董威 朱超華 王健 張海靜 李軍 趙振拴 李全海 張國平

河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院1骨科，2細(xì)胞治療中心（石家莊050031）

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是指股骨骨小梁、骨髓基質(zhì)細(xì)胞的壞死，最終導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)功能障礙，是一種頑固性、衰弱性的疾病，目前我國股骨頭壞死每年新發(fā)病例15 ～20 萬人，其常與骨疾病高病死率有關(guān)［1］。導(dǎo)致股骨頭壞死的原因主要包括骨折愈合不良負(fù)重行走之后和骨組織自行病變，如有飲酒嗜好或患有需要長時(shí)間服用糖皮質(zhì)激素的疾病，而有糖皮質(zhì)激素服用史是導(dǎo)致股骨頭壞死最常見的原因之一［2］。相關(guān)研究［3-4］表明，糖皮質(zhì)激素服用使患者骨內(nèi)基質(zhì)細(xì)胞損傷程度嚴(yán)重，微循環(huán)障礙、血流不通暢等因素均會(huì)導(dǎo)致缺血性股骨頭壞死。Bestrophins 3是陰離子通道成員［5］，通常用作氯化物參與調(diào)節(jié)細(xì)胞興奮性或細(xì)胞通道的調(diào)節(jié)，目前已經(jīng)鑒定出3 種同種型，即Bestrophin 1、Bestrophin 2 和Bestrophin 3［6］，有研究［7-8］表明糖皮質(zhì)激素所引起的骨代謝異常與Bestrophin 3 表達(dá)有關(guān)。目前Bestrophin 3在股骨頭壞死中的作用及機(jī)制鮮有報(bào)道，本文通過檢測不同標(biāo)本骨髓基質(zhì)細(xì)胞Bestrophin 3 表達(dá)水平揭示Bestrophin 3 在內(nèi)皮細(xì)胞損傷和皮質(zhì)類固醇誘導(dǎo)股骨頭壞死形成中的作用；且構(gòu)建了不同Bestrophin 3 表達(dá)水平的細(xì)胞株，從細(xì)胞水平評(píng)估了Bestrophin 3 表達(dá)量與細(xì)胞生存率的相關(guān)性。本研究為評(píng)估Bestrophin 3 是否可作為治療皮質(zhì)類固醇誘導(dǎo)骨頭壞死的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料股骨頭壞死患者納入標(biāo)準(zhǔn)：單側(cè)發(fā)??；觀察組為皮質(zhì)類固醇性股骨頭壞死患者；無煙酒嗜好；都為新鮮股骨頭壞死標(biāo)本（骨折后7 d 內(nèi)手術(shù)）。排除標(biāo)準(zhǔn)：非皮質(zhì)類固醇性股骨頭壞死患者；有飲酒史、吸煙史患者；有合并其他疾病的患者。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)選取2017年2月至2017年12月我院收治的創(chuàng)傷性骨折患者自愿捐贈(zèng)的骨組織50 例為對照組，皮質(zhì)類固醇性骨組織50例為觀察組。觀察組中男25 例，女25 例；對照組中男26 例，女24 例。兩組受試者一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有受試者對本研究知情同意，并均簽署知情同意書。

表1 觀察組和對照組受試者一般資料比較Tab.1 Comparison of general data between observation group and control group ±s

表1 觀察組和對照組受試者一般資料比較Tab.1 Comparison of general data between observation group and control group ±s

組別對照組觀察組P 值例數(shù)50 50男/女26/24 25/25 0.589平均年齡（歲）43.91±3.54 43.27±2.97 0.236平均體質(zhì)量（kg/m2）21.98±2.65 22.15±3.10 0.328平均病程（年）-3.98±1.21激素使用時(shí)間（月）-17.35±3.50

1.2 PCR 方法檢測受試者股骨頭中Bestrophin 3水平取兩組受試者的股骨頭骨組織標(biāo)本，抽取股骨頭頸部骨髓血4 ～6 mL，離心，純化，分離獲得骨髓基質(zhì)細(xì)胞。依據(jù)異丙醇沉淀法步驟提取骨髓基質(zhì)細(xì)胞中RNA，離心后加入25 μL 雙蒸水溶解提取RNA。按照2×SYBR real-time RT-PCR premixture 試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）先用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，再以cDNA 為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性50 s，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)和合成。通過使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）測定PCR 數(shù)據(jù)，獲得Ct 值，分析受試者Bestrophin 3 表達(dá)量利用相對定量的方法。

1.3 不同Bestrophin 3 表達(dá)水平細(xì)胞株的構(gòu)建分離純化獲得的人股骨頭骨微血管血管內(nèi)皮細(xì)胞為細(xì)胞株C1。利用基因敲除的手段對人股骨頭骨微血管血管內(nèi)皮細(xì)胞的Bestrophin 3 進(jìn)行基因敲除獲得細(xì)胞株C2，Western Blot 檢測Bestrophin 3 的表達(dá)水平；構(gòu)建過表達(dá)Bestrophin 3 基因細(xì)胞株C3 的方法是把人股骨頭骨微血管血管內(nèi)皮細(xì)胞的Bestrophin 3 基因連接到含有強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體上，Western Blot 檢測Bestrophin 3 的表達(dá)水平。

