符傳藝 趙杰 符媚媚 蔡仁端 黃良珍 陳建南 趙建農(nóng)

1海南省人民醫(yī)院神經(jīng)外科（?？?70311）；2中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)外科（長沙410008）

癲癇發(fā)作是各類腦血管疾病發(fā)生腦缺血后常 見的臨床表現(xiàn)及嚴(yán)重并發(fā)癥，是影響預(yù)后的重要危險因素［1-2］。隨著監(jiān)護手段提高，發(fā)現(xiàn)腦缺血后癲癇發(fā)作主要以非驚厥性癲癇為主要形式［3］，多項前期研究［4-6］表明缺血后腦組織的炎性反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡是癲癇發(fā)作的重要病理機制之一，凋亡神經(jīng)元分解產(chǎn)物進一步誘發(fā)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等炎癥因子表達(dá)，炎癥反應(yīng)加重，形成惡性循環(huán)。因此，抑制炎癥的發(fā)展是控制癲癇發(fā)作治療途徑之一，乳脂肪球表皮生長因子8 蛋白（milk fat globule epidermal growth factor 8，MFG-E8）作為一種抑炎因子，廣泛存在于腦組織中，由小膠質(zhì)細(xì)胞分泌，能夠抑制TNF-α、IL-6 等炎癥因子表達(dá)，介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬凋亡神經(jīng)元［7-8］。但尚未有研究MFG-E8 與腦缺血后非驚厥性癲癇發(fā)作的關(guān)系。本研究通過建立缺血后非驚厥性癲癇發(fā)作的大鼠模型，靜脈注射重組人乳脂肪球表皮生長因子8 蛋白（recombinant human milk fat globule epidermal growth factor 8，rhMFG-E8）進行治療，探討其在缺血后非驚厥性癲癇發(fā)作中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物健康雄性Wistar 大鼠，體質(zhì)量（180 ± 20）g，由中南大學(xué)實驗動物中心提供。大鼠飼養(yǎng)于SPF 級清潔動物實驗室，室內(nèi)相對濕度40% ～60%，溫度控制在22 ～25 ℃，12 h/12 h日夜光照條件下飼養(yǎng)。所有實驗操作過程均符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》。

1.1.2 實驗試劑rhMFG-E8（廣州麗因生物科技有限公司）；TUNEL 染色相關(guān)試劑（廣州麗因生物科技有限公司），TNF-α（美國R＆D 公司）和IL-6 ELISA 試劑盒（美國R＆D 公司）等。

1.1.3 主要實驗儀器腦電圖監(jiān)測儀（深圳邁瑞公司），激光多普勒流量計（Transonic，美國），分光光度計（BioTek，美國），蛋白濃度測定儀（Thermo，芬蘭），酶標(biāo)儀（Thermo，芬蘭），蛋白轉(zhuǎn)膜儀（Leica，德國），離心機（Hettich，美國），電子天平（上海天平儀廠），熒光顯微鏡（Olympus，日本）等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠缺血性癲癇模型制作及動物分組將36 只Wistar 大鼠以戊巴比妥（按體質(zhì)量45 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉滿意后，于大鼠頭雙側(cè)額頂部（分別于前囟前1 mm 及后4 mm，中線旁開3.5 mm）對稱性切開頭皮、鉆4 個孔至皮層，植入4 個不銹鋼電極，在橫竇與人字縫之間置一參考電極，所有電極均采用連接器固定于頭部，備腦電圖監(jiān)測用，電極獲取腦電波后即傳輸至多參數(shù)顯示儀和數(shù)字分析系統(tǒng)。常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周，剔除頭部切口愈合不良者并遞補至36 只后隨機分為3 組，假性手術(shù)組，僅做頸部皮膚切口并暴露頸部動脈后縫合；缺血性癲癇組和rhMFG-E8 組采用改良Longa 線栓法建立急性腦梗死大鼠模型，大鼠按同樣的方法麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺上，采用頸部正中切口，依次暴露并分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈及其分支、頸總動脈分叉處，以血管夾暫時夾閉阻斷頸外動脈及其分支上頜動脈及舌動脈。于頸總動脈分叉處近心端做一切口，將前端涂有石蠟的3-0 單股尼龍縫線插入頸總動脈并順血流方向，經(jīng)頸內(nèi)動脈入顱，插入深度約20 mm，至大腦前動脈近端，完全阻斷大腦中動脈起始部的血供，注意需短暫夾閉翼腭動脈以防誤插。手術(shù)過程采用激光多普勒流量計進行皮質(zhì)腦血流量監(jiān)測，皮質(zhì)腦血流量下降70%以上以及術(shù)后1 h 監(jiān)測到癲癇波者則定義為造模成功，缺血性癲癇組給予1 mL 生理鹽水靜脈注射。rhMFG-E8 組在模型建立成功后，立即按160 μg/kg 靜脈注射rhMFG-E8 溶液1 mL［9］。所有大鼠均在術(shù)前1 h 開始監(jiān)測癲癇波，術(shù)后24 h斷頭取腦組織。缺血性癲癇組和rhMFG-E8 組大鼠模型制作過程中切口愈合不良者、皮質(zhì)腦血流量下降不足70%者以及術(shù)后1 h 未監(jiān)測到癲癇波者等均給予剔除，并依次遞補。

