卓嚴玲 顏秋 鄧啟霞

摘要：熱休克蛋白（Hsp）是在各種生物體內(nèi)廣泛分布的一類具有高度保守性、短時性、多樣性等特點的熱應激蛋白質(zhì)，參與細胞的多種生理生化活動。已有研究表明，Hsp40在多種病毒感染細胞的過程中發(fā)揮重要作用，但其對豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）復制的影響及機制尚不清楚。為了探究Hsp40在PCV2感染中的生物學功能，在克隆豬Hsp40基因CDS區(qū)全基因序列的基礎上，采用雙酶切位點法分別構(gòu)建豬Hsp40基因的過表達載體和RNA干擾載體。該研究為豬Hsp40轉(zhuǎn)基因細胞株的構(gòu)建搭建好平臺，同時也為挖掘豬Hsp40對PCV2感染的響應機制提供極大的便利。

關鍵詞：豬熱休克蛋白40;過表達載體;RNA干擾載體;豬圓環(huán)病毒2型

中圖分類號： S852.65+9.2; Q78 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0063-04

豬圓環(huán)病毒2型是引起豬圓環(huán)病毒相關疾?。≒CVAD）的主要病原體[1-2]，我國于2001年首次報道該病，目前已成為危害我國規(guī)模化豬場養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要傳染病之一[3-4]。然而，直到現(xiàn)在人們對PCV2的復制機理和致病機制仍然不是很清楚，尤其對PCV2感染過程中病毒DNA和蛋白與宿主胞內(nèi)蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡及其所蘊含的生物學意義更是知之甚少。PCV2作為能夠感染哺乳動物的最小病毒之一，其基因組的編碼能力有限，必須依賴于宿主細胞內(nèi)的酶類才能完成復制增殖，因此PCV2不得不借助其病毒DNA和蛋白與宿主細胞內(nèi)的各種基因相互作用來調(diào)控宿主免疫應答，如導致細胞因子分泌失調(diào)、免疫抑制和疾病等，從而實現(xiàn)其對病毒復制和致病機制的調(diào)控[5]。其中，有關PCV2衣殼蛋白Cap與豬熱休克蛋白40（Hsp40）互作的文獻報道最早見于2009年，但至今仍無關于此研究的新進展，特別是它們二者之間是否真的互作以及這種互作所蘊含的生物學意義目前尚不清楚[5-6]。

Hsp40是一類跨物種存在的蛋白家族，存在于各種生物體的線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器中，并對蛋白翻譯、折疊、去折疊和轉(zhuǎn)運等起重要作用[7]，同時還可以通過與病毒蛋白或病毒復制復合體結(jié)合對多數(shù)病毒的復制產(chǎn)生影響[8]。其中，不僅有很多動物病毒和植物病毒，而且還涵蓋了許多DNA和RNA病毒。因此，既然已有研究表明PCV2 Cap與宿主Hsp40蛋白之間存在相互作用，那么就有必要進一步探究Hsp40對PCV2復制的影響及機制。

