0，符合后續(xù)試驗要求。以對照葉片cDNA為模板，采用表1的7對引物對5個候選基因及2個ERF轉錄因子基因進行PCR擴增，凝膠電泳結果顯示擴增產物單一，且片段大小均在100 bp左右（圖1），與預期擴增大小一致。進一步對cDNA進行qRT-PCR擴增，結果發(fā)現(xiàn)各基因的熔解曲線只有明顯的單一信號峰（圖2），說明7對引物均可特異擴增相應片段，其反應特異性高，結果可靠，可用于后續(xù)試驗。

2.2 內參基因的表達穩(wěn)定性分析

2.2.1 候選基因CT值 CT值與基因表達量成反比，CT值越大，表達量越小。圖3為5個候選內參基因在淹水脅迫處理不同時間后，在荷花葉片中qRT-PCR反應的CT值。結果

表明，5個看家基因的CT值為21～32，其中，ACT的CT值最小，為21.244 1～22.666 2，說明該基因平均表達水平最高;HIS的CT值最大，為27.498 5～31.136 1，說明該基因平均表達水平最低，且其表達量要明顯低于另外4個候選基因。

2.2.2 軟件分析候選內參基因表達穩(wěn)定性 BestKeeper、GeNorm和NormFinder是3種常用的內參基因穩(wěn)定性分析軟件。表2為3種軟件對5個候選內參基因在荷花葉片不同時間淹水脅迫處理時間下qRT-PCR反應的表達量穩(wěn)定性分析結果。BestKeeper根據(jù)內參基因的CT值計算標準偏差（SD），SD值越小，則表示該基因穩(wěn)定性越好，根據(jù)該軟件分析結果，18S與ACT的SD值最小，表明二者的表達量在荷花淹水脅迫處理過程中最為穩(wěn)定，其次為EF1α和TUB，而HIS的表達穩(wěn)定性較差。GeNome根據(jù)平均表達穩(wěn)定性指數(shù)M確定最穩(wěn)定的內參基因，M值越大，基因的穩(wěn)定性越低，根據(jù)該軟件分析結果顯示，ACT的M值最小，表達穩(wěn)定性最高，其次為18S，HIS的M值最大， 表達穩(wěn)定性最差。NormFinder使用Excel軟件計算基因的穩(wěn)定值M，M值越小，則該基因越穩(wěn)定，該軟件分析結果與GeNome一致，5個內參基因穩(wěn)定性從高到低排序為ACT>18S>EF1α>TUB>HIS。綜合表現(xiàn)看，ACT和18S為淹水脅迫不同時間處理下表達量最穩(wěn)定的2個基因。而HIS在荷花淹水脅迫過程中表達最不穩(wěn)定。

2.2.3 優(yōu)選內參基因穩(wěn)定性驗證 為進一步驗證優(yōu)選內參基因基因18S和ACT在荷花淹水脅迫過程中對qRT-PCR計算結果的影響，分別以18S和ACT為內參基因，以淹水脅迫1、2、4 h的荷花白洋淀紅蓮幼苗為材料，未淹水材料為對照，采用qRT-PCR檢測了荷花ERFB2-1和ERFB2-2基因在不同脅迫時間處理下的表達情況。結果如圖4所示，隨著淹水脅迫時間的延長，ERFB2-1表達量先明顯增加，后呈現(xiàn)先減少再增加的趨勢;而ERFB2-2的表達量則較為穩(wěn)定。以18S為內參時，目的基因ERFB2-1和ERFB2-2在荷花不同時間淹水脅迫處理下表達模式與以ACT為內參時的變化規(guī)律一致。

3 討論與結論

qRT-PCR技術以內參基因作為標準校準目的基因的表達量，具有靈敏度高、重復性好的特點，目前已成為研究中檢測或比較基因表達水平的標準技術[12]。在植物研究中，ACT、EF1α等是常用的內參基因，但近年來越來越多的研究顯示，真正恒定表達的基因不存在，脅迫條件不同，內參基因的穩(wěn)定性也不盡相同。如大豆在干旱脅迫條件下，穩(wěn)定表達的基因為TUB和EF1α[13];在鹽脅迫下穩(wěn)定的內參基因則為ACT[14];低磷脅迫下則是18S和TUB最為穩(wěn)定[15]。因此，qRT-PCR試驗前提是選擇合適的內參基因，以確保在不同因素下基因相對表達量結果的可靠和穩(wěn)定。

本研究分析了荷花白洋淀紅蓮在淹水脅迫下內參基因的穩(wěn)定性，結果顯示，GeNorm和NormFinder的分析結果一致，而與BestKeeper的分析結果存在差異，雖然3種軟件分析結果略有不同，但對大部分候選基因穩(wěn)定性的分析結果一致，其中HIS在淹水脅迫不同時間表達差異較為劇烈，而18S和ACT在荷花淹水脅迫過程中表達相對穩(wěn)定。18S核糖體RNA由于在植物體內表達穩(wěn)定、豐度高，而被認為是合適的內參基因。但近期有研究顯示，在部分植物，如小麥、苜蓿中，18S的CT值均小于15，表達豐度過高，容易忽視背景造成的差異從而影響基因定量的準確性[16]。本研究試驗條件下，荷花葉片18S的CT值在24左右，表達豐度適中，適于作為內參基因。而ACT則是最為常用的內參基因，在荷花花瓣色素形成過程中也是最穩(wěn)定的內參基因之一[11]。本研究中，以18S和ACT分別作為內參時，2個目的基因表達趨勢均一致，說明在荷花淹水脅迫qRT-PCR試驗過程中，以18S或ACT作為內參基因具有可靠性。

綜上所述，本研究認為，在運用qRT-PCR技術研究荷花淹水脅迫下基因表達時，可選用18S或ACT作為內參基因。本研究結果為進一步分析關鍵基因在荷花應對淹水脅迫中的作用研究提供了參考。

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