劉冰 楊智承 袁芳

廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院（廣州510006）

肺癌類型包括非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），其中NSCLC 占80% ～85%［1］。針對NSCLC，由于肺癌患者遺傳背景的復(fù)雜性，以及現(xiàn)有靶向藥物耐藥等問題，導(dǎo)致目前治療效果仍然不佳［2］。血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）在大多數(shù)細(xì)胞中均有表達(dá)，特別是在間質(zhì)細(xì)胞高度表達(dá)和活躍，如成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。PDGF/PDGFR 信號通路可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和遷移，然而其抑制劑的抗NSCLC 作用研究仍然匱乏［3］。本研究在非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞上，探討PDGFR 抑制劑CP-868596 的細(xì)胞毒性作用及其分子機制，以期為其臨床使用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料實驗中所用的培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）均購自Gibco 公司；CP-868596購自selleck 公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 購Invitrogen 公司；兔抗人Nrf2 一抗、磷酸化Akt 一抗、內(nèi)參β-tubulin 購自Abcam 公司以及羊抗兔二抗購自Proteintech 公司；DCFH-DA、MTT 均購于Sigma 公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)A549 細(xì)胞和BEAS-2B 細(xì)胞購于ATCC 細(xì)胞庫。將A549 細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并將BEAS-2B 細(xì)胞在含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)在37 ℃，含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.3 MTT 實驗將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96 孔板中，待24 h 貼壁后依次加入濃度梯度為0～200 nmol/L 的CP-868596，持續(xù)孵育48 h ，每孔加入MTT 溶液（5 mg/mL）10 μL 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清，每孔加150 μL 的DMSO 溶液，待完全溶解后，于570 nm 處檢測OD值。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測各組收取CP-868596 濃度為0、10、20 、40 nmol/L 處理24 h 后的A549 細(xì)胞，使用在4 ℃冰箱預(yù)冷后的PBS 洗滌，重復(fù)2 次，將洗滌后的細(xì)胞重懸于250 μL 的結(jié)合緩沖液中。在5 mL 的流式管中加入100 μL 的細(xì)胞懸液，在管中加入Annexin-V FITC 5 μL，之后避光繼續(xù)加入20 μg/mL 的碘化丙錠溶液10 μL?；旌虾螅谑覝叵卤芄夥跤?5 min，向管中加PBS 400 μL，并通過流式細(xì)胞儀分析。

1.5 Caspase-Glo 3/7（Promega）檢測A549 細(xì)胞以種于96 孔板中培養(yǎng)箱孵育過夜。用CP-868596預(yù)處理48 h 后，加入Caspase-Glo 3/7 試劑，在37 ℃恒溫孵育90 min，使用熒光分光光度計測得熒光素酶發(fā)光強度。

1.6 免疫熒光法檢測ROS 的含量生長融合至

70%左右的96 孔板內(nèi)的A549 細(xì)胞經(jīng)不同濃度CP-868596 或繼續(xù)處理24 h 后，加入10 μmol/L DCFH-DA，37 ℃避光孵育30 min。PBS 洗滌細(xì)胞2 次，并將樣品置于熒光酶標(biāo)儀下檢測熒光強度，488 nm 激發(fā)和525 nm 發(fā)射。

1.7 免疫印跡將A549 細(xì)胞接種于6 孔板中待24 h 后用CP-868596 48 h 后收集細(xì)胞，并向每孔中加入100 μL 的蛋白裂解液。BCA 試劑盒用于測定和定量蛋白，并計算總蛋白質(zhì)的量。然后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂牛奶配置TBST，在室溫下封閉1 h，并加入稀釋好的Nrf2 一抗（1∶1 000），在4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜。用TBST 洗膜3 次，每次5 min，加4 mL 稀釋的羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST 洗膜，方法同上。然后加入化學(xué)發(fā)光液，在X 線片暗室進(jìn)行顯影及定影操作。

1.8 qRT-PCR 檢測Nrf2 mRNA 的表達(dá)使用

Trizol 試劑從A459 細(xì)胞中提取總RNA，然后合成cDNA。實時定量RT-RCT 使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO，日本，QPK-201）。使用ΔΔCT 法擴增基因，并使用GAPDH 作為內(nèi)參。用于實時定量PCR 引物見表1。