目前，研究某一基因的生物學功能往往須要使其正常的表達量上調(diào)或者下調(diào)，其中最常用的方法就是構(gòu)建其過表達和RNA干擾載體，其中雙酶切位點法又是構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體的最普遍方法。為此，本研究利用雙酶切位點法分別構(gòu)建豬Hsp40基因的過表達和RNA干擾載體，從而為其進一步的遺傳轉(zhuǎn)化和穩(wěn)定表達細胞系的建立奠定基礎，同時為進一步明確豬Hsp40基因在PCV2病毒感染過程中的生物學功能提供了高效便捷的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織、菌株及載體 脾臟組織采自3日齡美系大白豬，該豬呈CSFV、PRRSV和PCV2陰性;大腸桿菌DH5α，購自天根生化科技（北京）有限公司;真核表達載體pEGFP-C1和RNA干擾載體pCDH-U6-MCS-EF1-GreenPuro（簡寫為pCDH-U6），均由西北農(nóng)林科技大學張彥明教授饋贈。本試驗于2018年上半年在玉林師范學院生物與制藥學院基因工程實驗室完成。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶（EcoRⅠ和BamHⅠ）、T4 ligase、PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser和Trizol，均購自TaKaRa公司;膠回收試劑盒、高純質(zhì)粒小量提取試劑盒和UltraPower核酸染料，均購自北京百泰克生公司;DL 2000和Trans 2K plus DNA marker，均購自北京全式金公司;Pfu高保真擴增酶和溴化乙錠（EB），均購自Thermo Fisher Scientific公司;瓊脂糖，購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 根據(jù)GenBank中登錄的豬Hsp40基因序列（XM_003131409），利用Primer Premier 6.0軟件設計出用于擴增豬Hsp40基因的引物，上游引物Hsp40-F：5′-CGGAATTCTATGGCGGCTGCCGCGGAGTGCGATG-3′（下劃線為EcoRⅠ酶切位點），下游引物Hsp40-R：5′-CGGGATCCTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGCCAAACTGGAAAAAGAAATTC-3′（下劃線為BamHⅠ酶切位點，斜體為Flag標簽序列）。待測出克隆獲得的豬Hsp40基因序列后，利用Thermo Fisher Scientific公司的shRNA在線設計軟件（https：//rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/）設計出豬Hsp40基因的5對干擾序列和1對陰性對照序列[9]，引物信息詳見表1。為載體構(gòu)建鑒定需要，本研究參照文獻[9]合成了上游引物5′-TTCTTGGGTAGTTTGCAGTT-3′和下游引物5′-CGGAGCCAGTACACGACA-3′，分別命名為U6-F和U6-R。以上引物全由北京華大基因公司合成。

1.2.2 組織總RNA提取與cDNA的制備 取100 mg豬脾臟組織置于研缽中，加入適量液氮并研磨完全后，將樣品移入離心管中，利用Trizol法抽提總RNA，具體方法參見文獻[10]。待測定出所提取總RNA濃度后，按照PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser說明書制備cDNA。

1.2.3 豬Hsp40基因的擴增 以上述制備的cDNA為模板，Hsp40-F和Hsp40-R為上、下游引物，利用Pfu高保真酶進行PCR擴增，同時設立陰性對照。反應體系為：Hsp40-F 1.0 μL、Hsp40-R 1.0 μL、2×Pfu高保真酶10.0 μL、cDNA 1.0 μL，ddH2O加至20 μL。反應程序包括：95 ℃ 5 min;94 ℃ 40 s，68 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，35個循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃ 結(jié)束反應。PCR產(chǎn)物用12 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，然后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