1.2.2 指標(biāo)測定

1.2.2.1 癲癇波監(jiān)測所有實驗動物在缺血前1 h開始進行腦電圖監(jiān)測，直至缺血后24 h。腦電波由電極獲取并實時傳輸至多參數(shù)顯示儀和數(shù)字分析系統(tǒng)。確定腦缺血后非驚厥性癲癇波型按WILLIAMS 等［10］制定的評判標(biāo)準(zhǔn)：（1）腦電圖波幅大于背景波幅；（2）持續(xù)多棘波，或頻率大于1 Hz的棘波或棘慢復(fù)合波；（3）出現(xiàn)（1）和（2）波型持續(xù)10 s 以上。監(jiān)測到癲癇波的頻率即為該大鼠的實際非驚厥性癲癇發(fā)作次數(shù)。

1.2.2.2 采用TUNEL 染色法檢測各組紋狀體區(qū)組織中神經(jīng)元凋亡TUNEL 染色檢測凋亡的方法按照試劑盒說明書進行。選取各組大鼠的紋狀體腦組織切片，依次用以下試劑洗滌：二甲苯4 min 2 次；無水乙醇3 min 2 次；95%乙醇3 min；75%乙醇3 min；PBS 5 min。取出組織切片，晾干，向組織上方加一滴蛋白酶K溶液，于室溫條件孵育15 min，孵育完成后給予PBS 洗滌2 min，反復(fù)4 次。繼而于10%中性甲醛中固定10 min，反復(fù)PBS 洗滌5 min 共3 次。然后將組織切片置于乙醇乙酸混合液中浸泡約7 min，PBS 洗滌5 min，反復(fù)3 次。于10%中性甲醛中再次固定10 min。自然晾干，向組織上方加一滴3%的過氧化氫，觀察10 min 后PBS洗滌。自然晾干，在組織上方滴加一滴TdT 酶緩沖液，5 min 后PBS 反復(fù)洗滌2 次。37 ℃下預(yù)熱終止液，再把組織切片放置到終止液中20 min，取出后PBS 反復(fù)洗滌2 次。輕輕擦拭組織切片，加一滴過氧化物酶標(biāo)記的抗體在組織上方，20 min 后用PBS 洗滌5 min，反復(fù)4 次。輕輕擦拭組織切片，向組織上方加DAB 顯色液，根據(jù)顯色程度確定顯色時間，一般控制在30 min 以內(nèi)。完成顯色后置其于無水乙醇2 min，二甲苯2 min，在通風(fēng)櫥中自然晾干，用熒光封片試劑封片。最后于2 h 內(nèi)在熒光顯微鏡下觀察組織切片。陽性細(xì)胞胞核呈綠色，每張切片隨機選取區(qū)域拍照5 張，細(xì)胞數(shù)取平均值，以便后續(xù)對凋亡細(xì)胞進行統(tǒng)計，凋亡指數(shù)（apoptotic index）=陽性細(xì)胞/總細(xì)胞×100%。