1.9 ARE-螢光素酶報告基因測定使用雙熒光素酶報告基因檢測法（Dual-Luciferase Reporter Assay System）檢測樣品對Nrf2-ARE 信號傳導(dǎo)途徑活性的影響。將處于對數(shù)生長期的A549 細(xì)胞接種于24 孔板中待24 h 細(xì)胞貼壁后，用Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染含有熒光素酶報告基因的ARE-Luc 和pTK -Renilla 內(nèi)參質(zhì)粒，繼續(xù)培養(yǎng)18 h 后用藥物孵育2 h，除去上清液，并將細(xì)胞在室溫下振蕩15 min，通過離心收集上清液，并使用雙報告基因檢測試劑盒測定雙熒光素酶活力。

表1 引物序列表Tab.1 Primers sequences

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法采用JMP 7.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，組間比較行獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CP-868596 抑制A549 細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡用不同濃度梯度的CP-868596 作用于A549細(xì)胞和BEAS2B 細(xì)胞48 h，測得CP-868596 抑制A549 的IC50為54.94 nmol/L，抑 制BEAS2B 細(xì)胞IC50為166.14 nmol/L（圖1A）。圖1B 和1C 表明通過流式細(xì)胞術(shù)和caspase3/7 活性檢測法，發(fā)現(xiàn)在CP-868596 作用24 h 后，可導(dǎo)致A549 細(xì)胞凋亡。

2.2 CP-868596 升高A549 內(nèi)ROS 的含量CP-868596 可呈劑量依賴性升高A549 細(xì)胞內(nèi)的ROS含量（圖2A）。結(jié)果表明在給予ROS 清除劑NAC后（25 μmol/L），可逆轉(zhuǎn)CP-868596 對A549 的凋亡誘導(dǎo)作用（圖2B、C）。

2.3 CP-868596降低A549細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)與空白對照組比較，用CP-868596 處理的A549 細(xì)胞中Nrf2 蛋白表達(dá)降低（圖3A）。CP-868596 影響A549 細(xì)胞Nrf2 的mRNA 水平（圖3B）。同樣CP-868596 也可抑制A549 細(xì)胞中ARE-Luc 的表達(dá)（圖3C）。此外，CP-868596 減低Nrf2 靶基因HO-1和HQO-1 的mRNA 表達(dá)水平（圖3D、E）。這些結(jié)果表明CP-868596 引起A549 細(xì)胞凋亡和ROS 升高是通過抑制Nrf2 而實現(xiàn)的。

2.4 tBHQ（Nrf2 激活劑）可逆轉(zhuǎn)CP-868596 對A549 細(xì)胞凋亡和ROS 水平的影響通過ARE 檢測，發(fā)現(xiàn)tBHQ 呈劑量依賴性增加A549 中Nrf2 的活性（圖4A）。tBHQ（20 μmol/L）可逆轉(zhuǎn)CP-868596對A549細(xì)胞凋亡和ROS的影響（圖4B～4D）。

圖1 CP-868596 對A549 細(xì)胞增殖及凋亡的影響Fig.1 The effects of CP-868596 on proliferation and apoptosis of A549 cells

圖2 CP-868596 升高A549 細(xì)胞內(nèi)ROS 的含量導(dǎo)致細(xì)胞凋亡Fig.2 CP-868596 induced A549 cell apoptosis via stimulation of ROS production

2.5 CP-868596 通過PI3K/Akt 通路抑制Nrf2 的表達(dá)CP-868596 可抑制A549 細(xì)胞中磷酸化Akt的表達(dá)水平（圖5A）。在LY294002（PI3K/Akt 通路抑制劑）作用A549 細(xì)胞后，Nrf2 和p-Akt 的表達(dá)減低；然而，在用LY294002 抑制PI3K/Akt 通路基礎(chǔ)上加藥CP-868596，不能進(jìn)一步減低Nrf2 和p-Akt的表達(dá)水平（圖5B）。