1.2.4 豬Hsp40基因真核表達載體和RNA干擾載體的構(gòu)建與鑒定 將上述含有目的基因片段的凝膠用手術刀快速切下并放置于2.0 mL的離心管中，按照膠回收試劑盒的說明書純化出PCR產(chǎn)物，置于-20 ℃保存。將純化后的PCR產(chǎn)物和真核表達載體pEGFP-C1分別用EcoRⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，反應體系為：10×K buffer 2.0 μL、BamHⅠ 1.0 μL、EcoRⅠ 1.0 μL、PCR產(chǎn)物或pEGFP-C1載體加至20 μL。反應條件為：37 ℃ 2 h，加入2 μL 10×Loading buffer終止酶切反應。酶切產(chǎn)物再次經(jīng)電泳和膠回收后，利用T4 DNA連接酶于 4 ℃ 過夜條件下將PCR產(chǎn)物連入pEGFP-C1載體，反應體系為：T4 ligase 1.0 μL、T4 ligase buffer 1.0 μL、pEGFP-C1載體1.5 μL、PCR產(chǎn)物加至20 μL，最終得到重組 pEGFP-Hsp40載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆菌置于LB液體培養(yǎng)基（Kan+）中擴大培養(yǎng) 12～16 h，按高純質(zhì)粒小量提取試劑盒說明書提取細菌質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切驗證后，送由北京華大基因公司測序。應用DNA Star軟件（MegAlign）對克隆獲得的豬Hsp40基因序列進行比對分析。將測得的豬Hsp40基因序列拷貝進Thermo Fisher Scientific公司的shRNA在線設計軟件并按其說明設計出相應的RNA干擾序列，將合成的各shRNA干擾序列按照事先設定好的PCR程序（95 ℃ 30 s;90 ℃ 30 s;85 ℃ 30 s;80 ℃ 30 s;75 ℃ 30 s;70 ℃ 30 s;65 ℃ 30 s;60 ℃ 30 s;55 ℃ 30 s;50 ℃ 30 s）進行退火，然后使用T4 DNA Ligase將其與經(jīng)Eco RI和Bam HI雙酶切過的pCDH-U6干擾載體進行4 ℃過夜連接，分別得到5條干擾載體（pCDH-U6-Hsp40-sh1、pCDH-U6-Hsp40-sh2、pCDH-U6-Hsp40-sh3、pCDH-U6-Hsp40-sh4、pCDH-U6-Hsp40-sh5）和1條陰性對照載體（pCDH-U6-Hsp40-shN），分別簡寫為Hsp40-sh1、Hsp40-sh2、Hsp40-sh3、Hsp40-sh4、Hsp40-sh5和Hsp40-shN，統(tǒng)稱為重組干擾載體。以構(gòu)建的各重組干擾載體及pCDH-U6空載體為模板，利用引物 U6-F/U6-R 進行PCR擴增，反應條件為：95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃ 保存。PCR產(chǎn)物加入12 g/L瓊脂糖凝膠中進行核酸電泳檢測，檢測正確后送由北京華大基因公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬脾臟總RNA的提取

利用Trizol法提取豬脾臟組織總RNA后，取5 μL加入12 g/L瓊脂糖凝膠中進行檢測分析，結(jié)果可見3條清晰的電泳條帶，從下往上分別是5S rRNA、18S rRNA和28S rRNA，且條帶亮度28S ∶ 18S≥1（圖1）。經(jīng)核酸濃度測定儀檢測，其D260 nm/D280 nm=1.96，濃度為780 mg/L，表明所提取的總RNA純度較高、完整性良好，適用于后續(xù)的cDNA制備。

2.2 豬Hsp40基因的克隆

以豬脾臟組織總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，Hsp40-F/Hsp40-R為引物，進行RT-PCR反應。反應結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物加入12 g/L瓊脂糖凝膠中檢測分析，結(jié)果見圖2。可見1條大小約為1 485 bp的DNA條帶，與預期結(jié)果一致。

2.3 豬Hsp40基因真核表達載體的構(gòu)建和鑒定

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pEGFP-Hsp40經(jīng)EcoRⅠ和 BamHⅠ 雙酶切，反應體系經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，見圖3?？梢?條大小約為4 700 bp載體片段和1條大小約 1 485 bp 的目的基因片段，與預測的片段大小基本一致，說明 pEGFP-Hsp40重組過表達載體構(gòu)建成功。為了進一步驗證其正確性，將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送北京華大基因公司測序并將測序結(jié)果與已報道的豬Hsp40基因序列進行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者之間的核苷酸序列同源性為99.8%，氨基酸序列同源性為99.4%，說明豬Hsp40基因克隆成功且構(gòu)建的pEGFP-Hsp40重組過表達載體成功，測序結(jié)果如圖4所示。

2.4 豬Hsp40基因RNA干擾載體的構(gòu)建和鑒定

以構(gòu)建好的豬Hsp40基因RNA干擾載體和pCDH-U6空載體為模板，U6-F/U6-R為引物，進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物置于12 g/L瓊脂糖凝膠電泳中檢測，結(jié)果見圖5、圖6?？梢奌sp40-sh1、Hsp40-sh2、Hsp40-sh3、Hsp40-sh4、Hsp40-sh5、Hsp40-shN和pCDH-U6干擾質(zhì)粒經(jīng)引物 U6-F/U6-R PCR擴增后分別得到大小約為359、359、359、359、359、359、300 bp的DNA條帶，表明各干擾序列均已被成功插入到pCDH-U6載體，即豬Hsp40基因各重組干擾載體構(gòu)建成功。

