謝智彬 謝光宇 馮耀寧 黃恒前 翁旋任 付偉金

1廣西醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院泌尿外科（南寧530021）；2廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科（南寧530021）

膀胱癌是泌尿系腫瘤中常見的惡性腫瘤［1-2］，在我國的發(fā)病率逐年上升，其發(fā)生、發(fā)展主要受環(huán)境及遺傳相關(guān)因素的影響，主要分為非浸潤型膀胱癌和浸潤型膀胱癌［3］，非浸潤型膀胱癌主要以經(jīng)尿道膀胱腫物切除術(shù)為主，術(shù)后灌注化療等綜合治療［4-5］。因膀胱癌具有易復發(fā)、易轉(zhuǎn)移特性，約30%非浸潤型膀胱癌患者復發(fā)進展為浸潤型膀胱癌，而根治性膀胱切除是浸潤型膀胱癌治療的金標準，術(shù)后生存質(zhì)量以及預后欠佳［6］。隨著分子技術(shù)的快速發(fā)展，分子靶向治療腫瘤已成為目前研究熱點，因此，尋找能準確預測腫瘤的發(fā)生以及監(jiān)測腫瘤進展的分子靶點具有重要意義。

吡咯啉-5-羧酸還原酶1（pyrroline-5-carboxylate reductase 1，PYCR1）是一種參與細胞代謝的活性酶，是脯氨酸生物合成中的最終酶［7-8］。早期主要研究發(fā)現(xiàn)人類PYCR1 的突變與皮膚松弛、早衰以及抗氧化應(yīng)激活、線粒體調(diào)節(jié)密切相關(guān)［9-11］。然而對于其與腫瘤的關(guān)系報道相對較少，近年來隨著對PYCR1 研究的深入，發(fā)現(xiàn)其在多種實體腫瘤中異常表達［8，12-13］，但在膀胱癌中的表達情況目前尚未明確，故本研究探討PYCR1 在膀胱癌患者中的表達情況及其臨床意義，為臨床治療及未來精準靶向藥物治療膀胱癌提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2015年10月至2018年1月廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的初診膀胱癌患者43 例，其中男30 例，女13 例，平均年齡64.3（45～78）歲，低級別14 例，高級別29 例。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或生物等治療，術(shù)后經(jīng)病理檢查證實為膀胱癌，術(shù)中均留取膀胱癌組織及癌旁組織。所有標本均在離體后30 min 內(nèi)放置-80 ℃冰箱中保存。下載癌癥基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//cancergenome.nih.gov/）中膀胱癌表達PYCR1 相關(guān)的RNA-Seq 數(shù)據(jù)和匹配的臨床數(shù)據(jù)資料，共入426 例膀胱癌樣本，其中癌與癌旁組織配對19 例。所有標本均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意，并與患者家屬簽署相關(guān)知情同意書。

1.2 膀胱癌和癌旁組織中PYCR1 mRNA 表達檢測采用實時熒光定量PCR 技術(shù)（real time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測PYCR1 mRNA 表達。具體步驟：采用mRNA 提取試劑盒（Sigma 公司）按照說明書步驟在低溫環(huán)境下提取標本總mRNA，采用分光光度儀的OD260/OD280評估所提取的mRNA 的質(zhì)量，并計算mRNA 濃度。根據(jù)mRNA 濃度按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara 公司）要求稀釋配比后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后采用RT-PCR擴增膀胱癌及癌旁組織中PYCR1 mRNA 表達。PYCR1 引物及內(nèi)參β-actin 均由武漢金開瑞生物工程有限公司設(shè)計并合成。PYCR1 引物上游5′-GAAGATGGGGGTGAAGTTGA - 3′ ，下 游5′ - CTCAATGGAGCTGATGGTGA-3′；β-actin 引物上游5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預變性2 min、94 ℃變性20 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。所有試驗均獨立重復3 次。