3 討論

PDGF/PDGFR 的過表達(dá)或PDGFR 的激活突變導(dǎo)致的異常PDGFR 信號傳導(dǎo)已被證實在多種腫瘤的發(fā)生中起關(guān)鍵作用［4］。在非小細(xì)胞肺癌中，PDGFR 由基質(zhì)細(xì)胞以及一部分癌細(xì)胞大量表達(dá)［5］。以往的實驗室研究和臨床試驗已經(jīng)證實CP-868596 對胃腸道間質(zhì)瘤和人急性髓系白血病有較好的治療作用［6-7］。本研究中發(fā)現(xiàn)，CP-868596可誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡呈劑量依賴性，此外，對正常肺上皮細(xì)胞BEAS2B 毒性較低（IC50值較高），該結(jié)果表明PDGFR 抑制劑CP-868596 對NSCLC 細(xì)胞有較好的選擇性殺傷作用。

圖3 CP-868596 抑制A549 細(xì)胞中Nrf2 的表達(dá)Fig.3 CP-868596 inhibited Nrf2 expression in A549 cells

圖4 tBHQ 可逆轉(zhuǎn)CP-868596 對A549 細(xì)胞凋亡和ROS 水平的影響Fig.4 CP-868596 inhibited Nrf2 expression through suppression of PI3K/Akt pathway

圖5 CP-868596 通過PI3K/Akt 通路抑制Nrf2 的表達(dá)Fig.5 CP-868596 inhibited Nrf2 expression through suppression of PI3K/Akt pathway

研究表明ROS 的過量產(chǎn)生介導(dǎo)了許多藥物誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、壞死和自噬等效應(yīng)［8-9］。因此，本研究首先檢測CP-868596 是否可誘導(dǎo)NSCLC 細(xì)胞內(nèi)ROS 生成。結(jié)果表明CP-868596 可使A549 細(xì)胞內(nèi)ROS 的含量隨著藥物濃度的增加而明顯升高。此外，使用抗氧化劑NAC 消除ROS 可顯著拮抗CP-868596 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡的作用。上述結(jié)果表明CP-868596 促進(jìn)A549 細(xì)胞中ROS 大量生成，介導(dǎo)了其誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡作用。

圖6 本研究機制通路圖Fig.6 The mechanical graphic abstract of this study

Nrf2 是細(xì)胞中調(diào)控抗氧化反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，可減低細(xì)胞內(nèi)ROS 水平以維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡［10］。PDGFRβ屬于受體酪氨酸激酶（RTKs）家族成員，RTKs中許多成員，如表皮生長因子受體，通過激活Nrf2 調(diào)控癌細(xì)胞中ROS 產(chǎn)生［11］。因此，筆者推測抑制PDGFR 可能通過抑制Nrf2 升高細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。本研究發(fā)現(xiàn)CP-868596 可顯著減低Nrf2 的表達(dá)（包括mRNA 和蛋白水平），Nrf2 激動劑tBHQ 可逆轉(zhuǎn)CP-868596 對細(xì)胞內(nèi)ROS 的激發(fā)作用；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Nrf2 激動劑tBHQ 可拮抗CP-868596 的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)。上述結(jié)果表明CP-868596 通過抑制Nrf2 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)從而上調(diào)癌細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。

PI3K/Akt信號是公認(rèn)的PDGFR下游效應(yīng)子［12］，且有研究表明PI3K/Akt 信號激活可誘導(dǎo)細(xì)胞中Nrf2 表達(dá)并增強其活性［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)CP-868596 抑制A549 細(xì)胞中PI3K/Akt 通路活性；PI3K/Akt 通路抑制劑LY294002 可抑制Nrf2 表達(dá)，產(chǎn)生類似CP-868596 的作用，此外，當(dāng)用LY294002 抑制PI3K/Akt 通路后，CP-868596 不再產(chǎn)生額外抑制Nrf2 表達(dá)作用。這些結(jié)果充分表明了CP-868596通過抑制A549 細(xì)胞中PI3K/Akt 通路抑制Nrf2表達(dá)。

綜上，本研究表明，PDGFR 抑制劑CP-868596可通過抑制A549 細(xì)胞中PI3K/Akt/Nrf2 軸，使得抗氧化信號受阻，進(jìn)而導(dǎo)致ROS 在A549 細(xì)胞中大量累積，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡（圖6）。因此，CP-868596可能是潛在有效的抗NSCLC 的輔助治療藥物。