1.4 Western Blot 檢測細(xì)胞株Bestrophin 3 表達(dá)水平用胰蛋白酶消化培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中的細(xì)胞株，1 000 r/min，5 min 離心收集細(xì)胞。棄上清，加入細(xì)胞裂解液，離心收集蛋白質(zhì)。使用Bestrophin 3特異性一抗，二抗為標(biāo)記有HRP 的抗體，采用免疫印跡法測定各細(xì)胞株中Bestrophin 3 的表達(dá)，選擇β-actin 作為內(nèi)標(biāo)。

1.5 細(xì)胞水平檢測不同細(xì)胞株Bestrophin 3 對甲強(qiáng)龍誘導(dǎo)的股骨頭壞死的作用變化利用MTT 法檢測細(xì)胞生存率，具體操作如下：（1）用培養(yǎng)基把細(xì)胞濃度調(diào)整至1 × 105個(gè)/mL，接種于96 孔板，每孔200 μL，置于5%二氧化碳、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；（2）從培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)板，用Hank′s 液洗滌細(xì)胞2 次，每孔加入不同濃度的甲強(qiáng)龍細(xì)胞培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），每孔100 μL，于5%二氧化碳、37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h；（3）取出培養(yǎng)板后，每個(gè)培養(yǎng)孔加入5 mg/mL 的MTT 溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；（4）倒掉孔中培養(yǎng)液，每孔加入MTT 裂解液100 μL，吹打混勻待完全溶解后，在波長490 nm處測OD值。相同方法檢測甲強(qiáng)龍對人股骨頭骨微血管血管內(nèi)皮細(xì)胞的時(shí)間梯度損害（2、4、6、12、24 h）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布資料以表示，相關(guān)分析性分析采用Spearman 進(jìn)行，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者股骨頭Bestrophin 3 水平比較觀察組Bestrophin 3 表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 兩組受試者Bestrophin 3 水平比較Fig.1 Comparison of Bestrophin 3 levels between between observation group and control group

2.2 不同細(xì)胞株Bestrophin 3 的表達(dá)水平比較Western Blot 檢測各細(xì)胞株Bestrophin 3 蛋白表達(dá)，結(jié)果見圖2，細(xì)胞株C3（3.82 ± 0.95）的Bestrophin 3蛋白表達(dá)水平明顯高于C1（2.57 ± 1.02），且C1 高于C2（0.97±0.26），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 不同細(xì)胞株Bestrophin 3 表達(dá)水平比較Fig.2 Comparison of expression levels of Bestrophin 3 in the different cell lines

2.3 甲強(qiáng)龍誘導(dǎo)人股骨頭骨微血管血管內(nèi)皮細(xì)胞損害MTT 法檢測可以反映存活細(xì)胞的數(shù)目，計(jì)算出甲強(qiáng)龍對人股骨頭骨微血管血管內(nèi)皮細(xì)胞殺傷后的細(xì)胞生存率。

2.3.1 MTT 方法比較不同濃度甲強(qiáng)龍對人股骨頭骨微血管血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用結(jié)果顯示：不同濃度甲強(qiáng)龍對人股骨頭骨微血管血管內(nèi)皮細(xì)胞毒性之間存在著量效關(guān)系（P＜0.05）。當(dāng)甲強(qiáng)龍濃度升高至0.02 mg/mL 時(shí)，各細(xì)胞株間細(xì)胞生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），濃度達(dá)10 mg/mL 時(shí)，細(xì)胞生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3。

圖3 MTT 檢測細(xì)胞生存率（甲強(qiáng)龍濃度曲線）Fig.3 MTT detection of cell survival rate（Methylprednisolone sodium succinate for injection concentration curve）

2.3.2 MTT 法比較甲強(qiáng)龍與人股骨頭骨微血管血管內(nèi)皮細(xì)胞不同孵育時(shí)間對細(xì)胞損害程度結(jié)果顯示：甲強(qiáng)龍對人股骨頭骨微血管血管內(nèi)皮細(xì)胞毒性作用隨著時(shí)間的延長而增強(qiáng)，兩者存在時(shí)效關(guān)系（P＜0.05）。當(dāng)作用時(shí)間達(dá)2 h 時(shí)，各細(xì)胞株間細(xì)胞生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），當(dāng)作用時(shí)間達(dá)6 h 時(shí)，細(xì)胞生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。同時(shí)可知，甲強(qiáng)龍毒性主要在6 h 作用時(shí)間內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞與甲強(qiáng)龍孵育6 h 后細(xì)胞存活率只有35%，孵時(shí)間超過12 h 后細(xì)胞存活率只有20%，再延長孵育時(shí)間毒性作用不明顯。當(dāng)細(xì)胞株中高表達(dá)Bestrophin 3 基因后，細(xì)胞生存率也相應(yīng)增加。見圖4。