3 討論與結(jié)論

自dsRNA被發(fā)現(xiàn)以來，RNA干擾技術逐漸稱為研究基因功能的一種有效方法，其形成的發(fā)夾RNA通過堿基互補配對識別并降解與之高度保守的同源mRNA，從而使基因沉默[11-14]。近年來，由于RNA干擾技術具有高效、簡便和特異性強的特點，其已被廣泛應用于各種生物基因表達調(diào)控和功能基因的挖掘與鑒定等領域，尤其在動物、植物和微生物等的品質(zhì)改良中得到成功應用[15-17]。目前，盡管載體構(gòu)建的方法多種多樣，構(gòu)建策略也逐步完善，但傳統(tǒng)的“酶切-連接”方法因其操作簡便、成本低廉仍是應用最普遍的方法。本研究利用“酶切-連接”方法成功構(gòu)建了豬Hsp40基因的真核過表達載體和RNA干擾載體。

由于有關豬Hsp40蛋白生物學功能的研究相對較少，所以目前市場上或各大實驗室都還沒有該蛋白抗體的文獻報道，筆者在構(gòu)建其真核表達載體時，在豬Hsp40基因的C端添加了1個Flag標簽，使將來便于豬Hsp40蛋白的檢測。經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)，插入的Flag標簽序列與當初設計一致，沒有突變和移碼現(xiàn)象;與此同時，測得的豬Hsp40基因序列與GenBank已發(fā)表的豬Hsp40基因的序列同源性達99.8%，氨基酸同源性達99.4%，證明克隆獲得的豬Hsp40基因正確，可用于后續(xù)RNA干擾序列設計的靶基因。

將克隆獲得的豬Hsp40基因序列放入Thermo Fisher Scientific公司的shRNA在線設計軟件，筆者設計了其RNA干擾序列，且此干擾序列的設計是一次性合成的，既避免了原始的“酶切-連接”方法無一例外地需要多輪酶切連接反應，又盡可能地降低成本。由于設計出的每一條shRNA干擾序列引物只有59 bp，因此將合成后的各上、下游引物經(jīng)連續(xù)退火后直接與已經(jīng)雙酶切過的pCDH-U6干擾載體相連接。鑒于59 bp這個長度太短，市場上也很少有如此低標準的DNA marker可用，采用PCR方法和基因測序法對插入的各個shRNA干擾序列進行檢測驗證是可行的。由于筆者是根據(jù)pCDH-U6干擾載體的全基因序列在其多克隆位點的上游和下游分別設計引物（U6-F/U6-R）且擴增出來的基因片段大概為300 bp，因此一旦設計出的RNA干擾序列成功插入pCDH-U6干擾載體，那么再用引物（U6-F/U6-R）擴增構(gòu)建好的各重組干擾載體時就將會得到1條約360 bp DNA電泳條帶，由于在DNA凝膠電泳中360 bp顯著大于300 bp，因此可以根據(jù)PCR擴增條帶的高低大致判斷出所構(gòu)建的載體是否正確。圖5、圖6顯示，本研究構(gòu)建的豬Hsp40基因RAN干擾載體經(jīng)PCR鑒定是正確的，目前有關其遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因細胞株系建立的研究尚在進行中。本研究的載體構(gòu)建策略以其步驟簡便、效率可觀等特點可被廣泛運用于各生物表達載體及干擾載體的構(gòu)建當中。本研究載體構(gòu)建成功的目的是通過轉(zhuǎn)基因的方式將pEGFP-Hsp40和Hsp40-shRNA轉(zhuǎn)入PCV2宿主細胞中并篩選出其相對應的轉(zhuǎn)基因細胞株系，從而為研究Hsp40對PCV2復制的影響和機制奠定基礎。

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