1.2.2.3 ELISA 法檢測各組大鼠紋狀體中TNF-α、IL-6 表達(dá)提取大鼠的紋狀體腦組織準(zhǔn)確稱取，加9 倍的4 ℃生理鹽水，經(jīng)研磨攪拌制成10%的組織勻漿，完畢后于冰上靜置30 min 以便蛋白充分裂解，將勻漿液于4℃，12 000 r/min 離心15 min×2次，取上清液。按照ELISA 試劑盒說明進行后面實驗操作步驟。將勻漿上清液標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋5 倍備用，從密封袋中取出板條，將稀釋好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品以100 μL/孔加入，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃孵育120 min。洗板4 次，在濾紙上印干。將生物素化抗體工作液以100 μL/孔加入，將反應(yīng)孔用封板膠紙封住，37.0 ℃孵育60 min。洗板4 次，在濾紙上印干。將酶結(jié)合工作液以100 μL/孔加入，封板膠紙密封反應(yīng)孔，37 ℃孵育30 min。洗板4 次，在濾紙上印干。將顯色劑以100 μL/孔加入，37 ℃條件下孵育20 ～30 min。每孔加入50 μL 終止液，將溶液混勻，5 min 內(nèi)測量波長在450 nm 處的吸光度OD值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組樣本均數(shù)的比較如方差不齊時采用Welch 方差分析，組間兩兩比較采用Games-Howell檢驗。如多組樣本均數(shù)的比較方差齊時，則應(yīng)用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey 檢驗；設(shè)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rhMFG-E8 可明顯減輕缺血性癲癇大鼠的癲癇發(fā)作頻率所有入選實驗的大鼠自缺血前1 h開始進行腦電圖監(jiān)測，直至缺血后24 h，并將腦電圖結(jié)果描記。實驗過程發(fā)現(xiàn)，3 組大鼠癲癇發(fā)作頻率總體有差異（WelchF= 676.91，P＜0.05）。3 組兩兩比較結(jié)果：缺血性癲癇組大鼠癲癇發(fā)作的頻率［（15.6±3.6）次/24 h］較假性手術(shù)組［（0.4±0.5）次/24 h］明顯升高（P＜0.05）；而rhMFG-E8 組癲癇發(fā)作的頻率［（7.8 ± 1.9）次/24 h］較缺血性癲癇組［（15.6±3.6）次/24 h］明顯降低（P＜0.05），rhMFGE8 明顯降低大鼠癲癇的發(fā)作頻率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 rhMFG-E8 有效減輕缺血性癲癇大鼠紋狀體組織的細(xì)胞凋亡采用TUNEL 染色檢測了各組大鼠紋狀體組織中神經(jīng)元凋亡水平（圖中類圓形綠色小體即為凋亡神經(jīng)元）。結(jié)果顯示3 組神經(jīng)元凋亡水平總體有顯著差異（WelchF= 676.91，P＜0.05）。假手術(shù)組大鼠紋狀體中幾乎無凋亡神經(jīng)元（圖1）；缺血性癲癇組大鼠紋狀體中神經(jīng)元凋亡［（15.28±1.95）%］，較假性手術(shù)組［（0.40±0.17）%］明顯增加（P＜0.05）。（圖2）；而經(jīng)rhMFG-E8 處理后，大鼠紋狀體中神經(jīng)元凋亡［（9.65 ± 1.17）%］較缺血組降低（圖3），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 假手術(shù)組紋狀體凋亡神經(jīng)元（×200）Fig.1 Apoptotic neurons in striatum of the sham operation group（×200）

圖2 缺血性癲癇組大鼠紋狀體凋亡神經(jīng)元（×200）Fig.2 Apoptotic neurons in striatum of postischemic seizure group（×200）

2.3 rhMFG-E8 有效抑制缺血性癲癇大鼠紋狀體組織中TNF-α和IL-6 表達(dá)結(jié)果顯示3 組TNF-α、IL-6 表達(dá)總體均有差異（F= 309.22，P＜0.05；F=290.87，P＜0.05）。與假手術(shù)組（195.0±29.5，120.3± 25.7）比較，缺血性癲癇組中紋狀體中炎癥因子TNF-α、IL-6 表達(dá)（590.4 ± 43.0，480.3 ± 49.8）增加（P＜0.05）；rhMFG-E8 可抑制TNF-α、IL-6（354.6 ±43.5，279.8 ± 29.9）表達(dá)，與缺血性癲癇組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。

圖3 rhMFG-E8 組紋狀體凋亡神經(jīng)元（×200）Fig.3 Apoptotic neurons in striatum of the rhMFG-E8 group（×200）

圖4 各組大鼠紋狀體中炎癥因子TNF-α、IL-6 表達(dá)Fig.4 Expression of TNF-αand IL-6 in striatum of rats in each group

