張玉虹 孫喜斌 李立楠 康燕華 石克威 馬會(huì) 于治芳 陳江平

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科（河北張家口075000）

我國(guó)是子宮內(nèi)膜癌的高發(fā)地區(qū)，關(guān)于子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制及生物學(xué)行為特點(diǎn)的研究一直是腫瘤醫(yī)學(xué)的熱點(diǎn)［1］。根據(jù)中國(guó)癌癥中心最新發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，子宮內(nèi)膜癌已成為我國(guó)發(fā)病率最高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一［2］，但是由于其病灶多局限于子宮體，生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移速度較慢，多數(shù)早期患者預(yù)后良好，5年生存率超過(guò)70%［3］。因此大力開展子宮內(nèi)膜癌篩查工作，對(duì)于患者的早期確診以及個(gè)體化治療具有重要的臨床價(jià)值。但是目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于子宮內(nèi)膜癌的篩查方面尚未形成健全的篩查理念和成熟的篩查手段，在高危人群中進(jìn)行選擇性篩查更適合我國(guó)目前的國(guó)情［4］。除了肥胖、高血壓、糖尿病、多囊卵巢綜合癥等高危因素［5］以外，從子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制出發(fā)尋找有效的生物標(biāo)志分子也是醫(yī)學(xué)工作者研究工作的重點(diǎn)。2004年，CALIN 等［6］首次證實(shí)一半以上的miRNA 位于染色體脆性位點(diǎn)，并且與眾多已知的原癌基因和抑癌基因的表達(dá)密切相關(guān)。血清miRNAs 已成為新一代最有潛力的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物之一。KONG 等［7］和李萬(wàn)斌等［8］都曾通過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-195 可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，但是其作為子宮內(nèi)膜癌診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力尚未見有學(xué)者關(guān)注。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)miR-195 在子宮內(nèi)膜癌患者外周血和腫瘤組織中的表達(dá)水平，以及與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性，旨在證實(shí)血清miR-195 成為子宮內(nèi)膜癌早期診斷指標(biāo)和預(yù)后判斷分子的潛力。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2012年1月至2017年1月在河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院行手術(shù)切除獲取的子宮內(nèi)膜癌以及相配對(duì)的癌旁組織標(biāo)本120 例，術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)均為子宮內(nèi)膜癌。子宮內(nèi)膜癌組按照病理類型：內(nèi)膜樣腺癌61 例，漿液性癌34 例，透明細(xì)胞癌16 例，特殊病理類型9 例（黏液性腺癌4例、未分化癌3 例、鱗癌1 例、小細(xì)胞癌1 例）。同時(shí)采集所有患者術(shù)前外周血液樣本。患者年齡35 ～67 歲，平均（51.25 ± 8.36）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均為原發(fā)灶，首次切除；術(shù)前未接受過(guò)放療、化療、內(nèi)分泌治療等相關(guān)抗腫瘤治療；臨床病理資料完整；腫瘤組織與癌旁組織距離≥3 cm；手術(shù)方式為子宮內(nèi)膜癌分期手術(shù)（廣泛子宮切除術(shù)、雙附件切除及盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)）。排除其他婦科疾病、急慢性炎癥、免疫系統(tǒng)疾病者。另隨機(jī)選取同時(shí)期因子宮肌瘤在本院行手術(shù)切除，經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)是正常子宮內(nèi)膜的患者術(shù)前血液樣本60 例，患者年齡25 ～71 歲，平均（53.98 ± 9.44）歲；健康體檢合格者60 例，患者年齡24 ～78 歲，平均（53.47±10.21）歲。子宮肌瘤患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：首次子宮手術(shù)，臨床病理資料完整者。排除合并惡性腫瘤、急慢性炎癥、免疫系統(tǒng)疾病者。兩組患者的年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所有組織標(biāo)本均在離體后30 min 內(nèi)取得，經(jīng)生理鹽水清洗后迅速放入液氮中，2 d 內(nèi)移至-80 ℃冰箱中保存。本項(xiàng)研究已獲得河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：20120118-02）。在采集患者血液樣本或病理組織標(biāo)本前以書面形式告知受試對(duì)象或家屬研究的目的及風(fēng)險(xiǎn)，并由患者或家屬簽署書面知情同意書。