圖4 MTT 檢測細(xì)胞生存率（時(shí)間殺傷曲線）Fig.4 MTT detection of cell survival rate（Time kill curve）

2.4 Bestrophin 3 表達(dá)水平與細(xì)胞生存率相關(guān)性分析經(jīng)Spearman 相關(guān)分析顯示，細(xì)胞生存率與Bestrophin 3表達(dá)水平呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.836，P＜0.01）。

3 討論

股骨頭壞死是血液供應(yīng)不足導(dǎo)致骨細(xì)胞死亡的結(jié)果，股骨頭壞死的不均一性愈合是罕見的，并且取決于股骨頭的受累程度而發(fā)生可變量的塌陷［8］。在成人中，股骨頭重塑力不是無限的，當(dāng)股骨頭壞死到一定程度自身就不能修復(fù)到原本的狀態(tài)，如股骨頭壞死嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致骨塌陷，最終引起股骨頭變形，這種變化有不可逆性［9-10］。目前我國股骨頭壞死患者高達(dá)500 ～750 萬，且呈逐年增加的趨勢［11］。股骨頭壞死根據(jù)發(fā)病機(jī)制不同分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性兩大類［12］，目前臨床上相對較多的是非創(chuàng)傷性股骨頭，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，主要與骨內(nèi)微循環(huán)障礙和細(xì)胞凋亡相關(guān)，導(dǎo)致非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的因素包括激素、酒精、吸煙等，最重要的致病因素被認(rèn)為是激素和酒精［13-14］。本研究集中在激素引起的股骨頭壞死，有激素長使用史的患者體內(nèi)脂代謝紊亂，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的凝血因子，凝血因子達(dá)到一定量后容易引發(fā)局部組織出現(xiàn)高凝現(xiàn)象或血管內(nèi)凝血，進(jìn)而引發(fā)缺血性股骨頭壞死［15-16］。此外也有研究［17］發(fā)現(xiàn)，激素類藥物能夠引發(fā)血脂水平升高，導(dǎo)致血管內(nèi)脂肪性栓塞，是靜脈回流受阻，進(jìn)而導(dǎo)致股骨頭壞死。

Bestrophin 3 是bestrophin 氯離子通道家族的成員，其基因編碼血管平滑肌細(xì)胞中cGMP 敏感的鈣離子激活的氯離子通道［18］。 此外，因?yàn)锽estrophin 3 轉(zhuǎn)錄本在心臟組織中有高表達(dá)，所以假設(shè)Bestrophin 3 可能在心血管功能中起重要作用［19］。有研究［20］發(fā)現(xiàn)，Bestrophin 3 蛋白在心房和心室肌細(xì)胞以及肌纖維膜中均有分布，這一假設(shè)也得到了支持。董威等［2］研究發(fā)現(xiàn)股骨頭壞死患者骨組織Bestrophin 3 mRNA 相對含量高于對照組。本研究通過分析就診于本院患者的股骨頭骨組織Bestrophin 3 相對含量，也發(fā)現(xiàn)觀察組Bestrophin 3含量高于對照組，研究結(jié)果與［2］相符。董威等［9］通過構(gòu)建股骨頭壞死小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，模型組的Bestrophin 3 相對表達(dá)量顯著高于空白組，且模型組丙二醛含量顯著增加，超氧化物歧化酶含量顯著減少，這兩個(gè)因子均與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，因此Bestrophin 3 與小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激具有相關(guān)性。

目前對Bestrophin 3 研究主要集中于對氫化可的松誘導(dǎo)的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用以及在新生小鼠腦缺血缺氧時(shí)的保護(hù)作用［21-22］，其在股骨頭壞死中是否有保護(hù)作用尚未可知。本研究室之前研究結(jié)果表明Bestrophin 3 在股骨頭壞死小鼠中表達(dá)升高，但其作用以及作用機(jī)制尚不明確［2，9］。本研究構(gòu)建了Bestrophin 3 不同表達(dá)量的細(xì)胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞株細(xì)胞生存率不同，Bestrophin 3 表達(dá)量升高細(xì)胞生存率相應(yīng)提高，此研究結(jié)果表明Bestrophin 3 在內(nèi)皮細(xì)胞損傷和皮質(zhì)類固醇誘導(dǎo)股骨頭壞死形成中的具有作用。為評(píng)估Bestrophin 3 是否可作為治療皮質(zhì)類固醇誘導(dǎo)骨頭壞死的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。細(xì)胞生存率隨著接觸甲強(qiáng)龍時(shí)間延長其水平降低，Bestrophin 3的高表達(dá)可以緩解該降低水平，表明Bestrophin 3具有保護(hù)細(xì)胞的功能，能夠緩解股骨頭壞死中細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，Bestrophin3 在股骨頭壞死患者骨組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀況，高表達(dá)Bestrophin 3 對骨細(xì)胞具有保護(hù)作用，本研究可以為皮質(zhì)類固醇誘導(dǎo)骨頭壞死治療的研究提供新思路。