1.3 膀胱癌及癌旁組織中PYCR1蛋白檢測采用SP 免疫組化染色法。兔抗人PYCR1 購自Abcam公司，免疫組化SP 試劑盒和DAB 顯色試劑盒均購買于北京中杉金橋公司。收集膀胱癌及癌旁手術(shù)標本經(jīng)10%甲醛固定24 ～48 h，常規(guī)石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片，采用0.01 mmol/L 枸櫞酸緩沖液抗原修復，室溫自然冷卻，加入內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑10 min，PBS 沖洗3 次，分別加入單抗，4 ℃恒溫箱孵育過夜，PBS 液沖洗3 次，加二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸顯色。最后由兩位高年資病理科醫(yī)生行雙盲在顯微鏡下對結(jié)果進行判斷，PYCR1 陽性染色定位于細胞質(zhì)，呈棕黃色細顆粒狀。按染色的強度的深淺評分：0 分無染色；1 分淡黃色；2 分棕黃色；3 分棕褐色。按陽性細胞百分比評分：1 分：1%～10%；2 分：10%～50%；3 分：50%～80%；4 分：＞80%，接著按染色強弱與陽性細胞的乘積積分，≥4 分為陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 23.0 軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)以（）表示，計量資料組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PYCR1 在TCGA 數(shù)據(jù)庫中膀胱癌的表達情況結(jié)果發(fā)現(xiàn)TCGA 數(shù)據(jù)庫中總體407 例膀胱癌樣本中的癌和19 例癌旁組織PYCR1 的mRNA 表達水平分別為（9.984±1.614）和（7.529±1.087），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），同時配對的19 對膀胱癌患者和癌旁組織的PYCR1 的mRNA 表達水平分別為（10.166±1.073）和（7.529±1.087），同樣差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。而PYCR1 的mRNA表達水平與TCGA 總樣本的臨床病理特征的關(guān)系詳見表1，發(fā)現(xiàn)PYCR1 高表達與年齡（χ2= 9.064，P=0.003）、病理分級（χ2=18.133，P＜0.001）、N 分期（χ2= 13.439，P＜0.001）、T 分期（χ2= 4.681，P=0.03）和M 分期（χ2= 5.569，P= 0.018）、臨床分期（χ2= 14.303，P＜0.001）有關(guān)，但與性別不相關(guān)（P＞0.05）。見表1。

2.2 膀胱癌和癌旁組織中PYCR1 mRNA 表達比較本研究收集的膀胱癌與癌旁組織中PYCR1 mRNA 表達量分別為（5.81 ± 1.46）、（4.93 ± 1.37），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），同時發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者的PYCR1 mRNA 表達的與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），認為有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期的膀胱癌患者的PYCR1 mRNA 表達量較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和早期的膀胱癌患者高，但與患者的性別、年齡、病理分級、遠處轉(zhuǎn)移均未發(fā)現(xiàn)有關(guān)聯(lián)，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表1 TCGA 數(shù)據(jù)庫中膀胱癌樣本的PYCR1 mRNA 表達水平與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between PYCR1 mRNA expression and clinicopathological features in bladder cancer samples from TCGA database 例

2.3 膀胱癌和癌旁組織中PYCR1 蛋白表達情況免疫組化結(jié)果示，PYCR1 陽性染色主要定位在細胞核內(nèi)，呈現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒狀。見圖1～4。PYCR1 蛋白在膀胱癌組織中表達陽性率為58.14%，在癌旁組織中表達的陽性率為16.28%（χ2=16.125，P＜0.001），說明膀胱癌組織中PYCR1蛋白的表達明顯高于癌旁組織。分析PYCR1 的表達與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者癌組織PYCR1 蛋白表達的升高與臨床分期（χ2= 4.341，P= 0.037）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2= 4.838，P= 0.028）相關(guān)，PYCR1 蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膀胱癌中陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膀胱癌（90.9%vs.46.9%，P＜0.05）；PYCR1 蛋白在臨床分期T2～T4期膀胱癌中的陽性率高于Ta～T1 期膀胱癌的陽性率（83.3%vs.48.4%，P＜0.05），但與患者的性別、年齡、病理分級、遠處轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P＞0.05）。見表2。

圖1 膀胱癌組織的HE 染色圖（×100）Fig.1 HE staining of bladder cancer tissue（×100）

圖2 癌旁膀胱組織的HE 染色圖（×100）Fig.2 HE staining of paracancerous bladder tissue（×100）

圖3 PYCR1 在膀胱癌組織的表達（×100）Fig.3 Expression of PYCR1 in bladder cancer tissues（×100）

圖4 PYCR1 在癌旁膀胱組織的表達（×100）Fig.4 Expression of PYCR1 in adjacent bladder tissues（×100）

表2 PYCR1 的表達量與膀胱癌患者臨床病理特征關(guān)系Tab.2 Relationship between expression of PYCR1 and clinicopathological features of bladder cancer patients

3 討論

膀胱癌是泌尿系疾病中常見的腫瘤，具有發(fā)病率高、臨床治療療效及患者預后較差的特性，但其發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移是一個復雜的過程，其中可能涉及許多腫瘤相關(guān)因子的參與和調(diào)控。因此，如何進一步探究膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，尋找可靠的生物標志物以及有效的分子治療靶點對提高膀胱癌患者診斷及預后意義重要。