1.2 血漿和組織樣本總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCREDTA 抗凝管采集外周血4 mL，3 500 r/min離心10 min 至凍存管，-80 ℃保存?zhèn)溆?。取血液樣本采用miRNeasy Serum/Plasma Kit（大連TAKARA）提取血漿總RNA。另取組織標(biāo)本100 mg，采用TRIzol 試劑（美國(guó)SIGMA）提取組織總RNA。采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度（OD260nm/OD280nm在1.8 ～2.1 之間則提取的RNA 合格）。取2 μL RNA為模板，根據(jù)SuperScript RT kit（大連TAKARA）說(shuō)明書操作逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取50 μg cDNA 為模板，按照miScript SYBR Green PCR master Mix（大連TAKARA）說(shuō)明書進(jìn)行PCR。冰浴中配制20 μL PCR 反應(yīng)體系，PCR 擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置如下：95 ℃預(yù)變性10 min，36個(gè)循環(huán)（95 ℃變性15 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s），生成溶解曲線并分析。miR-195引 物 序 列（F：5′-GTATTCGCACTGGATACGACCGACC-3′，R：5′-TGCGCTAACAGTCTACAGCCA-3′）；內(nèi)參小分子U6 引物序列（F：5′-CAGCAAACC AACAATGCCGA-3′；R：5′-GATCTGCGACCACAC CATGA-3′）。以2-ΔΔCt表示miR-195 相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法IBM SPSS Statistics 17.0 軟件和Graphpad Prism6 軟件用于資料處理，miR-195 在血漿和組織中的表達(dá)量符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；子宮內(nèi)膜癌患者血漿和子宮肌瘤患者血漿miR-195 表達(dá)量以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；癌組織和癌旁組織miR-195 表達(dá)量的差異采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，并計(jì)算血漿miR-195 診斷子宮內(nèi)膜癌的曲線下面積（area under curve，AUC）。子宮內(nèi)膜患者血漿和取子宮內(nèi)膜癌患者血漿或癌組織miR-195 表達(dá)的中位數(shù)，＞中位數(shù)則為高表達(dá)，≤中位數(shù)則為低表達(dá)。血漿miR-195 表達(dá)與患者病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存分析用Kaplan-Meier 法并行Log-rank 檢驗(yàn)。采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析子宮內(nèi)膜癌患者總生存期的危險(xiǎn)因素。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜患者癌組織和癌旁組織miR-195 表達(dá)量比較癌組織中miR-195 表達(dá)量為（0.871 ±0.141），低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.996，P＜0.05）。子宮內(nèi)膜癌組織中miR-195 中位表達(dá)值為0.886（圖1）。

圖1 qRT-PCR 法檢測(cè)miR-195 在子宮內(nèi)膜癌組織和相配對(duì)的癌旁組織中的表達(dá)差異Fig.1 Difference of miR-195 expression in endometrial carcinoma tissues and adjacent tumor tissues

2.2 子宮內(nèi)膜患者、子宮肌瘤患者和健康者血漿miR-195 表達(dá)量比較子宮內(nèi)膜癌患者血漿miR-195表達(dá)量為（0.689±0.247），低于子宮肌瘤患者和健康者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 8.996，P＜0.05）。子宮內(nèi)膜癌患者血漿中miR-195 中位表達(dá)值為0.715（圖2）。

圖2 qRT-PCR 法檢測(cè)miR-195 在子宮內(nèi)膜癌患者、子宮肌瘤患者和健康者中的表達(dá)差異Fig.2 Difference of plasma miR-195 expression in endometrial carcinoma patients，hysteromyoma patients and healthy volunteers

2.3 ROC 曲線分析血漿miR-195 對(duì)子宮內(nèi)膜癌的診斷價(jià)值經(jīng)ROC 曲線分析，血漿miR-195 表達(dá)量對(duì)子宮內(nèi)膜癌診斷的AUC 為0.732（95%CI：0.611 ～0.853），敏感度和特異度分別為71.5%和69.0%，約登指數(shù)為0.405。見圖3。

圖3 血漿miR-195 表達(dá)對(duì)診斷子宮內(nèi)膜癌的ROC 曲線圖Fig.3 ROC curve analysis of the diagnostic potential of plasma miR-195 expression on endometrial carcinoma

2.4 子宮內(nèi)膜癌組織和血漿中miR-195 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系根據(jù)miR-195 在子宮內(nèi)膜癌組織和血漿中miR-195 的中位表達(dá)量，60 例患者呈高表達(dá)，60 例患者呈低表達(dá)。組織miR-195 表達(dá)量與腫瘤分化程度、FIGO 分期、發(fā)病類型、浸潤(rùn)深度有關(guān)（P＜0.05），但是與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病灶形態(tài)無(wú)關(guān)（P＞0.05）。血漿miR-195 表達(dá)量與FIGO 分期、發(fā)病類型、浸潤(rùn)深度有關(guān)（P＜0.05），但是與年齡、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病灶形態(tài)無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見表1。