3 討論

癲癇是腦梗死常見并發(fā)癥，尤其是非驚厥性癲癇，國內(nèi)外多項基礎(chǔ)及臨床研究發(fā)現(xiàn)其是急性腦梗死的發(fā)生率非常高的并發(fā)癥，高達(dá)7% ～20%［11-13］。缺血后癲癇發(fā)作以顳葉、額頂葉皮質(zhì)、紋狀體及邊緣系統(tǒng)等部位腦梗死多見，紋狀體損害癲癇發(fā)作常表現(xiàn)為發(fā)作性肌強直伴疼痛、出汗、恐懼感，但不伴意識喪失［14-15］。本研究結(jié)果顯示假手術(shù)組基本無炎癥反應(yīng)和癲癇發(fā)作，相對假手術(shù)組，缺血性癲癇組缺血后24 h 內(nèi)非驚厥性癲癇發(fā)作頻率明顯上升，與之相應(yīng)是紋狀體腦組織炎性反應(yīng)加劇，TNF-α、IL-6 表達(dá)顯著上升，而rhMFGE8 組TNF-α、IL-6 表達(dá)明顯下降，炎癥發(fā)應(yīng)減輕，隨之癲癇發(fā)作頻率下降，揭示癲癇與炎癥呈正相關(guān)，該結(jié)論也得到相關(guān)文獻(xiàn)［16］支持。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一道重要免疫防御系統(tǒng)，腦組織缺血后以小膠質(zhì)細(xì)胞活化為特征的炎癥是神經(jīng)組織炎性損害的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活并迅速釋放炎癥因子，在大腦組織和周圍血液中的濃度升高，早期研究證明腦組織缺血后的炎性反應(yīng)加重導(dǎo)致神經(jīng)元損傷及死亡，大腦電生理網(wǎng)絡(luò)完整性受破壞，誘發(fā)癲癇發(fā)作［17］。本研究結(jié)果顯示在各組之間，隨著炎癥反應(yīng)加重，大鼠紋狀體急性缺血后神經(jīng)元凋亡數(shù)目顯著增加，提示該病理變化與非驚厥性癲癇發(fā)作相關(guān)，與文獻(xiàn)［18-19］報告相符。所以，腦缺血早期通過抑制炎癥發(fā)生以及避免其級聯(lián)反應(yīng)，減少神經(jīng)元凋亡的途徑，可以避免癲癇發(fā)作及加重。因此，研究及尋找抑炎因子及機制是防治癲癇的重要研究方向之一。

MFG-E8 是一種分泌性糖蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要由小膠質(zhì)細(xì)胞分泌，在急性腦缺血梗死炎癥反應(yīng)過程中，其能夠識別凋亡細(xì)胞表面標(biāo)志物絲氨酸磷脂，介導(dǎo)吞噬細(xì)胞及時清除凋亡細(xì)胞，避免凋亡細(xì)胞分解產(chǎn)物引發(fā)炎癥因子產(chǎn)生，激發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致腦組織繼發(fā)損傷［20］。MFG-E8能夠減輕急性腦梗死后炎癥反應(yīng)，從而減少神經(jīng)元凋亡，但至今尚未有MFG-E8 與癲癇發(fā)作具體機制的研究。

本研究結(jié)果顯示rhMFG-E8 具有強烈的抑炎作用，相對于缺血癲癇組，rhMFG-E8 組炎癥因子TNF-α、IL-6 表達(dá)顯著下降，同時發(fā)現(xiàn)紋狀體區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)量明顯減少，伴隨之是癲癇發(fā)作頻率顯著下降。所以，本研究證實大鼠急性腦缺血后rhMFG-E8 抑制炎性因子TNF-α 和IL-6 分泌，減輕急性腦缺血后炎癥反應(yīng)，減少神經(jīng)元凋亡，從而減輕或緩解癲癇發(fā)作。

通過以上實驗結(jié)果，筆者證實rhMFG-E8 通過減少或拮抗炎癥反應(yīng)因子，從而阻止神經(jīng)元凋亡，減輕腦組織損害，減少癲癇發(fā)作頻率。但本研究觀察時間為24 h 以內(nèi)，雖然在建模成功后便立即靜脈給rhMFG-E8 治療有陽性的結(jié)果，但遠(yuǎn)期療效尚未清楚，與轉(zhuǎn)化臨床運用之間尚有不少距離，且因受實驗條件及經(jīng)費限制，也存在缺乏rhMFG-E8拮抗劑組比較等不足之處，在后續(xù)的補充實驗研究中需要解決這些問題。