PYCR1 是一種代謝相關(guān)的酶，在脯氨酸生物合成中起關(guān)鍵作用，是脯氨酸生物合成中的最終酶，其作用是催化NAD（P）H 依賴性還原吡咯啉-5-羧酸酯生成脯氨酸。早期主要研究發(fā)現(xiàn)人類PYCR1 的突變與皮膚松弛、早衰以及抗氧化應(yīng)激活、線粒體調(diào)節(jié)密切相關(guān)。而對于其與腫瘤的關(guān)系目前報道相對較少，研究表明PYCR1 與肺癌、前列腺癌、乳腺癌等發(fā)生、進展存在密切聯(lián)系。CAI 等［12］研究發(fā)現(xiàn)PYCR1 在非小細胞肺癌中呈現(xiàn)高表達，且與患者的預后密切相關(guān)，證實高表達PYCR1 的肺癌患者相關(guān)性總生存時間明顯差于PYCR1 低表達患者，通過沉默PYCR1 后，肺癌細胞株的增殖能力明顯受到抑制，并誘導肺癌細胞凋亡，認為PYCR1 可作為抑制肺癌細胞增殖的新型治療靶標。DING 等［8］研究發(fā)現(xiàn)PYCR1 在mRNA和蛋白水平與乳腺癌患者腫瘤的大小、臨床分級以及分型密切相關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)高表達PYCR1 的患者的生存預后明顯較低表達的患者差，使用RNA干擾抑制PYCR1 表達后，乳腺癌細胞的生長及侵襲能力明顯下降，同時增強了多柔比星在乳腺癌細胞株中的細胞毒性，認為PYCR1 可作為乳腺癌治療的潛在靶點。在泌尿系腫瘤中情況，ZENG等［13］研究發(fā)現(xiàn)PYCR1 在前列腺癌組織中呈高表達，并其表達量與前列腺癌患者的年齡、Gleason評分相關(guān)，通過慢病毒介導敲除前列腺癌細胞株DU145、PC-3、LNCap 后，癌細胞的增殖及集落形成能力明顯下降，其原因可能是增強細胞凋亡和G2/M 期阻滯，同時發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)蛋白顯著增加，認為PYCR1可能作為治療前列腺癌良好的潛在靶點。然而PYCR1 在膀胱癌的表達情況目前尚未明確，故本研究通過結(jié)合TCGA 數(shù)據(jù)庫及收集43 例膀胱癌患者的癌組織和癌旁組織中mRNA 和蛋白水平表達情況，探討PYCR1 在膀胱癌患者的表達情況以及與患者臨床特征間的關(guān)系，為臨床治療及未來精準靶向藥物治療膀胱癌患者提供進一步的基礎(chǔ)研究依據(jù)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，首先通過TCGA 數(shù)據(jù)庫分析表明膀胱癌組織中PYCR1 的mRNA 表達水平顯著高于癌旁組織，并且發(fā)現(xiàn)PYCR1 高表達與年齡、病理分級、N 分期、T 分期和M 分期、臨床分期密切相關(guān)。同時本研究通過qRT-PCR 技術(shù)證實膀胱癌組織中PYCR1 mRNA 的相對表達量明顯高于癌旁組織，與TCGA 數(shù)據(jù)庫結(jié)果相一致，免疫組化實驗還發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中的PYCR1 蛋白的陽性率顯著高于癌旁組織，說明膀胱癌組織中PYCR1 基因mRNA 和蛋白的表達水平顯著升高。同時，通過分析PYCR1 的表達與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者癌組織PYCR1 蛋白表達的升高與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，認為PYCR1 蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膀胱癌中陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膀胱癌；PYCR1 蛋白在臨床分期T2-T4 期膀胱癌中的陽性率高于Ta～T1 期膀胱癌的陽性率，但與患者的性別、年齡、病理分級、遠處轉(zhuǎn)移均未發(fā)現(xiàn)有關(guān)聯(lián)，與PYCR1 在mRNA 表達水平得出的結(jié)論相一致。但其確切的機制目前尚未明確，故筆者擬建立過表達及沉默PYCR1 的膀胱癌細胞株模型，探討其參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展的機制研究。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PYCR1 在膀胱癌中呈現(xiàn)高表達，并與膀胱癌患者的臨床病理特征具有一定的相關(guān)性，提示PYCR1 可能參與了膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展，為膀胱癌的基因靶向治療提供一個新的思路。