2.5 子宮內(nèi)膜癌組織和血漿中miR-195 表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系對(duì)120 例患者進(jìn)行隨訪19 ～87 個(gè)月，平均生存時(shí)間為57 個(gè)月，29 例患者死亡，病死率為22.5%。繪制Kaplan-Meier 生存曲線，組織miR-195 高表達(dá)亞組死亡7 例，低于miR-195 低表達(dá)者（Log-rank χ2= 6.964，P= 0.008）。血漿miR-195 高表達(dá)亞組死亡9 例，低于miR-195 低表達(dá)者，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Log-rank χ2= 3.195，P= 0.047）。見圖4。

2.6 單因素和多因素COX 風(fēng)險(xiǎn)回歸分析子宮內(nèi)膜癌患者生存期的影響因素以患者術(shù)后死亡作為因變量（死亡賦值為1，生存賦值為0），經(jīng)單因素和多因素COX 風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析，F(xiàn)IGO 分期、發(fā)病類型、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血漿和組織miR-195 表達(dá)量與子宮內(nèi)膜癌患者總生存期相關(guān)，是影響子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)后生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素（P＜0.05）。見表2。

表1 子宮內(nèi)膜癌組織和血漿中miR-195 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Correlation between expression of miR-195 expression and clinicopathological parameters

圖4 子宮內(nèi)膜癌患者隨訪期間Kaplan-Meier 生存曲線Fig.4 Kaplan-Meier survival curve of endometrial carcinoma patients during followed up

3 討論

最新流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，子宮內(nèi)膜癌已經(jīng)成為我國(guó)發(fā)病率最高的女性生殖道惡性腫瘤，并呈年輕化趨勢(shì)，一方面與環(huán)境、飲食、社會(huì)壓力等因素有關(guān)，另一方面是因?yàn)槲覈?guó)近些年對(duì)子宮內(nèi)膜癌篩查工作的重視以及診斷技術(shù)不斷更新。但是由于篩查技術(shù)尚不成熟，而且缺乏大規(guī)模研究證實(shí)普遍篩查的經(jīng)濟(jì)學(xué)效益，因此，對(duì)于子宮內(nèi)膜癌的篩查理念尚未形成國(guó)際統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)［9］?？紤]到我國(guó)的基本國(guó)情，更傾向于對(duì)高危因素人群進(jìn)行選擇性篩查，例如子宮內(nèi)膜癌“三聯(lián)征”-肥胖、糖尿病、高血壓患者。MATSUO 等［10］、石婭婭等［11］都曾進(jìn)行Meta 分析，證實(shí)胰島素抵抗可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增生，是引發(fā)子宮內(nèi)膜癌的重要病理基礎(chǔ)，因此胰島素抵抗、代謝異常、合并卵巢綜合征等都是引發(fā)子宮內(nèi)膜癌的高危因素之一。此外，根據(jù)2015年美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)指南推薦，對(duì)于高齡、無(wú)抵抗雌激素治療、不孕不育等患者建議在專業(yè)醫(yī)師指導(dǎo)下進(jìn)行子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞學(xué)檢查［12］。但是僅依靠高危因素作為選擇性篩查的判斷標(biāo)準(zhǔn)具有極大的主觀性，尋找重復(fù)性高，對(duì)篩查、診斷、治療和預(yù)后有指導(dǎo)意義的分子生物學(xué)標(biāo)志物成為近年的探究熱點(diǎn)。但是由于子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜且尚不明確，為分子標(biāo)志物的尋找?guī)?lái)了一定的困難。

表2 影響子宮內(nèi)膜癌患者總生存期的單因素和多因素COX 風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析Tab.2 Univariate and multivarable COX regression analyses of actors predictive of poor overall survival in endometrial carcinoma patients

MiRNAs 與腫瘤的關(guān)系毋庸置疑，而且眾多研究已證實(shí)血miRNAs 是目前腫瘤診斷和預(yù)后方面最有潛力、且最有望用于臨床的生物學(xué)標(biāo)志分子。TSUKAMOTO 等［13］通過(guò)高通量miRNAs 芯片技術(shù)，篩選出在子宮內(nèi)膜癌患者血液和組織中呈差異性表達(dá)的miRNAs 譜，其中miR-195 表達(dá)明顯降低。此外，ZHENG 等［14］、LI 等［15］學(xué)者也證實(shí)miR-195 在非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌等發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中屬于抑癌基因，表達(dá)量下調(diào)。但是miR-195 在子宮內(nèi)膜癌中是否也屬于功能性基因尚未見有研究證實(shí)。

本研究基于我院前期建立的長(zhǎng)期隨訪數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇了符合納入標(biāo)準(zhǔn)的120 例子宮內(nèi)膜癌患者的組織標(biāo)本和血液樣本，并在研究前確定了患者或家屬的入組意愿。經(jīng)檢測(cè)，筆者發(fā)現(xiàn)miR-195在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)量明顯低于癌旁組織。另外，為了進(jìn)行對(duì)照性研究，筆者還采集了因子宮肌瘤在本院行全子宮切除術(shù)，經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)是正常子宮內(nèi)膜的患者術(shù)前血液樣本60 例以及健康體格檢查正常的志愿者血液樣本60 例，與子宮內(nèi)膜癌患者的血液樣本同時(shí)進(jìn)行對(duì)比研究。結(jié)果顯示，血漿miR-195 在子宮內(nèi)膜癌患者中的表達(dá)量明顯較子宮內(nèi)膜正常的兩組對(duì)照組血液樣本降低，并且經(jīng)ROC 分析，血漿miR-195 可用于子宮內(nèi)膜癌的診斷。

在此基礎(chǔ)上，筆者進(jìn)一步結(jié)合子宮內(nèi)膜癌患者的臨床病理資料來(lái)分析miR-195 表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。結(jié)果顯示組織miR-195 表達(dá)量與腫瘤分化程度、FIGO 分期、發(fā)病類型、浸潤(rùn)深度有關(guān)，而血漿miR-195 表達(dá)量與FIGO 分期、發(fā)病類型、浸潤(rùn)深度有關(guān)。20 世紀(jì)80年代，Bokhman 首次將子宮內(nèi)膜癌分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型為雌激素依賴性低級(jí)別子宮內(nèi)膜癌，Ⅱ型為非子宮內(nèi)膜樣癌（主要包括漿液性癌和透明細(xì)胞癌），與雌激素?zé)o關(guān)［16］。在本研究中，組織miR-195 在Ⅰ型患者中的表達(dá)量相對(duì)較Ⅱ型患者高，說(shuō)明miR-195 可能與雌激素調(diào)節(jié)或者雌激素受體的表達(dá)有關(guān)，具體的作用機(jī)制需要進(jìn)一步細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。但是血漿miR-195 未發(fā)現(xiàn)與患者發(fā)病類型有關(guān)，說(shuō)明組織和血漿miRNAs 的表達(dá)譜可能存在一定的差異性。相較于血漿miRNAs，組織miRNAs 與患者病理特征的關(guān)系更明顯，但是由于取材困難，用于臨床檢測(cè)有一定的困難，而血液樣本取材方便，操作簡(jiǎn)便，miRNAs 表達(dá)穩(wěn)定性良好，更適合用于臨床檢驗(yàn)［17］。而且筆者通過(guò)COX 風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析，組織miR-195 和血漿miR-195 都是影響子宮內(nèi)膜癌術(shù)后生存的獨(dú)立因素。

綜上所述，miR-195 在子宮內(nèi)膜癌患者血漿中的表達(dá)量較子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)和功能正常者明顯下調(diào)，且在癌組織中的表達(dá)量也明顯低于癌旁組織，可見miR-195 在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有類似抑癌基因的活性。而且在各種病理參數(shù)和預(yù)后研究中，血漿miR-195 與患者FIGO 分期、發(fā)病類型、浸潤(rùn)深度、術(shù)后生存期均密切相關(guān)，因此血漿miR-195 有望成為子宮內(nèi)膜癌輔助診斷和預(yù)后的敏感分子標(biāo)志物，但是若應(yīng)用于臨床，尚需更大樣本的數(shù)據(jù)分析。另外，目前關(guān)于miRNAs 在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制尚不明確，也是阻礙miRNAs 成為新的生物學(xué)診斷分子的關(guān)鍵問(wèn)題之一，因此更深入的研究miR-195 對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的調(diào)控作用和分子機(jī)制是下一步的工作重點(diǎn)之一。